乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清miRNA差異表達(dá)譜及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

謝志偉 陸靄琪 楊可立 陳彬彬 關(guān)玉娟 肖光明 李劍萍

肝衰竭是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損傷，病死率高。乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-related chronic and acute liver failure，HBV-ACLF)占肝衰竭總數(shù)的81.80%[1]。ACLF病理生理機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確[2, 3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了生物體多種生理過程，如在HBV感染者血循環(huán)中多種miRNA的表達(dá)量發(fā)生變化，且隨著HBeAg狀態(tài)不同，其miRNA表達(dá)不一樣，HBeAg陽性患者的血清miRNA-122-5p、miRNA-125b-5p、miRNA-192-5p、miRNA-193b-3p及miRNA-194-5p水平較HBeAg陰性患者高[4-7]。miRNA通過調(diào)控死亡受體介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡來參與肝衰竭的發(fā)病，miRNA-122-3p可以作為HBV-ACLF預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，HBV-ACLF死亡患者血清miRNA-200a表達(dá)水平明顯高于生存患者[8-10]。針對(duì)目前HBV-ACLF臨床治療效果差，本研究擬尋找早期診斷、預(yù)測(cè)HBV-ACLF臨床療效及預(yù)后的miRNA。

材料與方法

一、研究對(duì)象

納入2018年5月至2019年5月就診于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院乙型肝炎病毒感染患者，HBV-ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肝衰竭診治指南(2018年版)》[11]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲，性別不限；②HBsAg 陽性持續(xù) 6 個(gè)月以上；③血清總膽紅素≥10×ULN 或每日上升≥17.1 μmol/L；凝血酶原活動(dòng)度≤40%或 INR≥1.5；④能理解本研究并簽署知情同意書，并且遵守本研究的要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并HIV、HCV、HEV、HDV感染，合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病、代謝性肝病等肝?。虎诤喜⑵渌鞴賴?yán)重的基礎(chǔ)性疾??；③依從性差。

研究分為HBV-ACLF組、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)組及健康對(duì)照(healthy control，HC)組；HBV-ACLF組再分為好轉(zhuǎn)組與未愈組，未愈組定義為患者出院時(shí)肝功能變差或死亡；收集患者臨床資料如人口學(xué)特征、病毒學(xué)指標(biāo)、血常規(guī)、生化、凝血功能、電解質(zhì)及纖維化指標(biāo)。

二、微小RNA測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

使用TRizol試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, 美國(guó))從患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中分離總RNA。為了獲得RNA的完整性和質(zhì)量，使用安捷倫2100生物分析儀(安捷倫技術(shù)公司)測(cè)量每個(gè)樣本的RNA完整性數(shù)(RIN)值。按照制造商的協(xié)議，使用NEB Multiplex Small RNA library Prep Kit (New England Biolabs Inc.)制備文庫(kù)?？靛飞锛夹g(shù)(上海)在Illumina-NextSeq500平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪和處理，調(diào)整后P<0.05視為差異表達(dá)。

三、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗(yàn)證miRNA

利用SYBR Green PCR試劑盒對(duì)CFX-96進(jìn)行實(shí)時(shí)Q-PCR分析，分析所選miRNA和一個(gè)內(nèi)參U6基因的表達(dá)情況。采用標(biāo)準(zhǔn)2-ΔCt法計(jì)算miRNA的表達(dá)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS Statistics 25.0分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩兩比較的Student’t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；3組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者人口學(xué)及臨床特征比較

共納入75例研究對(duì)象，男59例，女16例，年齡(39.7±9.1)歲；HBV-ACLF組30例，年齡39.0(34.8，48.3)歲，男25例(占83.3%)；CHB組20例，年齡38.5(27.0，49.8)歲，男12例(占70%)；HC組 25例，年齡38.0(33.5，43.0)歲，男20例(占80.0%)；3組研究對(duì)象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HBV-ACLF組與CHB組、HC組比較，具有較低的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、血小板計(jì)數(shù)及較高ALT、AST水平，且miRNA-144-3P、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p、miRNA-137-3p、miRNA451a表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而肌酐水平及白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

HBV-ACLF組患者30例，分為好轉(zhuǎn)組17例及未愈組13例，兩組性別、年齡、HBV DNA水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、肝腎功能、電解質(zhì)及纖維化指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與未愈組比較，好轉(zhuǎn)組具有更高的血小板計(jì)數(shù)及更好的凝血功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 HBV-ACLF好轉(zhuǎn)組與未愈組患者臨床特征比較

二、HBV-ACLF患者與HC患者miRNA表達(dá)譜

為明確miRNA在HBV-ACLF患者PBMC中表達(dá)情況及篩選出可能發(fā)揮作用的miRNA，采用Exiqon公司基于LNA(鎖核酸)開發(fā)的miRNA芯片分析技術(shù)，收集10例HBV-ACLF患者和5例健康人的PBMC分別進(jìn)行基因芯片雜交驗(yàn)證，然后合成比對(duì)。最后合成的miRNA-microarray芯片結(jié)果，與健康對(duì)照組人群比較，按照2倍倍數(shù)變化(fold change>2)，P<0.05，在HBV-ACLF患者體內(nèi)65個(gè)miRNA發(fā)生了顯著變化，其中上調(diào)miRNA 25個(gè)(圖1A)，下調(diào)芯片miRNAs 40個(gè)(圖1B)。

圖1 通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者血清中表達(dá)異常的血清miRNA

三、miRNA 對(duì) HBV-ACLF患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，納入HBV-ACLF患者20例，CHB患者20例，選取同期健康人20例作為健康對(duì)照組，分析miRNA表達(dá)差異情況。HBV-ACLF組與CHB組、HC組比較，miRNA-144-3p、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p及miRNA451a表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而miRNA-137-3p表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組研究對(duì)象miRNA表達(dá)差異情況

20例擴(kuò)大驗(yàn)證的HBV-ACLF患者中，好轉(zhuǎn)組11例，惡化組9例。兩組miRNA表達(dá)水平比較，miRNA-144-3P、miRNA-137-3p及miRNA451a表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，好轉(zhuǎn)組miRNA-205-5p及miRNA-96-5p均為上調(diào)表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 HBV-ACLF患者好轉(zhuǎn)組與未愈組miRNA表達(dá)差異情況

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，與CHB患者及健康人群比較，HBV-ACLF患者紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平及血小板水平較低，與既往報(bào)道一致。研究發(fā)現(xiàn)，相比于非ACLF患者及健康人群，ACLF患者炎癥因子水平明顯升高[12, 13]。Lippi等[14]報(bào)道，炎癥因子如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1β及白細(xì)胞介素-6可能抑制鐵代謝和促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，導(dǎo)致合成障礙或促紅細(xì)胞生成素異?；顒?dòng)，這或許是ACLF患者紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白下降的原因。本研究也發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF未愈患者血小板下降更明顯，凝血功能更差。許珊珊等[15]發(fā)現(xiàn)ACLF患者血小板下降明顯，且死亡組血小板比存活組下降更明顯，但2組血漿促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)水平無顯著差異，提示ACLF患者血小板減少的原因可能為消耗或重新分布，并非TPO水平下降導(dǎo)致血小板生成減少。

miRNA作為一種在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈 RNA，不僅在不同疾病狀態(tài)下表達(dá)譜不同，而且可以穩(wěn)定地存在于血液、血清等體液中。不同miRNA在肝臟疾病也發(fā)揮不同作用[6, 16]。本研究篩選HBV-ACLF患者血清中表達(dá)顯著異常的miRNA，發(fā)現(xiàn)與健康人比較，HBV-ACLF患者血清中有65個(gè)miRNA發(fā)生了顯著變化，其中上升最高的為miRNA 27-5P和 miRNA 199b-5P。有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌患者miRNA 199b-5P表達(dá)下調(diào)，而miRNA 199b-5P的過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞聚集、細(xì)胞遷移及擴(kuò)散，miRNA 27-5P的表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期的停止[17，18]。本研究擴(kuò)大樣本后發(fā)現(xiàn)，與CHB患者及健康人群相比，HBV-ACLF患者miRNA-144-3p、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p、miRNA-451a均表達(dá)上調(diào)，且好轉(zhuǎn)患者，miRNA-96-5p和miRNA-205-5p均上調(diào)表達(dá)。miRNA-96-5p可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其主要機(jī)制為通過降低酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平和抑制NF -κB通路，miRNA-205-5p可以抑制疤痕的形成，主要通過抑制人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的侵襲和遷移能力，及抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)從而抑制PI3K/Akt 通路[19，20]。而目前認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)失衡和過度的炎癥反應(yīng)是ACLF發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理生理機(jī)制[12, 21-23]，為此，通過免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥反應(yīng)可以改善ACLF的預(yù)后。

綜上所述，miRNA-96-5p和miRNA-205-5p在HBV-ACLF患者中表達(dá)水平升高，且與HBV-ACLF患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為 HBV-ACLF 診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的新指標(biāo)。由于本研究入組病例數(shù)相對(duì)較少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。