基于電子舌技術與人工口嘗評價相結合的銀杏葉提取物掩味技術研究

薛婉瑩，李紅鑫，吳婧楠，孫常勝，李思潼，馬宏瑞，陳曉嬌，孫騰躍，郭杏梅，蔡程科*，王洪飛*（.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 0488；.北京量子高科制藥科技有限公司，北京 000）

中藥的成分極其復雜，包括生物堿類、黃酮類、內(nèi)酯類、苦味肽類、糖苷類、萜類等成分，因成分復雜，異?？酀钥诟幸恢辈惶鼙换颊呓邮?，找到能使中藥苦度降至大家普遍能接受的方法顯得尤為重要[1]。銀杏葉作為傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘、化濁降脂等作用[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物及其制劑對于治療心腦血管疾病[3]、阿爾茨海默病[4]和糖尿病腎病[5-6]等疾病具有顯著效果。

銀杏葉為銀杏科銀杏（白果樹、公孫樹）Ginkgo bilobaL.的干燥葉。一般為人工栽培，秋季葉尚綠時采收，及時干燥。銀杏葉中含有豐富的黃酮苷類、萜類、生物堿類化合物，這些成分使得銀杏葉提取物的藥用價值和適用范圍十分廣泛。但其味道異?？酀?，大大降低了患者的服用適應性，尤其是兒童，其味道可能會導致嘔吐等。所以對銀杏葉提取物進行掩味是非常有必要的。一般情況下，傳統(tǒng)的掩味方式分為以下幾種：一種是通過添加掩味劑如高效甜味劑、香精等造成大腦對味覺的混淆，從而對苦味的敏感度降低；另外一種則是通過對制劑進行處理如包衣，制成微囊等降低與味蕾接觸的藥量或藥物濃度，用于延緩或阻止藥物在口腔內(nèi)的溶解[7]。通常來說添加掩味劑是最常用和最簡單的掩蓋苦味的方法。通過前期的文獻調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紐甜、甜菊苷、阿斯巴甜等甜味劑能抑制鹽酸小檗堿、黃酮類、生物堿的苦味[8-10]。

甜味物質包含的化合物有很多，且具有各式各樣的化學結構，例如糖（蔗糖、葡萄糖），糖醇（山梨醇、甘露醇、木糖醇），肽（阿斯巴甜），蛋白質（單胞素）。甜味劑的效力被定義為蔗糖濃度與甜味劑濃度的比值。如蔗糖和葡萄糖被稱為低效價甜味劑，其甜味劑的效力約為1或更少（0.6～0.7）。另一方面，甜味劑效力超過10的甜味劑被稱為高效甜味劑，如紐甜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。對于一些低效價甜味劑，如蔗糖和木糖醇，甜味強度隨著濃度的增加而增加。即使同樣的效果在低濃度的高效甜味劑時也會發(fā)生，但在高濃度的高效甜味劑下，甜味強度的增加會放緩至趨于穩(wěn)定。由于這些特性，低效甜味劑（如甘露醇和山梨醇）和高效甜味劑（如阿斯巴甜和糖精鈉）通常一起用于藥物中，以補充甜味度和改善飲用口感。本研究選擇了阿斯巴甜和紐甜、甜菊苷、三氯蔗糖這四種甜味劑，利用口嘗法和電子舌法探究其對銀杏葉提取物的掩味效果，并總結相應的規(guī)律，為今后的中藥掩味奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

SA-402B型電子舌（日本Insent公司）；CP225D型電子天平（十萬分之一，精度：0.01 mg，德國Sartorius 公司）；JOYN-SXT-02型索氏提取器（上海喬躍電子科技有限公司）；ADS-800型吸附樹脂（科海司北京科技有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海百典儀器設備有限公司）。

1.2 試藥

阿斯巴甜（北京維多化工有限公司，批號：20210424）；紐甜（深圳佳加甜味劑有限公司，批號：20210107）；三氯蔗糖（江西阿爾法高科制藥有限公司，批號：20210301）；甜菊苷（曲阜香州甜菊制品有限責任公司，批號：20201107）；銀杏葉：2月采于陜西楊凌，每次采收的銀杏葉都及時放入60～70℃的干燥箱中干燥24 h，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥制劑系蔡程科教授鑒定均符合2020年版《中國藥典》一部項下有關規(guī)定要求；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 銀杏葉提取物的制備

取約1 kg銀杏葉曬干磨成粉，浸于稀乙醇，用索氏提取器加熱回流提取，濃縮提取液并回收乙醇。將濃縮提取液用處理后的大孔樹脂進行吸附，并用不同濃度梯度的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，進行噴霧干燥，回收乙醇并不斷濃縮形成浸膏。最后真空干燥，粉碎形成粉末，制得銀杏葉提取物粉末。

2.2 鹽酸小檗堿溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿10 g，加水配制成質量濃 度 為0.00、0.01、0.05、0.10、0.50 mg·mL－1的參比液。

2.3 確定苦度評價等級

結合銀杏葉的自身特點和查閱文獻[11]，確定了苦度值分為五個等級，見表1，取“2.2”項下的鹽酸小檗堿溶液（參比液），給志愿者進行預實驗，培訓如何對藥品的苦味進行評價。

表1 苦味評價標準Tab 1 Criteria for bitterness evaluation

2.4 樣品制備

2.4.1 陽性參比液的配制 取800 g自制的銀杏葉提取物，加水至8 L，充分溶解，過濾后，制得陽性參比液。根據(jù)志愿者口嘗后的綜合評分得陽性參比液的苦度值為5，口感評價為：不能忍受的苦味，且后味非常持久。陽性參比液的苦度值之所以選擇5是因為選擇3或4的話加入掩味劑之后苦度值的下降并不會非常明顯。

2.4.2 含有掩味劑的樣品溶液的制備 取“2.4.1”項下方法制備而成的苦味原液16份，每份400 mL，分別加入紐甜：1.25、2.5、3.75、5 mg·mL－1；三氯蔗糖：5、6.25、7.5、8.75 mg·mL－1；阿斯巴甜：5、7.5、10、12.5 mg·mL－1；甜菊苷：5、10、20、25 mg·mL－1，即得。

2.5 志愿者篩選

經(jīng)北京中醫(yī)藥大學倫理委員會同意審批后，選擇20名身體健康的志愿者（10名男性，10名女性），對其進行了嚴格的苦味敏感度篩查，并簽署了知情同意書。

2.6 口嘗評價法

2.6.1 評價方法 本實驗采用口嘗評價＋排序法，這是非常常用的評價苦味的方法。首先要先對陽性參比液即未添加掩味劑的溶液進行口嘗法評分。首先取30 mL的陽性參比液置于紙杯中，由志愿者含入口中，從舌尖至舌根充分感受參比制劑的味道維持20 s，吐出后漱口5次，在志愿者充分感知苦味的時候告知其苦度分級及具體的苦度值。漱口后，確定口中完全無苦味的情況下，方可再次測定樣品的苦度值。

參照陽性參比液的測試方法，每輪實驗給志愿者測試4個樣品，按照苦度值從低到高的順序給樣品排序，并結合陽性參比液的苦度值給每個樣品一個具體的苦度值，并把志愿者給出的結果記錄在藥物苦味評分表中。每次志愿者測試完一個樣品之后皆要漱口5次，待口中完全沒有苦味之后1～2 min才能測試下一樣品。每兩輪樣品中間志愿者休息1 h，并且要保證本實驗志愿者測試的樣品是隨機、單盲的。

2.6.2 異常值的剔除 由于本實驗中含有生物樣本，且每個受試者之間也會存在個體差異，故導致測試結果中會有異常值。Grubbs檢驗法用來判斷實驗誤差，并可將測試結果中的異常值剔除。采用雙側檢驗，顯著水平α＝0.05的方式剔除離群值，每一組每一輪僅剔除一個異常值，剔除之后不再進行補充測試。

3 電子舌測定

3.1 SA402B型電子舌簡介

SA402B型電子舌（日本Insent公司）是一種類脂膜電位型電子舌，類脂膜由多種電位型電極組成，與人體味蕾細胞的細胞壁脂質膜類似，能夠感知區(qū)別不同的樣品溶液，感知基本的味道，進而辨識不同的物質。

3.2 儀器參數(shù)

采用苦味分析系統(tǒng) BT0、AN0 共 2 個傳感器及 1 個標準電極。傳感器經(jīng)活化、校正后測樣。見表2。

表2 傳感器說明Tab 2 Descriptions of sensor

3.3 電子舌測試程序

3.3.1 樣品處理方法 將35 mL樣品置于50 mL離心管超聲20 min，待充分溶解后測試，將待測樣品稀釋10倍后取35 mL樣品置于電子舌特定樣品杯中測試。

3.3.2 SA402B 型電子舌測試 平衡：傳感器先在清洗液中清洗90 s，陽性參比液清洗120 s、繼續(xù)用含有酒石酸的氯化鉀溶液（精密稱取1.12 g氯化鉀和0.024 g酒石酸，溶于250 mL蒸餾水中，充分溶解后置500 mL量瓶中定容）清洗 120 s，傳感器在平衡位置歸零30 s。

測試：測試時間30 s，輸出先味值；后用含有酒石酸的氯化鉀溶液清洗3 s，傳感器插入新的陽性參比液中測試回味30 s，循環(huán)測試4次，去掉第一次循環(huán)，取后3次平均數(shù)據(jù)作為測試結果。

4 結果與討論

4.1 口嘗法評價不同掩味劑對銀杏葉的掩味結果

對“2.4.2”項下方法制備的樣品進行口嘗法測試，通過Grubbs的檢驗，用t檢驗評價得到不同濃度不同掩味劑對于銀杏葉陽性參比液掩味前后的差別，結果見圖1。

圖1 不同濃度不同掩味劑的苦度值結果Fig 1 Bitterness of different masking agents at different concentrations

4種掩味劑抑制苦味的效果和濃度變化的趨勢是一致的，隨著質量濃度逐漸增大，苦度值隨之減小。紐甜在質量濃度1.25～5 mg·mL－1時對于銀杏葉的掩味效果變化最為顯著，三氯蔗糖和阿斯巴甜對銀杏葉苦味的掩味效果相當，甜菊苷對銀杏葉苦味沒有明顯的掩味效果。

隨著紐甜用量的增多，雖然銀杏葉的苦味有明顯下降，甜度逐漸上升，在紐甜質量濃度超過3.75 mg·mL－1時，據(jù)口嘗者反饋，甜度過高，逐漸影響口嘗者喜好，其甜苦相間的口感會使得口嘗者感到不適。綜合苦度值的下降和口嘗者的描述，紐甜作用在銀杏葉掩味的最佳質量濃度為3.75 mg·mL－1。

對紐甜、三氯蔗糖、甜菊苷和阿斯巴甜的4種濃度對數(shù)與苦度降低值進行線性擬合，結果見表3，4種掩味劑在實驗濃度下掩味效應與濃度的關系符合韋伯-費希納定律，這說明感覺強度與濃度的對數(shù)是成正比的，銀杏葉苦度值的下降與掩味劑的濃度也成正比。

表3 4種掩味劑的苦度降低值與濃度間的關系模型擬合方程Tab 3 Model fitting equation for the relationship between bitterness reduction and concentration of 4 taste masking agents

4.2 電子舌法評價結果

本實驗通過對陽性參比液和加入不同濃度掩味劑的樣品進行電子舌測試，測得BT0堿基鹽類苦味和AN0堿性苦味。

電子舌對陽性參比液的AN0的測試結果為－1.14，說明AN0傳感器對于銀杏葉的苦味并無響應，加入不同的掩味劑結果也是負數(shù)，說明AN0傳感器得到的結果不能作為掩味效果的依據(jù)。電子舌對陽性參比液的BT0測試結果為6.09，銀杏葉和加入不同的掩味劑的樣品均對BT0傳感器有明顯響應，見表4。紐甜和甜菊苷隨著濃度的增大苦度值Ie也增大，但對于三氯蔗糖和阿斯巴甜來說隨著濃度的增大Ie是減小的。所以本文選擇BT0傳感器進行研究。紐甜的濃度變化引起的BT0苦味值變化最為劇烈，所以可以初步判斷紐甜對于銀杏葉的掩味效果最為明顯。

表4 各掩味劑BT0堿基鹽類苦味結果Tab 4 Bitterness of BT0 base salts of each taste masking agent

5 討論

人工口嘗法得到的結果是紐甜對銀杏葉的掩味效果最佳，紐甜有高甜度、無后苦、低熱量等優(yōu)點，并且對多類中藥都具有較好的掩味效果，人的感官在分辨力和敏感度等方面均存在個體差異，對于甜度的喜好也各不相同，所以掩味的時候不是甜度越高越好，應當設置一個合理的范圍。電子舌是一種新興的仿生儀器，多應用于食品口感評價[12]和藥物味道辨識[13-14]等方面，有關電子舌在評價藥物的掩味方面的研究相對較少，尤其是中藥，更缺乏相對豐富的理論與技術支持。如同本實驗，在結合人的感官評判和電子舌的實驗結果后，也發(fā)現(xiàn)了一些問題，本實驗所選擇的掩味劑和陽性參比液都是比較簡單的體系，比較容易從電子舌的測試結果中找出規(guī)律，但是并不是所有的苦味傳感器都能有所響應，考慮AN0傳感器不能應答的原因可能與掩味劑及銀杏葉的質量濃度或其固有屬性如分子結構相關，實驗設計掩味劑主要有阻斷味蕾，增甜，混淆大腦對苦味感官等抑制苦味的原理，銀杏葉溶于水后比較黏，有些物質可能吸附在傳感器上，減少了苦味物質與傳感器的接觸，影響了電勢，或者與電子舌本身性質也有關系。綜上所述，電子舌仍需進行優(yōu)化和改進，才能更好地應用于評價藥物的掩味效果，單獨使用電子舌對類似的制劑進行處方篩選，發(fā)揮其客觀、快速、穩(wěn)定、標準的優(yōu)點。

本實驗電子舌和口嘗法兩種方法各有優(yōu)缺點，且得到的結果也都具有參考意義，口嘗法能夠利用得到的數(shù)據(jù)擬合出方程和曲線，方便我們對掩味劑的濃度對其掩味效果進行預測，而電子舌得出的實驗結果與口嘗法的結果也有相似之處，但局限于特定的載體和特定的味覺傳感器，本實驗揭示了4種掩味劑抑制銀杏葉苦味的規(guī)律，對中藥的掩味研究具有一定的參考意義，然而中藥的苦味成分非常復雜，本實驗所建立的方法仍需要進一步研究。