訶子乙醇提取物聯(lián)合卡培他濱對小鼠4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤的抑瘤效果評價＊

馬婭楠，馬生萍，陳建春，李 念，殷祎隆

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

乳腺癌是當(dāng)今女性發(fā)病率最高的惡性病之一。有研究發(fā)現(xiàn)多藥聯(lián)合對于三陰性乳腺癌的治療有明顯的抑制作用[1]。訶子是一種中藥，在蒙藥和藏藥中應(yīng)用甚廣，其活性成分通過抑制血管生成,增強(qiáng)組織免疫力來發(fā)揮抗腫瘤的作用[2]；卡培他濱[3]在臨床上用于控制晚期乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，因其為氟尿嘧啶類衍生物，經(jīng)羧基酯酶、胞苷脫氨酶及胸腺嘧啶磷酸化酶（TP）等一系列酶促反應(yīng)可轉(zhuǎn)化為5-Fu，抑制DNA合成，還可減少患者胃腸道不適等不良反應(yīng)。推測訶子聯(lián)合卡培他濱對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有更好的抑制作用。本研究的目的是觀察訶子乙醇提取物聯(lián)合卡培他濱對4T1乳腺癌的抑瘤效果，并通過檢測小鼠外周血清中的TNF-α、INF-γ、IL-4和VEGF的含量，來探討其是否對4T1乳腺癌有抑制作用，以便為臨床治療乳腺癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗藥物

訶子果實(shí)5 kg（購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)）。

1.1.2 實(shí)驗動物

75只健康雌性BALB/c小鼠，6～8周齡（購自甘肅省新熙盛生物科技公司）。

1.1.3 試劑與儀器

4T1乳腺癌細(xì)胞株（購自甘肅惠博斯實(shí)驗器材經(jīng)營部）；胎牛血清、1 640培養(yǎng)基及小鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）、小鼠白介素-4（IL-4）、大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、小鼠γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒均購自萊德公司；酶標(biāo)儀（美國Bio Rad公司，型號iMark）、恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏設(shè)備公司，型號DNP-9022）；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf，型號5424R）、搖床（美國SCILOGEX儀器，型號SK-O180-E）、超低溫冰箱（中科美菱低溫科技公司，型號DW-HL528）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

將復(fù)蘇的4T1乳腺癌細(xì)胞（來源于BALB/c小鼠的癌變?nèi)橄俳M織）在10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察其貼壁情況并進(jìn)行傳代，到第4代后取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞用于實(shí)驗，待細(xì)胞數(shù)量增長并貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶壁時，用胰酶消化液將貼壁的腫瘤細(xì)胞消化下來并且反復(fù)吹洗使其成為細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液進(jìn)行顯微鏡下計數(shù)，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個/mL。

1.2.2 藥物制備

訶子果實(shí)粉碎后用60%乙醇加熱回流提取3次,合并提取液,濃縮后加入等量的95%乙醇攪勻,靜置過夜后濾過，濾渣用60%乙醇洗滌,洗液與濾液合并,減壓回收乙醇,干燥得提取物2.5 kg備用。

1.2.3 建立小鼠4T1乳腺癌模型及模型評定

將75只實(shí)驗小鼠隨機(jī)分成5組，即空白組、模型組、卡培他濱組、訶子組和聯(lián)合組（卡培他濱+訶子），每組15只；每天給予等量的食物與水，相隔2 d更換墊料，同時對鼠籠以及盛水器具進(jìn)行消毒。待小鼠完全適應(yīng)環(huán)境后按照預(yù)實(shí)驗的步驟取配制好的乳腺癌4T1細(xì)胞懸液，以0.2 mL/只的量注射于各組小鼠左側(cè)腋部皮下。一般在5～7 d后，荷瘤大小為5 mm×5 mm×5 mm即代表建模成功，并開始測量及記錄其長短徑和體重。在建模成功后開始對小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃時間固定在每天早晨9：00—11:00，連續(xù)灌胃5 d后休息2 d。灌胃方法為空白組和模型組：生理鹽水；卡培他濱組：50 mg·（kg·d）-1的卡培他濱片+生理鹽水懸濁液；訶子組以每只小鼠50 mg·（kg·d）-1/只/的訶子乙醇提取物與生理鹽水懸濁液灌胃；聯(lián)合組：50 mg·（kg·d）-1的卡培他濱片+訶子乙醇提取物+生理鹽水懸濁液，各組給藥劑量均為1 mL/只。每日觀察小鼠生活飲食和精神狀況，密切關(guān)注接種部位的瘤結(jié)節(jié)生長情況，腋下觸及質(zhì)軟小結(jié)節(jié)。于灌胃后第21 d先行眼球取血，之后脫頸處死小鼠，取脾、胸腺備用。

1.2.4 檢測指標(biāo)和方法

①瘤體體積與抑瘤率 荷瘤生長情況分別用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）、短徑（b），根據(jù)公式（V=ab2/2）計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線[4-5]。將剝離瘤體去除脂肪及血污后稱重，計算抑瘤率（%）[（模型組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量）/模型組瘤質(zhì)量×100%]。

②胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù) 將分離出的胸腺、脾臟稱重，計算胸腺指數(shù)（mg/g）［胸腺質(zhì)量（mg）×10/小鼠體質(zhì)量（g）］和脾臟指數(shù)（mg/g）［脾臟質(zhì)量（mg）×10/小鼠體質(zhì)量（g）］［6］。

③腫瘤組織HE染色切片 將小鼠腫瘤組織和臟器標(biāo)本裝入盛有4%多聚甲醛固定液標(biāo)本瓶中保存，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋再切成4 μm的薄片，切片用二甲苯脫蠟，再用各級的乙醇水洗，把水吸干后，用蘇木精-伊紅（HE）染色[7]后在顯微鏡下觀察。

④腫瘤肺轉(zhuǎn)移鑒定 將所有小鼠的同一側(cè)肺葉，在顯微鏡下觀察肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)并計數(shù)；小鼠肺組織放入提前配制好的固定液中固定，再經(jīng)脫水、透明、浸蠟等過程后待其形成蠟塊進(jìn)行切片、制片，HE染色鏡檢評價模型[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗的方法進(jìn)行分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示,四組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

由于在實(shí)驗后期各組均有1～2只小鼠的死亡，為各組數(shù)據(jù)的均衡，實(shí)驗小鼠的樣本統(tǒng)一為每組13只。

2.1 藥物干預(yù)對各組小鼠腫瘤體積、瘤重和抑瘤率的影響

由表1可見，4組小鼠瘤體體積（P<0.01）以及各組瘤重（P<0.05）間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；各藥物干預(yù)組小鼠的瘤體體積均小于模型組（P均<0.01），訶子組與聯(lián)合組瘤重小于模型組（P<0.05），卡培他濱組小鼠瘤重小于模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各藥物干預(yù)組瘤體體積、瘤重的比較（）

表1 各藥物干預(yù)組瘤體體積、瘤重的比較（）

與模型組相比**P＜0.01

各組在荷瘤早期腫瘤生長速度都很快，在荷瘤中期訶子組和聯(lián)合組的生長速度逐漸減慢且相近，在荷瘤末期卡培他濱組和訶子組生長速度相當(dāng)，相比較而言聯(lián)合組速度最慢。

基于模型組的數(shù)據(jù)，各藥物干預(yù)組的抑瘤率分別是卡培他濱組（3.42%）＜訶子組（18.58%）＜聯(lián)合組（28.05%）。

2.2 藥物干預(yù)對各組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)及肺結(jié)節(jié)的影響

由表2可得，各組小鼠胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;各組小鼠脾臟指數(shù)和肺結(jié)節(jié)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;脾臟指數(shù)：與模型組相比，空白組脾臟指數(shù)最低（P<0.01），藥物干預(yù)后脾臟指數(shù)相比陰性組均有降低，組間兩兩比較訶子組的脾臟指數(shù)小于卡培他濱組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；肺結(jié)節(jié)：與模型組相比，聯(lián)合組肺結(jié)節(jié)個數(shù)減少，差異顯著（P<0.01）。

表2 各藥物干預(yù)組胸腺、脾臟指數(shù)及肺結(jié)節(jié)變化情況(）

表2 各藥物干預(yù)組胸腺、脾臟指數(shù)及肺結(jié)節(jié)變化情況(）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與卡培他濱組相比，△△P＜0.01

2.3 各組小鼠TNF-a、IL-4、VEGF、INF-γ的變化情況

由表3可得，各組TNF-a、IL-4、VEGF、INF-γ的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P均<0.01）；與空白組相比，模型組TNF-a、IL-4、VEGF均升高而INF-γ的表達(dá)降低具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；各藥物干預(yù)組與陰性組相比：聯(lián)合組、訶子組TNF-a降低具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；聯(lián)合組、卡培他濱組IL-4降低，差異顯著（P<0.01）；各藥物干預(yù)組VEGF均降低（P<0.05），其中聯(lián)合組與訶子組降低明顯（P<0.01）；卡培他濱組INF-γ升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，中國已經(jīng)進(jìn)入到了“互聯(lián)網(wǎng)+”時代，網(wǎng)絡(luò)在各個行業(yè)中得以普及，給傳統(tǒng)的發(fā)展帶來了巨大的變革、機(jī)遇以及挑戰(zhàn)。將企業(yè)財務(wù)管理創(chuàng)新與網(wǎng)絡(luò)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合是當(dāng)前財務(wù)管理方面發(fā)展的重要方向，本文結(jié)合“互聯(lián)網(wǎng)＋”在企業(yè)財務(wù)管理中的影響與策略展開了探究。首先對企業(yè)財務(wù)管理理念進(jìn)行分析，并對其進(jìn)行改變，結(jié)合“互聯(lián)網(wǎng)＋”的特點(diǎn)，積極對先進(jìn)的企業(yè)財務(wù)管理平臺進(jìn)行引進(jìn)，以達(dá)到提升綜合工作效率的目的，減少人力方面的耗費(fèi)，并通過創(chuàng)新的模式來通入其日常的工作，提升數(shù)據(jù)一體化程度。

表3 各組INF-γ、IL-4、TNF-α、VEGF在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中的表達(dá)(）

表3 各組INF-γ、IL-4、TNF-α、VEGF在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中的表達(dá)(）

注：與空白組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 各藥物干預(yù)組的組織病理學(xué)結(jié)果

2.4.1 三陰性乳腺癌肺轉(zhuǎn)移標(biāo)本的HE切片

模型組：肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目較多、直徑較大，且易見侵犯細(xì)支氣管及侵犯血管壁的現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞異型性明顯、有核分裂相。

訶子組：與陰性組比肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目及轉(zhuǎn)移灶的直徑未見明顯差別，腫瘤細(xì)胞異型性明顯、核分裂相常見，可見到侵犯血管壁的現(xiàn)象。和陰性組比轉(zhuǎn)移瘤的癌巢內(nèi)浸潤的炎細(xì)胞明顯增多。

卡培他濱組：與陰性組比癌細(xì)胞出現(xiàn)變性，可見到較大面積的壞死，局部侵犯血管及細(xì)支氣管的癌細(xì)胞變性較為明顯，且有大量的炎細(xì)胞浸潤。

聯(lián)合組：與各單獨(dú)用藥組相比癌巢的體積變小，且局部癌細(xì)胞變性的面積與卡培他濱組相比增大。

2.4.2 三陰性乳腺癌種植瘤標(biāo)本的HE切片

模型組：瘤細(xì)胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相常見。

訶子組：大部分區(qū)域瘤細(xì)胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相常見，少部分區(qū)域可見點(diǎn)狀壞死，及炎細(xì)胞浸潤。

卡培他濱組：瘤細(xì)胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相較少，局部組織出現(xiàn)片狀壞死。

聯(lián)合組：瘤細(xì)胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相常見，未見明顯壞死，與陰性組比較無明顯差別。

3 討論

乳腺癌作為女性群體高發(fā)病，近年來的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢。乳腺癌的發(fā)生與多種因素相關(guān)[11]。在各種因素的作用下，乳腺癌被分為四型，其中，以Ⅳ型惡性程度最高，因雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、原癌基因（Her-2）均為陰性，因此也叫三陰性乳腺癌。三陰性乳腺癌因其高轉(zhuǎn)移率、高致死率及預(yù)后差[12]等特征，受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。4T1乳腺癌細(xì)胞作為一種普遍被應(yīng)用于三陰性乳腺癌模型建立的細(xì)胞，常規(guī)應(yīng)用于BALB/C小鼠[13-17]。

本實(shí)驗研究結(jié)果表明：訶子、卡培他濱兩藥聯(lián)合均對荷瘤小鼠瘤體體積及瘤重的增長具有抑制作用，聯(lián)合組的瘤體體積和瘤重差異最明顯，在生長曲線上的表現(xiàn)也印證了這一點(diǎn)；脾臟指數(shù)：荷瘤后各組脾臟指數(shù)均升高，各藥物干預(yù)組脾臟指數(shù)的升高低于模型組，說明荷瘤后小鼠免疫亢進(jìn)，藥物干預(yù)對機(jī)體的過度免疫反應(yīng)具有緩解作用；肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移：聯(lián)合組肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的降低具有明顯差異，兩藥聯(lián)合應(yīng)用有降低肺部轉(zhuǎn)移率的功效。在病理切片上聯(lián)合組轉(zhuǎn)移癌巢平均體積也最小，證明訶子聯(lián)合卡培他濱降低肺部轉(zhuǎn)移率同時對已轉(zhuǎn)移組織的癌細(xì)胞生長也具有一定的抑制功效。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，抗原已致敏的CD4+Th細(xì)胞，在局部微環(huán)境如細(xì)胞因子的作用下可選擇性分化為Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞通過其主要執(zhí)行細(xì)胞因子INF-γ介導(dǎo)細(xì)胞免疫的發(fā)生；Th2細(xì)胞主要執(zhí)行細(xì)胞因子IL-4介導(dǎo)體液免疫的發(fā)生[18]；TNF-α作為一種重要的促炎介質(zhì)，可以增加中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤；VEGF會增加血管的生成，可以通過血管生成促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。

以上結(jié)果說明4T1乳腺癌可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)TNF-a、IL-4、VEGF大量表達(dá)引起荷瘤小鼠炎癥反應(yīng)與體液免疫的亢進(jìn)，同時，通過降低INF-γ抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫。藥物干預(yù)后，單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥均可使荷瘤小鼠TNF-a、IL-4、VEGF的過度表達(dá)在一定程度上受到抑制，聯(lián)合組抑制效果最為顯著，此外卡培他濱INF-γ表現(xiàn)為荷瘤后的去抑制效果；表明訶子組可以通過抑制TNF-a與VEGF的表達(dá)削弱過度炎癥反應(yīng)對機(jī)體的不利影響達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)，這與訶子的活性成分可以通過抑制VEGFR-2受體活化來抑制血管生成[20]，使腫瘤的生長受限的研究結(jié)果基本一致；卡培他濱組抑制機(jī)體IL-4、VEGF同時促進(jìn)INF-γ的表達(dá)，通過緩解體液免疫的亢進(jìn)、降低血管生成以及抵抗腫瘤對機(jī)體細(xì)胞免疫抑制而發(fā)揮效應(yīng)；聯(lián)合組則通過同時抑制TNF-a、IL-4、VEGF表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤生長及抑制肺部轉(zhuǎn)移的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[21]炎癥反應(yīng)通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的能力來增強(qiáng)小鼠的免疫力以抗腫瘤，本實(shí)驗的病理結(jié)果提示兩單獨(dú)用藥組較模型組相比炎性細(xì)胞的浸潤也確實(shí)增加，但在聯(lián)合組卻并未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞相對模型組較為明顯的浸潤現(xiàn)象，與免疫學(xué)結(jié)果之間的差異尚需增加樣本進(jìn)一步驗證與探究。

綜上所述，訶子聯(lián)合卡培他濱可以通過降低機(jī)體TNF-a、IL-4、VEGF的表達(dá)來抑制乳腺癌生長與轉(zhuǎn)移，也在一定程度上提示了兩藥聯(lián)合對4T1乳腺癌的抑制效果與TNF-a、IL-4、VEGF降低程度的正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗再次驗證了中藥聯(lián)合化療抗腫瘤在腫瘤治療方面的相對優(yōu)越性[22]，若應(yīng)用于臨床能減輕患者病痛，增加治愈率，也可再一次提升中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤在臨床上的重視度與認(rèn)可。