Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型患者的臨床、肝臟病理特征及突變基因分析

徐靜 董源 王壽明 郝坤艷 于樂成

Crigler-Najjar綜合征是遺傳性非溶血性高間接膽紅素血癥的一種。UGT1A1(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1)的基因突變是Crigler-Najjar綜合征的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，肝細(xì)胞內(nèi)缺乏UGT，從而部分或完全不能將IBil轉(zhuǎn)化為TBil從肝臟排泄至膽道，其中Ⅰ型為UGT完全缺乏，多在新生兒早期因核黃疸死亡，Ⅱ型為UGT的表達(dá)部分缺乏，可生活至成年。國內(nèi)目前對(duì)Crigler-Najjar綜合征的肝臟病理特征、家族遺傳特征的報(bào)道較少。本研究收集1例Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型患者的臨床、肝臟病理資料，并對(duì)其父母進(jìn)行調(diào)查，進(jìn)行了家族UGT1A1的基因突變檢測(cè)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象為2021年4月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)收治的1例高膽紅素血癥的患者及其父母。

二、研究方法

收集該患者的病史，其自出生至最近1次的所有生化及血常規(guī)的檢查結(jié)果，并完善凝血常規(guī)、甲戊型肝炎病毒、HBV標(biāo)志物、丙型肝炎抗體、EBV DNA、CMV DNA、抗核抗體、抗線粒體抗體及肝臟穿刺病理、腹部CT、UGT1A1基因測(cè)序等檢查。征得患者及其父母的同意，同時(shí)對(duì)其父母進(jìn)行相關(guān)調(diào)查，并抽取外周血，完善肝腎功能、血常規(guī)及UGT1A1基因測(cè)序的檢查。

UGT1AT的檢測(cè)由南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供。

結(jié) 果

一、一般資料

患者，男性，22歲。出生時(shí)即發(fā)現(xiàn)全身黃染，當(dāng)時(shí)未予任何處理。10月齡時(shí)TBil 130.3 μmol/L，DBil 9.6 μmol/L，AST 91 U/L，ALT 44 U/L，自述當(dāng)時(shí)排除溶血，未予以治療。生長發(fā)育良好。此后定期復(fù)查，TBil 在36～170 μmol/L之間波動(dòng)。2020年5月初開始服用苯巴比妥 30 mg 3次/d，2周后TBil下降至40 μmol/L左右。2020年6月初開始出現(xiàn)右臂皮膚散在出血點(diǎn)，碰撞后皮膚出血、青色瘀斑，無牙齦出血、鼻出血、便血、尿血等，后出現(xiàn)自發(fā)性左側(cè)頸部大片點(diǎn)狀出血。2020年6月25日至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查血常規(guī)：WBC 2.93×109/L，Hb 139 g/L，PLT 10×109/L。骨髓穿刺：紅細(xì)胞形態(tài)、體積大小較為一致，血小板散在偏低，偶見大血小板；白細(xì)胞部分粒細(xì)胞胞質(zhì)見顆粒增粗、空泡等毒性變化，偶見異淋。停用苯巴比妥，并輸注血小板及止血治療，出血傾向改善。2020月6月28日復(fù)查血常規(guī)：WBC 3.85×109/L，Hb 144 g/L，PLT 73×109/L?；颊咂剿伢w健，出生并長期居住于江蘇省姜堰市，無過敏史，無飲酒史，無吸煙史。為家中獨(dú)生子，父母外表體健。查體：神清，面容正常。皮膚黃染，無皮疹、出血點(diǎn)，鞏膜黃染，淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，頸靜脈無怒張；雙肺呼吸音清，心律齊，各瓣膜區(qū)未聞及雜音。腹平坦，未見腹壁靜脈顯露，肝脾肋下未觸及，莫非氏征陰性，肝腎區(qū)無叩痛，移動(dòng)性濁音陰性。雙下肢無水腫。生理反射存在，病理反射未引出。

二、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)結(jié)果

HBV標(biāo)志物均陰性；丙肝抗體陰性；甲、戊型肝炎病毒抗體陰性；自身免疫性肝病相關(guān)檢查為陰性；CMV DNA、EBV DNA<500拷貝/mL。腎功能及電解質(zhì)、凝血常規(guī)均正常。糞常規(guī)正常，隱血陰性。尿常規(guī)：尿蛋白+，尿膽紅素及尿膽原陰性。腹部彩超：肝區(qū)回聲增粗、膽囊壁毛糙；腹腔積液(下腹部探及3.8 cm的液性暗區(qū))。2月后腹部CT平掃：脾大、肝周可疑微量積液?；颊咦猿錾詠淼亩啻胃闻K生化檢查見表1。

表1 患者自出生以來的肝臟生化結(jié)果

患者自出生以來的多次血常規(guī)檢查Hb及RBC均在正常范圍，2020年6月24日服用苯巴比妥后出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)明顯減少，停藥后血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常。見表2。

表2 患者自出生以來血常規(guī)結(jié)果

三、肝臟病理

在彩超引導(dǎo)下，選擇不同的方向取寬0.1 cm，長2 cm的肝組織2條。顯微鏡下可見24個(gè)完整匯管區(qū)，肝小葉結(jié)構(gòu)保存。匯管區(qū)不同程度擴(kuò)大，纖維組織增生，少許淋巴細(xì)胞浸潤，未見界面炎，小動(dòng)脈未見擴(kuò)張，門靜脈有分支，約20%的匯管區(qū)門靜脈分支增寬，形態(tài)不規(guī)則，管周纖維化。肝細(xì)胞輕度水腫，個(gè)別氣球樣變性肝細(xì)胞及微泡脂肪變性肝細(xì)胞，中央靜脈周圍肝細(xì)胞可見少許脂褐素樣色素顆粒(圖1A)。

特殊染色：masson與天狼猩紅染色示匯管區(qū)纖維組織增生，少數(shù)小葉間短纖維隔及中央靜脈內(nèi)皮下纖維化(圖1B,C)。網(wǎng)染示肝板網(wǎng)狀支架存在(圖1D)。

A HE×100；B masson染色 ×100；C 天狼猩紅染色 ×100；D 網(wǎng)染 ×100

四、患者UGT1A1基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)患者的UGT1A1基因測(cè)序波形進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因的第5外顯子序列的第486密碼子發(fā)生的堿基突變(T>G)，在正向測(cè)序中，異常堿基G置換了正常堿基T，反向測(cè)序中，異常堿基C置換了正常堿基A，導(dǎo)致酪氨酸(Tyr)變?yōu)樘扉T冬氨酸(Asp)(圖2)。

圖2 患者的UGT1A1基因正向測(cè)序及反向測(cè)序

五、患者父母調(diào)查及UGT1A1基因測(cè)序結(jié)果

患者父母的肝臟生化檢查結(jié)果均正常，UGT1A1基因正向測(cè)序結(jié)果均為第5外顯子序列的第486位密碼子出現(xiàn)了T-G的雜合波形?；颊吒改妇鶠樵撝虏』虻臄y帶者(圖3)。

A.患者父親UGT1A1基因正向測(cè)序；B.患者母親UGT1A1基因正向測(cè)序

討 論

遺傳性膽紅素代謝障礙性肝病是指肝細(xì)胞攝取、貯存、結(jié)合、轉(zhuǎn)化及排泌膽紅素的環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致膽紅素水平升高和其他相關(guān)臨床表現(xiàn)。從膽紅素升高的特點(diǎn)來看，此類疾病主要包括兩大類，其一是以IBil升高為主的Gilbert綜合征和Crigler-Najjar綜合征(CNS)，其中Crigler-Najjar綜合征IBil的升高水平往往較Gilbert綜合征更為顯著；其二是以DBil升高為主的Dubin-Johnson綜合征(DJS)和Roter綜合征。Gilbert綜合征是最為常見的遺傳性膽紅素代謝障礙性肝病，在普通人群中的發(fā)病率為2%～10%，男性高于女性[1]；其余3種疾病在臨床上相對(duì)比較少見，例如CNS的全球新生兒發(fā)病率僅約1/1 000 000[2]。

Gilbert綜合征的主要分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是位于肝細(xì)胞染色體2q37的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT)基因發(fā)生突變。迄今已發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因突變約有130種，且不同的地區(qū)、不同種族、不同的個(gè)體間有較大差異。目前發(fā)現(xiàn)的Gilbert綜合征患者的UGT1A1突變主要有3種，集中在啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及編碼區(qū)，比如在白人中最常見的是UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)域TATAA盒兩個(gè)TA額外堿基的純合多態(tài)性，使得結(jié)合蛋白與TATAA盒的親合性減弱，從而導(dǎo)致UGT1A1表達(dá)降低，肝內(nèi)UGT1A1活性低于正常的30%[1，2]。由于這種基因多態(tài)性僅在純合子狀態(tài)下才能導(dǎo)致發(fā)病，因此本病屬于常染色體隱性遺傳性疾病。由于UGT1A1活力下降，使得IBil不能有效轉(zhuǎn)化為DBil，從而引起體內(nèi)IBil升高。臨床上以良性復(fù)發(fā)性或波動(dòng)性黃疸為主要臨床特征，禁食、脫水、過度運(yùn)動(dòng)、壓力大、溶血、月經(jīng)或并發(fā)相關(guān)疾病可誘導(dǎo)或加劇膽紅素的增高，以IBil增高為主。誘因去除后膽紅素水平可降低或恢復(fù)正常。青春期激素水平的變化也可導(dǎo)致膽紅素水平增高。男性患者由于每日膽紅素生成較多而較女性患者更多地得到臨床診斷。

相比之下，Crigler-Najjar綜合征(CNS)是一種較為罕見的先天性非溶血性黃疸性疾病，也是常染色體隱性遺傳性疾病，只有在純合子突變的情況下才會(huì)導(dǎo)致臨床發(fā)病。其遺傳缺陷在于肝細(xì)胞UGT1A1完全缺乏或活性顯著降低，從而完全或部分不能將IBil轉(zhuǎn)化為DBil并排泄至膽道。根據(jù)UGT1A1的突變情況和臨床特征，可分為CNS-Ⅰ型和Ⅱ型。不同于Gilbert綜合征的UGT1A1基因啟動(dòng)子突變，CNS-Ⅰ型患者UGT1A1基因的常見突變包括其內(nèi)含子剪接供體和受體位點(diǎn)的改變、外顯子的跳讀(exon skipping)、缺失突變、錯(cuò)義突變、插入突變或終止密碼子形成等，從而使得UGT完全缺乏，可導(dǎo)致嚴(yán)重的高膽紅素血癥，多在新生兒早期因核黃疸所致的不可逆性腦損傷而死亡；而CNS-Ⅱ型患者主要是UGT1A1基因發(fā)生點(diǎn)突變，尤其是以單堿基替代錯(cuò)義突變?yōu)橹?，常見的突變位點(diǎn)為1號(hào)外顯子錯(cuò)義突變c．211G>A和5 號(hào)外顯子c．1456T>G[3-6]，此種突變類型使得UGT表達(dá)減少，活性減弱，患兒在出生時(shí)即可有輕重不等的黃疸，但可持續(xù)至成年和終生，黃疸相對(duì)較輕，預(yù)后良好。CNS和Gilbert綜合征在肝組織病理學(xué)方面多無明顯的特異性，主要是肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色色素顆粒沉積，通常無纖維組織增生及界面炎改變[7]；鑒別診斷主要參考IBil升高的水平及UGT1A1基因突變的檢測(cè)。

本例CNS-Ⅱ型患者為青年男性，自出生時(shí)就出現(xiàn)黃疸，以IBil升高為主，并未進(jìn)行針對(duì)性處理，成長期間TBil最高達(dá)171.2 μmol/L，ALT、AST基本正常；曾用苯巴比妥經(jīng)驗(yàn)性治療，有一定的降低膽紅素的效果，但引起了繼發(fā)性血小板減少和皮膚瘀點(diǎn)及瘀斑。其肝臟病理見中央靜脈周圍肝細(xì)胞可見少許脂褐素樣色素顆粒，無界面炎，符合CNS的病理特征?；驕y(cè)序分析顯示，其UGT1A1基因存在c.1456T>G(p.Tyr486Asp) 純合子突變，而父母均為該突變的雜合子攜帶者。