高糖對滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響

譚淑儀 劉宇薇 高海

1南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院盤福院區(qū)種植修復(fù)科（廣州 510180）；2南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科（廣州 510280）；3南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院盤福院區(qū)（廣州 510180）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是世界上第四大致殘原因，主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨損傷和軟骨下骨硬化，包括軟骨退化、骨重塑、骨贅形成和滑膜炎癥［1-2］。2 型糖尿病患者骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為54%［3］，糖尿病預(yù)示著骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)后不良［4］。研究表明，糖尿病所引起的炎癥反應(yīng)和高糖環(huán)境促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨的破壞［5］，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新、向軟骨分化和免疫調(diào)節(jié)的潛能，干細(xì)胞治療作為骨關(guān)節(jié)炎的一種再生細(xì)胞治療方法，是一種治療OA 的新策略［6-7］。MSCs 來源于骨髓、脂肪組織、骨骼肌、胎盤、臍帶、牙髓和滑膜等多種組織［8］。其中，取自滑膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）向軟骨細(xì)胞分化及增殖的潛能更大，與其他來源的間充質(zhì)細(xì)胞相比，SMSCs 具有優(yōu)越的軟骨原性［9］，因而，SMSCs 在軟骨損傷修復(fù)中具有諸多優(yōu)越性，在OA的治療中有重要的應(yīng)用前景。

骨關(guān)節(jié)炎是糖尿病患者的常見并發(fā)癥。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下，滑膜SMCs 的軟骨分化能力比低糖培養(yǎng)條件下減弱［10］，但具體機(jī)制尚未闡明。干細(xì)胞衰老將對細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，不僅可以導(dǎo)致炎癥微環(huán)境的產(chǎn)生，并對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生不利影響［6］。因此，本研究擬通過探究高糖對滑膜細(xì)胞衰老和生物學(xué)功能的影響，為SMSCs應(yīng)用于糖尿病患者骨關(guān)節(jié)炎的治療提供風(fēng)險評估依據(jù)。

細(xì)胞衰老的主要特點是細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞內(nèi)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶含量升高，炎癥因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶類等衰老相關(guān)分泌表型SASP 表達(dá)上調(diào)，以及線粒體的分裂改變［11］。上述指標(biāo)的改變與細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)有關(guān)，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，進(jìn)一步影響體內(nèi)微環(huán)境以及OA 的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。

1 材料與方法

1.1 主要材料大鼠滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（賽百慷，中國）；細(xì)胞衰老半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天，中國）；CCK-8 細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒（廣州晶欣，中國）；Mito-Tracker Red CMXRos 線粒體紅色熒光探針（碧云天，中國）；ELISA 試劑盒（武漢華美，中國）；Maxima TMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）（Thermo Fisher Scientific，美國）；總RNA提取試劑盒（Promega，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）；總蛋白提取試劑及BCA-100 蛋白定量分析試劑盒（上海博彩生物科技有限公司，中國）；P21（CPA4956）兔（Cohesion Biosciences，英國）；HRP 羊抗小鼠IgG（BA1050）及HRP 羊抗兔IgG（BA1054）（武漢博士德，中國）。本研究倫理審查編號：粵口醫(yī)倫審【2021】12 號。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組收到大鼠SMSCs 后，帶培養(yǎng)瓶放置在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中，2 h 后更換新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。完全培養(yǎng)基采用賽百慷配套原代間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，由88%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗+1%細(xì)胞添加劑組成。待細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%，胰酶消化1∶2進(jìn)行傳代。實驗分組：高糖組：采用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基；對照組：采用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖活性將大鼠SMSCs P4 以每孔5 000 個細(xì)胞接種于96 孔板，設(shè)5 組復(fù)孔，24 h 待細(xì)胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，于24 h，每孔加入10 μL 的CCK 溶液，將孔板置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，測定450 nm吸光度，使用酶標(biāo)儀得到各組OD值。

1.2.3 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-gal 染色將大鼠SMSCs P4 以每孔2.9 萬個細(xì)胞接種于24 孔板，24 h 待細(xì)胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌1 次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL 染色工作液。37 ℃孵育過夜，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測（Real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）將大鼠SMSCs P4 接種于培養(yǎng)瓶中，24 h 待細(xì)胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，于24 h 收集各組細(xì)胞，提取總RNA，分光光度計檢測RNA 濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用特異性引物序列對基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。使用ABI Step One QPCR 系統(tǒng)，設(shè)置反應(yīng)條件，對各組mRNA 表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.5 Mito-tracter 染色將大鼠SMSCs P4 接種于共聚焦皿中，過夜待細(xì)胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，PBS 洗一遍，加入配制好的Mito-Tracter 培養(yǎng)基，放回37 ℃溫箱中，30 min 后取出，更換培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot 檢測將大鼠SMSCs P4 接種于培養(yǎng)瓶中，24 h 待細(xì)胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，于24 h收集各組細(xì)胞，RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。蛋白上樣后進(jìn)行電泳分離蛋白，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，孵育一抗和二抗，化學(xué)發(fā)光顯影及定影后，拍照。Western blotting 結(jié)束后，使用SensiAnsys 分析各蛋白條帶的灰度值。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測將大鼠SMSCs P4 接種于培養(yǎng)瓶中，24 h 待細(xì)胞完全貼壁后，高糖組換液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，對照組換液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培養(yǎng)基，于24 h 收集各組上清液200 μL，離心后分裝，按照試劑盒說明書要求，檢測上清液中透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的含量，使用酶標(biāo)儀得到各處理組OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計均使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，CCK-8、PCR 及Western blot 結(jié)果采用單因素方差分析比較對照組和高糖組之間的差異，ELISA 結(jié)果進(jìn)行配對T檢驗。P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖促進(jìn)大鼠SMCSs 增殖CCK-8 結(jié)果顯示，在24 h，兩組的SMCSs 增殖活性之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.675），提示在本實驗條件下，24 h 時間點，高糖環(huán)境不影響SMCSs 的增殖活性（圖1）。

圖1 細(xì)胞增殖活性Fig.1 Cell proliferative activity

2.2 高糖增加大鼠SMSCs β-半乳糖苷酶表達(dá)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞衰老標(biāo)志物，利用β-半乳糖苷酶染色檢測高糖對SMCSs β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h，與對照組相比，高糖導(dǎo)致SMCSs β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞增多，表明高糖促進(jìn)SMCSs 細(xì)胞衰老。見圖2。

圖2 β-半乳糖苷酶染色（倒置顯微鏡，×100）Fig.2 The SA-β-Gal staining（inverted microscope，×100）

2.3 高糖增加大鼠SMSCs SASP 衰老相關(guān)因子表達(dá)qRT-PCR 結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h 后，高糖組衰老相關(guān)因子SASP 的mRNA 表達(dá)較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果為MMP13（P=0.011），TNF、IL-6、INFβ（P=0.000），CXCL1（P=0.003）。如圖所示，高糖組MMP13、TNF、IL-6、CXCL1、INFβ 的mRNA 表達(dá)均較對照組高，提示高糖促進(jìn)SMCSs 進(jìn)入衰老狀態(tài)。見圖3。

圖3 MMP13、TNF、IL-6、CXCL1、INF-β mRNA 相對表達(dá)量Fig.3 The mRNA expression of MMP13，TNF，IL-6，CXCL1 and INF-β

2.4 高糖促進(jìn)大鼠SMSCs 線粒體裂解培養(yǎng)24 h后，行Mito-tracter 染色，40 倍顯微鏡下觀察，高糖組較對照組細(xì)胞中線粒體碎片化顯著增加（圖4），高糖促進(jìn)了大鼠SMSCs 線粒體的裂解。

圖4 Mito-tracter 染色（激光共聚焦顯微鏡，×40）Fig.4 Mito-tracter staining（laser scanning confocal microscope，×40）

2.5 高糖抑制大鼠SMSCs p21蛋白表達(dá)Western blotting 結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h 后，高糖組衰老相關(guān)蛋白p21 表達(dá)下降，方差分析顯示與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00），表明高糖培養(yǎng)條件抑制了大鼠滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的p21 蛋白表達(dá)（圖5）。

圖5 p21 蛋白表達(dá)量Fig.5 The protein expression of p21

2.6 高糖抑制大鼠SMSCs 透明質(zhì)酸分泌ELISA結(jié)果培養(yǎng)24 h 后，與對照組相比，高糖組透明質(zhì)酸分泌被明顯抑制，采用配對t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），表明高糖培養(yǎng)條件抑制了大鼠滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的透明質(zhì)酸分泌。見圖6。

圖6 透明質(zhì)酸濃度Fig.6 The concentration of HA

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，高糖刺激下，大鼠SMSCs SAβ-gal 染色陽性細(xì)胞增加，胞內(nèi)線粒體呈碎片化，衰老相關(guān)分泌表型SASP 表達(dá)增加，p21 表達(dá)及透明質(zhì)酸分泌降低。以上結(jié)果表明，高糖導(dǎo)致大鼠SMSCs 進(jìn)入衰老狀態(tài)，破壞了細(xì)胞的生物學(xué)功能，將進(jìn)一步影響體內(nèi)微環(huán)境，導(dǎo)致糖尿病OA 患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生不確定性。

SMSCs 本身的增殖功能下降和衰老，將導(dǎo)致其自我更新潛能弱化。研究表明，高糖可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖，對于干細(xì)胞而言，則未必。高糖（25 mmol/L）可以促進(jìn)端粒酶永生化的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，其凋亡不受高糖環(huán)境影響，而對髓核來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，25 mmol/L 的高糖培養(yǎng)3 d 并不會影響其增殖和遷移能力，而在對數(shù)生長期，干細(xì)胞增殖受到高糖抑制［12］。本研究中CCK-8 結(jié)果顯示高糖條件下本應(yīng)受到促進(jìn)的增殖并未發(fā)生，表明高糖使SMSCs 本身的增殖功能下降。β-半乳糖苷酶的活性升高是鑒定細(xì)胞衰老的金標(biāo)準(zhǔn)［13］，高糖組SMSCs 的SA-β-gal 陽性細(xì)胞多于對照組，提示衰老SMSCs 可能在高血糖狀態(tài)下增加或積累。此時衰老SMSCs 的增加或積累，并非一過性，p21（全稱p21Waf/Cip1）是一個重要的細(xì)胞周期阻滯因子，其主要功能是阻滯細(xì)胞周期在G1/S 期，當(dāng)p21 功能缺失時，就可能使損傷的細(xì)胞強(qiáng)行進(jìn)入細(xì)胞周期，走向衰老和凋亡［14］。本研究中，高糖刺激下SMCSs 的p21 表達(dá)下調(diào)，表明此時細(xì)胞受到損傷，且因p21 表達(dá)下調(diào)而無法修復(fù)損傷，加速細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。SMSCs 作為治療OA 的潛力細(xì)胞，其自我更新能力尤為重要，而SMSCs 增殖功能下降和衰老，將導(dǎo)致該潛能弱化。

線粒體與干細(xì)胞特性的維持和干細(xì)胞分化成特定的細(xì)胞類型有關(guān)，線粒體的動力學(xué)（融合和裂變）失衡將導(dǎo)致干細(xì)胞衰老并影響干細(xì)胞的功能。本實驗中，Mito-tracter 染色，高糖組細(xì)胞線粒體碎片化明顯增加。線粒體裂變的增加，可以擴(kuò)大與氧氣的接觸面積，實現(xiàn)更多的產(chǎn)能，但是也會增加酸的產(chǎn)生，增加產(chǎn)熱，不利于細(xì)胞生長，影響細(xì)胞功能［15］。當(dāng)線粒體損傷或未折疊蛋白在線粒體中積累時，線粒體裂變增加，以稀釋或分離受損蛋白，以便進(jìn)一步降解，同時，通過線粒體自噬清除線粒體可能有助于處理受損的蛋白質(zhì)。高糖條件下，線粒體的裂變增加，可能是線粒體自噬功能受損導(dǎo)致，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

SASP 是干細(xì)胞衰老相關(guān)的重要標(biāo)志，包括各種細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和生長因子，SASP 的表達(dá)上調(diào)，從多層面影響了SMSCs 的生物學(xué)功能，抑制了SMSCs 的成軟骨分化，并加重炎癥，破壞軟骨基質(zhì)。IL-6 被認(rèn)為是與OA 相關(guān)的重要炎癥因子，在OA 患者的滑膜液中IL-6 表達(dá)上調(diào)，與MMPs 呈正相關(guān)［16］。此外，研究發(fā)現(xiàn)IL-6 阻礙了滑膜液中的MSCs 向軟骨分化，從而降低了干細(xì)胞為基礎(chǔ)的顳下頜關(guān)節(jié)性骨關(guān)節(jié)炎治療的有效性［17］。干擾素（IFN）作為一種細(xì)胞因子亞群，可調(diào)節(jié)骨基質(zhì)的動態(tài)平衡，與MMPs 的表達(dá)相關(guān)。MMP13 在骨關(guān)節(jié)炎中的上調(diào)，導(dǎo)致軟骨關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白Ⅱ型膠原降解、基質(zhì)破壞和炎癥，已有研究發(fā)現(xiàn)MMP13 沉默減少了關(guān)節(jié)軟骨退化/纖顫、半月板惡化、滑膜增生、骨贅和促炎基因表達(dá)［18］。TNF-α可誘導(dǎo)IL-6 的產(chǎn)生［19］。趨化因子在糖尿病性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在部分由趨化因子驅(qū)動的進(jìn)行性滑膜炎中，滑膜分泌大量代謝廢物，進(jìn)而進(jìn)一步加重炎癥［20］。在本研究中，高糖環(huán)境下，TNF-α、IL-6、CXCL1 表達(dá)均上調(diào)，提示高糖可能通過激活NF-κB 信號通路導(dǎo)致細(xì)胞衰老及功能受損，而SASP 表達(dá)上調(diào)涉及多條信號通路，提示該病程并非單一通路激活的結(jié)果，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

透明質(zhì)酸來源于滑膜細(xì)胞及滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，在滑膜液的減震、潤滑和粘彈性方面起著重要作用。當(dāng)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，透明質(zhì)酸HA 解聚，相對于正常情況，分子量降低，清除更快，導(dǎo)致滑膜液粘彈性受損［21］。研究發(fā)現(xiàn)，在骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸，能有效減弱炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞的軟骨向分化［22］。因此，高糖環(huán)境下，SMCSs 分泌HA 減少，并由于SMCSs 的衰老，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞生成減少，進(jìn)一步間接降低了HA 的分泌，不利于OA 的治療。

以上結(jié)果表明，將SMSCs 應(yīng)用于糖尿病OA 患者治療，將存在以下風(fēng)險：高糖導(dǎo)致SMSCs 進(jìn)入衰老狀態(tài)，其增殖功能受損，將導(dǎo)致自我更新潛能弱化，同時，SMSCs 衰老及生物學(xué)功能的破壞，使SMSCs 的成軟骨分化能力及關(guān)節(jié)修復(fù)能力下降，導(dǎo)致糖尿病OA 患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生不確定性。