細(xì)胞游離DNA片段組學(xué)用于慢性肝病診斷的研究進(jìn)展

曾偉蘭 李璟 汪艷

細(xì)胞游離DNA通常指外周循環(huán)血中所有未被包裹的無細(xì)胞DNA (cfDNA)，其來源被認(rèn)為是主要自凋亡或壞死細(xì)胞釋出，還有一些自正常細(xì)胞生理性釋出，而進(jìn)入循環(huán)血的DNA片段[1]。 典型cfDNA為長度小于200堿基對(bp)、平均長度約169 bp的DNA雙鏈片段。cfDNA不僅可以從外周血中檢測，一些研究還從尿液、糞便、腦脊液、唾液、胸水和腹水中分離和分析cfDNA。近期發(fā)現(xiàn)DNA核酸酶和DNA片段化因子等參與了胞內(nèi)cfDNA形成，但其中詳細(xì)的生成和釋出機制還未全面揭示[2]。通常吞噬細(xì)胞會迅速清理這些釋出片段，使得健康人體生理狀態(tài)下血漿中cfDNA平均濃度約在10～15 ng/mL，這些cfDNA大部分來自造血細(xì)胞，微量來自肝臟[3]。 當(dāng)某組織細(xì)胞來源cfDNA異常大量出現(xiàn)超出吞噬能力時，會以不同堿基片段長度及其不同濃度顯著出現(xiàn)在循環(huán)血中，并且這些指標(biāo)的變化范圍比較大。cfDNA是液體活檢研究領(lǐng)域的重要組成部分，其臨床應(yīng)用實踐目前主要在產(chǎn)前診斷和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域。

由于無創(chuàng)性檢測本身在篩查、早診、隨訪、預(yù)后判斷等方面具有比較明確的應(yīng)用優(yōu)勢，cfDNA作為一種理論上可以反映組織學(xué)損傷及其原位機制信息的無創(chuàng)指標(biāo)，已有大量研究工作對其生物學(xué)功能相關(guān)特征進(jìn)行探索。其中，關(guān)于cfDNA片段分布特征的分析研究，如片段長度及其頻率譜，被稱為cfDNA片段組學(xué)。隨著序列分析能力尤其是測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的飛速進(jìn)步和完善豐富， cfDNA片段組學(xué)的指標(biāo)和解讀內(nèi)容相應(yīng)增加，如末端基序、首選末端、核小體印跡、鋸齒末端、DNA 拓?fù)鋵W(xué)、遺傳和表觀遺傳學(xué)信息等，顯示出可以為相關(guān)領(lǐng)域疾病診斷甚至治療決策提供新標(biāo)志物的應(yīng)用潛力[4-5]。這些研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)cfDNA片段組學(xué)特征并非是隨機性的，組織細(xì)胞來源、疾病進(jìn)展階段、年齡、DNA核酸酶活性，以及序列分析技術(shù)等都是影響cfDNA片段組學(xué)特征的重要因素[6- 7]。還有一些共性發(fā)現(xiàn)如，腫瘤細(xì)胞來源cfDNA較非腫瘤來源cfDNA的堿基數(shù)量小，胎兒來源cfDNA較母體來源cfDNA也存在此特點。

cfDNA應(yīng)用研究在肝病領(lǐng)域已涉及多種肝病。目前報道最多的是關(guān)于在肝腫瘤診療預(yù)后等方面的判斷能力以及對肝轉(zhuǎn)移癌的診斷分析等，常見的判斷指標(biāo)包括各類突變類型和分布、拷貝數(shù)、甲基化特征、首選末端基序、線粒體DNA突變等，以體現(xiàn)腫瘤組織DNA變異特點為其理想表現(xiàn)[8]。 但是，基于序列突變和修飾現(xiàn)象本身的變異性大、含量甚微，意味著準(zhǔn)確測量的技術(shù)挑戰(zhàn)比較大，因此研究者又嘗試應(yīng)用cfDNA片段組學(xué)信息，如鋸齒末端[6- 9]， 進(jìn)行分析評估。最近一項前瞻性單中心研究采用全基因組測序技術(shù)，對來自192例原發(fā)性肝癌和170例無腫瘤對照組患者血漿的cfDNA片段長度及其數(shù)量進(jìn)行測量，然后將這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為片段長度比率和片段分布率兩類指標(biāo)，以這兩類指標(biāo)數(shù)據(jù)作為輸入變量、以該隊列診斷結(jié)果為輸出變量，用機器學(xué)習(xí)工具進(jìn)行建模，再將此模型用于另一個分布情況類似的、含189例原發(fā)性肝癌和165例無腫瘤對照組的獨立隊列進(jìn)行診斷能力測試，發(fā)現(xiàn)該模型在肝癌檢出方面的總體判斷表現(xiàn)很好(觀察者曲線下面積 0.995，敏感性 96.8%，特異性98.8%)，尤其對早期原發(fā)性肝癌(在該研究隊列總?cè)藬?shù)比率占70.3%～74.1%)、不大于3 cm的小腫瘤，肝細(xì)胞癌或膽管癌的敏感性很高(95.9%～100%)[10]。 總之，盡管采用各種cfDNA指標(biāo)的肝腫瘤診斷方法紛紛呈現(xiàn)，不少甚至有突出結(jié)果，但至今就cfDNA輔助診斷對這類患者長期預(yù)后的影響仍未有確切報告。cfDNA在早期診斷肝移植相關(guān)肝損傷的應(yīng)用研究也有不少研究探索。近期一些研究提出，供體來源 cfDNA 濃度持續(xù)增加可能有助于更加早期地判斷急性排斥反應(yīng)發(fā)生，并用于分辨移植肝急性失功是否主要源于排斥反應(yīng)[11-12]； 但同期也另有研究顯示，這些指標(biāo)預(yù)測能力的可靠性也許比較有限[13]。

與肝腫瘤和肝移植方面的應(yīng)用研究相比，cfDNA在慢性肝炎性肝病中的指標(biāo)意義還存在較多未知。非酒精性脂肪性肝病/肝炎(NAFLD/NASH)已成為全球主要常見肝病。有研究回顧性分析了58例NAFLD患者和13例健康者的血樣，采用實時定量PCR測量發(fā)現(xiàn)NAFLD組的90 bp cfDNA水平顯著高于健康組，NAFLD組中的90 bp和222 bp兩種cfDNA濃度變化都與該組患者的疾病活動度和疾病程度顯著相關(guān)[14]。另一項研究對49例疾病進(jìn)展情況包括了從NAFL到肝硬化的NAFLD患者進(jìn)行了血漿cfDNA分析，指標(biāo)包括總cfDNA、編碼cfDNA、Alu重復(fù)序列、線粒體DNA拷貝和5甲基2‘脫氧胞苷的濃度水平；發(fā)現(xiàn)肝硬化較非肝硬化患者的總cfDNA水平和編碼cfDNA水平顯著降低，而5甲基2‘脫氧胞苷水平顯著增高；且肝硬化與低水平總cfDNA和編碼cfDNA之間存在獨立相關(guān)性[15]。有研究對52例肝硬化急性失代償、57例入院診斷為慢加急性肝衰竭，以及40例健康對照進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)血漿中總cfDNA水平在慢加急性肝衰竭患者高于肝硬化急性失代償患者，器官衰竭病情嚴(yán)重或入院后30 d內(nèi)死亡的患者中的總cfDNA水平也較高[16]。 還有研究在對乙酰氨基酚過量引起急性肝損傷的小鼠模型和患者的血漿中，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞來源cfDNA濃度會大幅增加，該指標(biāo)會隨著治療情況變化，較常規(guī)生化指標(biāo)變化似乎更敏感[17]。 近期一項基于cf核小體測序策略的探索性技術(shù)研究初步顯示，通過進(jìn)一步獲取其中轉(zhuǎn)錄組信息，可以辨識不同病因?qū)W的慢性肝病包括NAFLD、NASH、自身免疫性肝炎、肝移植、心源性肝損傷、部分肝切除等，甚至可以分辨出肝損傷分布的主要組織區(qū)帶[18]。這類新技術(shù)也許可以進(jìn)一步提高cfDNA在慢性肝炎性肝病中的應(yīng)用潛力。

盡管近十年來不少概念驗證性研究提示，與臨床上傳統(tǒng)使用的有創(chuàng)指標(biāo)和基于血液分析的無創(chuàng)診斷指標(biāo)相比，cfDNA檢測在特定疾病診療中具有獨特優(yōu)勢，但cfDNA在研究廣泛性和應(yīng)用普及性方面仍未見顯著突破，對于大多數(shù)臨床條件，技術(shù)實施和分析能力仍是阻礙cfDNA應(yīng)用推廣與普及的主要原因[19]。血樣中目標(biāo)cfDNA的濃度極低且易降解是技術(shù)實踐困難的主要根源之一[20]。因此在每個技術(shù)環(huán)節(jié)需要詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計并嚴(yán)格實行[7, 20]：為盡可能減少血液細(xì)胞釋放非目標(biāo)cfDNA對目標(biāo)cfDNA造成污染，需避免樣本發(fā)生溶血，發(fā)生溶血的樣本不適于用于cfDNA分析。通常條件下靜脈采血后應(yīng)在1～4 h內(nèi)分離出血漿。如果使用含有對血細(xì)胞有穩(wěn)定作用添加劑的特殊采血管，樣本放存期限可以增加至7 d以上。通常應(yīng)至少依次進(jìn)行低速(如3000× g)和高速(如30 000 ×g)兩次離心除血細(xì)胞和游離長鏈DNA片段。分裝后-80 ℃凍存兩周內(nèi)使用對cfDNA的影響最小。如使用專門提取cfDNA的商業(yè)化試劑盒可以在保留短片段DNA方面有所改進(jìn)。血樣處理具體流程(如待處理時間、離心、溫度等因素條件)不同可能會引起不同分析結(jié)果的產(chǎn)生。就此值得一提的是，盡管不少cfDNA應(yīng)用研發(fā)報道展示了突出的診斷能力，但其中技術(shù)流程的精確性、重復(fù)性等質(zhì)控基礎(chǔ)是否充分以及是否具有可普及性，相較其數(shù)據(jù)結(jié)果，在報告中常常沒有受到應(yīng)有的突顯。另外，在獲取cfDNA之后應(yīng)采取何種分析或測序技術(shù)、何種測量指標(biāo)，如何解讀指標(biāo)結(jié)果，如何獲得臨床最優(yōu)模型，這些也超出了臨床醫(yī)學(xué)目前專業(yè)教育的常規(guī)范圍，跨學(xué)科交叉技能是日常實現(xiàn)cfDNA檢測分析的必備基礎(chǔ)條件。此外，除了實驗室技術(shù)環(huán)節(jié)，研究設(shè)計也往往影響有關(guān)發(fā)現(xiàn)的實際臨床價值，如肝癌通常發(fā)生于當(dāng)?shù)囟喟l(fā)慢性肝病肝硬化或嚴(yán)重肝纖維化階段，因此在評估肝癌識別指標(biāo)時，應(yīng)將這些臨床情況對應(yīng)設(shè)計在對照隊列中，而非僅考慮將健康者作為研究對照，或?qū)φ贞犃兄写蟛糠譃榻】嫡?。從目前來看，本領(lǐng)域還需要更多在技術(shù)嚴(yán)謹(jǐn)性和臨床設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)性雙方面高質(zhì)量的研究報道。