含氨基酸或小肽的陽(yáng)離子抗菌藥物

王艷，吳條，唐美，鄒俊娜（中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083）

念珠性陰道炎（vulvovaginal candidiasis，VVC）是女性最困擾的疾病之一，大約75%的女性一生至少患一次念珠性陰道炎。更糟糕的是，耐藥菌株的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致念珠性陰道炎治療失敗。實(shí)際上，耐藥菌的出現(xiàn)和迅速傳播已成為最大的公共衛(wèi)生威脅之一，迫切需要研發(fā)不易誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生的新抗菌藥物。

人工設(shè)計(jì)合成的短脂肽（synthetic short lipopeptides，SSLP）[1-2]模擬天然抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）兩親性的結(jié)構(gòu)特征，帶有凈正電荷和疏水團(tuán)，保留了AMP的抗菌活性[3-5]，不同的是，SSLP的肽鏈很短，典型的SSLP肽鏈只有2～5個(gè)氨基酸殘基，而且SSLP的疏水團(tuán)是脂肪酸鏈部分，一般為10～18個(gè)碳原子，這不僅彌補(bǔ)了肽鏈短的問(wèn)題，還提高了抗菌活性，同時(shí)SSLP的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，克服了天然AMP來(lái)源有限和價(jià)格昂貴的問(wèn)題，近年來(lái)獲得大量關(guān)注。很多研究表明SSLP與AMP相似，主要通過(guò)破壞膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮殺菌作用，且抑菌活性依賴于正電荷數(shù)與碳鏈長(zhǎng)度的平衡[6-8]。

陽(yáng)離子表面活性劑（cationic surfactant，CS）具有SSLP相似的結(jié)構(gòu)特征和抗菌活性，包括經(jīng)典陽(yáng)離子表面活性劑（classical cationic surfactant，CCS）（如苯扎溴銨、醋酸氯己定[9]）和氨基酸基陽(yáng)離子表面活性劑（amino acid-based cationic surfactant，AACS）（如Nα-?；彼嵋阴10]）。AACS是SSLP的結(jié)構(gòu)類似物，SSLP的肽鏈縮短到只有一個(gè)氨基酸就成為AACS，AACS的結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，合成更容易，更具優(yōu)勢(shì)。

本文研究的SSLP包括四種脂二肽[棕櫚酰精氨酰精氨酰胺（C16-RR-NH2）、棕櫚酰賴氨酰賴氨酰胺（C16-KK-NH2）、棕櫚酰精氨酰賴氨酰胺（C16-RK-NH2）、棕櫚酰賴氨酰精氨酰胺（C16-KR-NH2）]和一種脂五肽[葵酰精氨酰賴氨酰色氨酰色氨酰賴氨酰胺（C10-RKWWK-NH2）]，AACS包括六種不同碳?xì)滏滈L(zhǎng)的Nα-?；彼嵋阴Nα-癸酰精氨酸乙酯（C10-R-OEt）、Nα-月桂酰精氨酸乙酯（C12-R-OEt）、Nα-肉豆蔻酰精氨酸乙酯（C14-R-OEt）、Nα-棕櫚酰精氨酸乙酯（C16-R-OEt）、Nα-硬脂酰精氨酸乙酯（C18-ROEt）、Nα-花生酰精氨酸乙酯（C20-R-OEt）]，作為對(duì)照的CCS包括苯扎溴銨和醋酸氯己定。

1 材料與方法

1.1 試藥

L-精氨酸鹽酸鹽（阿拉丁生物科技），葵酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯和花生酰氯（薩恩化學(xué)），其他用于合成Nα-?；彼嵋阴サ脑噭┒紴榉治黾?，苯扎溴銨、醋酸氯己定（國(guó)藥集團(tuán)）。C10-RKWWK-NH2、C16-RR-NH2、C16-KK-NH2、C16-RK-NH2和 C16-KRNH2由合肥國(guó)肽生物技術(shù)公司定制合成。

1.2 Nα-酰基精氨酸乙酯的合成與表征

取10 mmolL-精氨酸鹽酸鹽加入500 mmol的乙醇中，冰浴攪拌0.5 h。使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加50 mmol二氯亞砜，待放熱結(jié)束，常溫?cái)嚢?2 h，旋干溶劑得精氨酸乙酯鹽酸鹽。

將制得的精氨酸乙酯鹽酸鹽溶解在適量乙醇中，滴加30 mmol三乙胺，冰浴攪拌1 h。將混合液平均分為6份，分別滴加適量的葵酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯和花生酰氯，常溫?cái)嚢?2 h，旋干溶劑，得到不同?；滈L(zhǎng)度的Nα-?；彼嵋阴ゴ制贰?/p>

采用飽和碳酸氫鈉洗滌-萃取-透析方法進(jìn)行純化，純度經(jīng)HPLC測(cè)定均大于95%，產(chǎn)率大于80%。1H NMR（布魯克AVANCE Ⅲ，400 MHz，DMSO-d6）表征結(jié)果：

C10-R-OEt：δ4.19（dd，J＝13.0，8.6 Hz，1H），4.12～4.03（m，2H），3.08（s，2H），2.12（t，J＝7.3 Hz，2H），1.76～1.68（m，1H），1.65～1.55（m，1H），1.51～1.48（m，4H），1.24（s，12H），1.18（t，J＝7.1 Hz，3H），0.86（t，J＝6.5 Hz，3H）。

C12-R-OEt：δ4.18（dd，J＝13.0，8.4 Hz，1H），4.12～4.04（m，2H），3.08（s，2H），2.12（t，J＝7.3 Hz，2H），1.76～1.68（m，1H），1.63～1.58（m，1H），1.52～1.46（m，4H），1.24（s，16H），1.18（t，J＝7.1 Hz，3H），0.86（t，J＝6.4 Hz，3H）。

C14-R-OEt：δ4.16（dd，J＝12.2，7.7 Hz，1H），4.12～3.98（m，2H），3.11（s，2H），2.11（t，J＝7.2 Hz，2H），1.77～1.68（m，1H），1.63～1.54（m，1H），1.51～1.46（m，4H），1.24（s，20H），1.19（t，J＝7.3 Hz，3H），0.86（t，J＝6.2 Hz，3H）。

C16-R-OEt：δ4.17（dd，J＝12.6，7.6 Hz，1H），4.09～4.04（m，2H），3.09（s，2H），2.12（t，J＝7.4 Hz，2H），1.73～1.67（m，1H），1.63～1.59（m，1H），1.52～1.47（m，4H），1.23（s，24H），1.17（t，J＝7.2 Hz，3H），0.85（t，J＝6.4 Hz，3H）。

C18-R-OEt：δ4.18（dd，J＝12.9，7.8 Hz，1H），4.11～4.05（m，2H），3.10（s，2H），2.12（t，J＝7.2 Hz，2H），1.75～1.67（m，1H），1.65～1.57（m，1H），1.54～1.44（m，4H），1.24（s，28H），1.17（t，J＝7.0 Hz，3H），0.85（t，J＝6.2 Hz，3H）。

C20-R-OEt：δ4.19（dd，J＝12.7，7.6 Hz，1H），4.10～4.04（m，2H），3.07（s，2H），2.11（t，J＝7.2 Hz，2H），1.74～1.67（m，1H），1.63～1.56（m，1H），1.49～1.47（m，4H），1.23（s，32H），1.17（t，J＝7.1 Hz，3H），0.85（t，J＝6.1 Hz，3H）。

1.3 菌株、細(xì)胞和培養(yǎng)條件

大腸埃希菌（E.coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（S.aureus，ATCC25923）、白假絲酵母菌（C.albicans，ATCC10231）、銅綠假單胞菌（P.aeruginos，ATCC27853）、耐甲氧西林金黃葡萄球菌（MRSA，ATCC43300）購(gòu)自廣東省微生物保藏中心，卷曲乳桿菌（L.crispatus，CGMCC1.2743）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌株于－80℃保存在Microbank菌種保藏管中。C.albicans使用RPMI 1640培養(yǎng)基（3-嗎啉丙磺酸緩沖液調(diào)節(jié)），E.coli、S.aureus、P.aeruginos和MRSA使用CAMHB肉湯培養(yǎng)基，L.crispatus使用MRS肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中孵育16～24 h，其中L.crispatus置于無(wú)氧、含5%CO2的條件下孵育。人陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7（上海栩冉生物科技有限公司）采用添加有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基（含谷氨酰胺）。

1.4 抑菌活性、溶血活性、細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MMC），按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的用于抗微生物制劑的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。殺菌動(dòng)力學(xué)由時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定[11]，使用新鮮無(wú)菌脫纖維羊血進(jìn)行藥物溶血活性實(shí)驗(yàn)[12]，藥物對(duì)于人陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7的毒性采用MTT法，按文獻(xiàn)方法測(cè)定細(xì)胞死亡率[13]。

1.5 藥物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用加速實(shí)驗(yàn)法研究藥物的穩(wěn)定性，配制一系列不同pH值（pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的C12-R-OEt水溶液（0.05%），每一種pH值的樣品均分為兩份，放入兩個(gè)容器中密封，其中一個(gè)作為對(duì)照樣，冷藏保存；另一個(gè)于95℃水浴中加熱1 h，然后自然冷卻至室溫，與對(duì)照樣一起進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)含量（C）。

采用t0.9法（藥物分解10%的時(shí)間）測(cè)定藥物的理論有效期[14]：5份C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0的0.1 mol·L－1醋酸鈉緩沖溶液）分別放在5個(gè)恒溫水浴中加速分解，對(duì)照樣冷藏保存，分別在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣（60℃，2.5 h，3 h）、（65℃，2.0 h，2.5 h）、（70℃，1.5 h，2 h）、（75℃，1.0 h，1.5 h）、（80℃，0.5 h，1 h），觀察產(chǎn)品外觀，與對(duì)照樣一起進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)含量（C）。以相對(duì)含量的對(duì)數(shù)（lgC）對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，通過(guò)不同溫度T的擬合曲線，計(jì)算出各T的t0.9，再以各T的lgt0.9對(duì)（1/T）進(jìn)行線性擬合，即可計(jì)算出任意溫度下藥物的理論有效期。

采用Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色 譜 柱，流動(dòng)相A為0.01%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為0.01%三氟乙酸乙腈溶液，洗脫梯度（0～15 min，20%～85%B；15～17 min，85%B；17～20 min，85%～20%B），流速1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.6 多次陰道刺激性實(shí)驗(yàn)

委托有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)（蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心）進(jìn)行家兔多次陰道黏膜刺激實(shí)驗(yàn)，依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）[15]，受試物為C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），對(duì)照組為0.9%氯化鈉注射液，報(bào)告編號(hào)為HWY201800750。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌活性

2.1.1 抗菌敏感性實(shí)驗(yàn) 表1列出了本文研究的AACS、SSLP以及作為對(duì)照的CCS對(duì)三種標(biāo)準(zhǔn)菌株（革蘭氏陰性菌E.coli、革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus和真菌C.albicans）的MIC和MMC，及對(duì)L.crispatus的MIC和MMC，并計(jì)算出選擇性系數(shù)（SR），SR定義為L(zhǎng).crispatus和C.albicans MIC的比值（MICL.c./MICC.a.），SR越大意味著相對(duì)于陰道正常菌群，藥物對(duì)于真菌有更好的選擇性抑制作用。從表1可見，除了C20-R-OEt 對(duì)于真菌的MIC和MMC＞256 μg·mL－1之外，其他藥物對(duì)于這三種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC為4～256 μg·mL－1，MMC為1×MIC或者2×MIC，都顯示出良好的殺菌活性。

表1 測(cè)試藥物的抗菌活性和對(duì)真菌的選擇性(μg·mL－1)Tab 1 Antimicrobial activity and fungal selectivity of the test drug (μg·mL－1)

具體來(lái)說(shuō)，兩種SSLP顯示出中等的殺菌活性（脂二肽MIC在16～64 μg·mL－1，脂五肽MIC在8～32 μg·mL－1，SR＝8）。文獻(xiàn)報(bào)道富含精氨酸（R）和色氨酸（W）的多肽和脂肽具有最高的抗菌活性，并推薦脂五肽C10-RKWWKNH2作為很有潛力的抗菌藥物[7]。但是本研究表明，這種脂五肽并沒(méi)有顯示出比別的測(cè)試藥物更好的抗菌活性和更高的真菌選擇性。四種脂二肽（C16-RR-NH2、C16-KK-NH2、C16-RK-NH2和C16-KR-NH2）的MIC、MMC和SR都相差不大，說(shuō)明精氨酸和賴氨酸的不同組合及順序?qū)咕钚詻](méi)有什么影響。兩種CCS（苯扎溴銨和醋酸氯己定）都有較好的抗菌能力（MIC在4～16 μg·mL－1，SR在8～16）。需要指出的是，Nα-?；彼嵋阴タ咕钚噪S?；奶?xì)滏滈L(zhǎng)的增加表現(xiàn)出鐘形曲線的變化趨勢(shì)，與SSLP和CCS相較而言，C12-R-OEt和C14-R-OEt對(duì)于細(xì)菌（E.coli和S.aureus）具有更好的抗菌活性（MIC在8～16 μg·mL－1，SR＝16），C16-R-OEt和C18-R-OEt對(duì)于真菌C.albicans具有更好的抗菌活性（MIC＝4 μg·mL－1，SR＝16）。

2.1.2 殺菌動(dòng)力學(xué) 從圖1殺菌速度曲線可以得出測(cè)試藥物完全殺滅三種標(biāo)準(zhǔn)菌株所需的最短時(shí)間。藥物濃度對(duì)于細(xì)菌和真菌分別設(shè)置為1×MMC和2×MMC，在這些濃度下，100%菌株會(huì)在24 h內(nèi)被完全殺滅，當(dāng)作用時(shí)間限制在20 min時(shí)，測(cè)試藥物表現(xiàn)出不同的殺菌動(dòng)力學(xué)特征。C12-R-OEt 和C10-RKWWK-NH2有最快的殺菌速度，在2～10 min內(nèi)殺滅了100%的E.coli（見圖1A）和S.aureus（見圖1B），C12-R-OEt 和 C14-R-OEt 殺真菌的速度最快，2 min內(nèi)就殺滅了全部的C.albicans（見圖1C）。其他測(cè)試藥物的殺菌速度都要慢一些（有些數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示在圖1中）。圖1的結(jié)果說(shuō)明，從殺滅三種標(biāo)準(zhǔn)菌株的速度來(lái)看，C12-R-OEt性能最佳，C10-RKWWK-NH2次之。

圖1 殺菌動(dòng)力學(xué)Fig 1 Microbicidal kinetics

2.1.3 對(duì)于耐藥菌株的抗菌活性P.aeruginosa是一種對(duì)于很多抗菌藥物有天然耐藥性的條件致病菌，MRSA不僅對(duì)于甲氧西林耐藥，對(duì)于許多抗菌藥物也耐藥。表2是測(cè)試藥物對(duì)于這兩種耐藥菌株的MIC和MMC。除了醋酸氯己定，其他的測(cè)試藥物都能抑制和殺滅這兩種耐藥菌株（MIC在4～256 μg·mL－1，MMC在16～256 μg·mL－1），具體來(lái)說(shuō)，P.aeruginosa能夠被完全殺滅，雖然需要的藥物質(zhì)量濃度可能較高（MMC＝MIC在8～256 μg·mL－1），而在藥物較低質(zhì)量濃度時(shí)MRSA的生長(zhǎng)和繁殖就受到抑制（MIC在4～8 μg·mL－1），當(dāng)藥物質(zhì)量濃度增加，MRSA也會(huì)被完全殺滅（MMC在16～64 μg·mL－1），其中C10-RKWWK-NH2和C14-R-OEt對(duì)于這兩種耐藥菌株都表現(xiàn)出最強(qiáng)的殺菌活性。

表2 測(cè)試藥物對(duì)耐藥菌株的抗菌活性(μg·mL－1)Tab 2 Antimicrobial activity to resistant strains of the test drug(μg·mL－1)

2.2 溶血率和細(xì)胞毒性

表3列出了測(cè)試藥物對(duì)于羊血的溶血活性以及對(duì)于人陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除C20-R-OEt（HC50＝128 μg·mL－1）外，不同?；滈L(zhǎng)的Nα-?；彼嵋阴サ娜苎钚詻](méi)有太大差異（HC50＝30～48 μg·mL－1），而兩種SSLP之間以及兩種CCA之間則相差較大。細(xì)胞毒性方面，Nα-酰基精氨酸乙酯的細(xì)胞毒性隨?；奶?xì)滏滈L(zhǎng)增加而增大（IC50從C12-R-OEt的66 μg·mL－1減 小 到C20-R-OEt的1.2 μg·mL－1）；兩種SSLP疏水的碳?xì)滏滈L(zhǎng)不同，細(xì)胞毒性也是隨著碳?xì)滏滈L(zhǎng)增加而增大；兩種CCA細(xì)胞毒性都較大（IC50為6.5和7 μg·mL－1）。很明顯，藥物對(duì)于紅細(xì)胞和人陰道上皮細(xì)胞的毒性不一樣，用溶血活性來(lái)評(píng)估SSLP對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性[3，7，16]是不充分的，本文的結(jié)果說(shuō)明，作為一種簡(jiǎn)化的體外藥物安全性評(píng)估手段，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)不能僅用紅細(xì)胞，還應(yīng)該根據(jù)給藥途徑，使用相應(yīng)組織細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。

表3中還列出了針對(duì)真菌C.albicans的治療指數(shù)（HC50/MICC.a.和IC50/MICC.a），從這兩個(gè)指標(biāo)綜合來(lái)看，最安全的藥物是 C12-R-OEt（HC50/MICC.a.＝6，IC50/MICC.a.＝8.5），其他藥物安全性都相對(duì)較差。值得指出的是，C10-RKWWKNH2和醋酸氯己定，從溶血活性的角度來(lái)看比較安全（HC50/MICC.a.在8～16），但是從對(duì)VK2/E6E7的細(xì)胞毒性角度來(lái)看，安全性較差（IC50/MICC.a在0.8～2.3）。

表3 測(cè)試藥物對(duì)綿羊紅細(xì)胞和人陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7的細(xì)胞毒性(μg·mL－1)Tab 3 Toxicity to ovine erythrocytes and human vaginal epithelial cells VK2/E6E7 of the test drug (μg·mL－1)

2.3 誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生情況

綜合以上結(jié)果，我們選擇抑菌活性和安全性都較好的C12-R-OEt繼續(xù)進(jìn)行研究，同時(shí)以C10-RKWWK-NH2和醋酸氯己定為對(duì)照，通過(guò)30 d連續(xù)給藥，每日測(cè)定MIC（見圖2）。從圖2C可以 看 出，C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2對(duì) 于C.albicans的MIC變化很小，30 d內(nèi)MIC只增加了一倍（C12-R-OEt的MIC從4 μg·mL－1變?yōu)? μg·mL－1，C10-RKWWK-NH2的MIC從16 μg·mL－1變?yōu)?2 μg·mL－1），而醋酸氯己定的MIC變化很大，30 d內(nèi)MIC增加了7倍（MIC從8 μg·mL－1變 為64 μg·mL－1）。C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2對(duì) 于E.coli（見 圖2A）和S.aureus（見圖2B）的MIC呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，說(shuō)明同為氨基酸基陽(yáng)離子兩親性化合物，不易誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生。有研究認(rèn)為帶正電荷的AMP和SSLP通過(guò)靜電作用力結(jié)合到帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜上，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞而死亡[1，17]，本研究推測(cè)C12-R-OEt具有同樣的作用機(jī)制。雖然多黏菌素也有類似的機(jī)制，且近些年多黏菌素的耐藥率有增加趨勢(shì)，但是多黏菌素對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌作用仍然頗強(qiáng)[18]，而從表1的結(jié)果來(lái)看，本文的測(cè)試藥物對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的活性相當(dāng)，說(shuō)明包括C12-R-OEt在內(nèi)的測(cè)試藥物與多黏菌素的抗菌作用機(jī)制有所不同，具體作用機(jī)制有待研究。

需要指出的是，雖然醋酸氯己定對(duì)兩種耐藥菌株有很好的抗菌活性（MIC＝4～8 μg·mL－1，MMC＝8～32 μg·mL－1），但是考慮到其對(duì)人陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7細(xì)胞毒性較大（IC50/MICC.a.＝0.8），且誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生的傾向較大（見圖2），不適合作為念珠性陰道炎外用治療藥物。

圖2 誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)Fig 2 Serial passage experiments for resistance induction

本文還做了交叉耐藥實(shí)驗(yàn)，取醋酸氯己定連續(xù)給藥30 d后，MIC已經(jīng)增大7倍的菌株，轉(zhuǎn)而給 藥C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIC與各自的初試值相同，說(shuō)明對(duì)醋酸氯己定已經(jīng)開始產(chǎn)生耐藥的菌株，仍然對(duì)C12-R-OEt 和C10-RKWWK-NH2敏感，說(shuō)明C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2的抑菌機(jī)制可能與CCS不同。

2.4 穩(wěn)定性

加速實(shí)驗(yàn)法測(cè)定了不同pH條件下 C12-ROEt水溶液的穩(wěn)定性，以C10-RKWWK-NH2為對(duì)照，95℃ 加熱 1 h 后，C12-R-OEt含量隨pH變化呈鐘形變化趨勢(shì)，pH較低或較高時(shí)（pH 1～2和pH 7～9），C12-R-OEt的含量顯著降低（超過(guò)15%），當(dāng)pH為3～6特別是pH為 3～4時(shí)，C12-R-OEt含量基本沒(méi)有變化（回收率超過(guò)98%），C10-RKWWK-NH2水溶液比較穩(wěn)定（pH 4時(shí)回收率為96%，pH 7時(shí)回收率為98%），并且水溶液的外觀均無(wú)變化。然而當(dāng)以固體形式于4℃儲(chǔ)存12個(gè)月后，C12-R-OEt固體與初試狀態(tài)無(wú)異，C10-RKWWK-NH2已經(jīng)潮解，顏色也從白色變成棕黃色，說(shuō)明C10-RKWWK-NH2穩(wěn)定性較差。原因可能是其富含色氨酸，色氨酸是一種不穩(wěn)定的氨基酸，在多肽鏈中容易分解著色，說(shuō)明從化學(xué)穩(wěn)定性角度，設(shè)計(jì)開發(fā)SSLP作為臨床抗菌藥物時(shí)應(yīng)避免使用色氨酸，即便富含色氨酸的脂肽抗菌活性較好[7]。

通過(guò)以上加速實(shí)驗(yàn)法確定將C12-R-OEt配制成pH 4的水溶液使用（0.05%，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），與陰道的pH環(huán)境基本一致。通過(guò)t0.9法預(yù)測(cè)其保質(zhì)期，首先以相對(duì)含量的對(duì)數(shù)（lgC）對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出各T的t0.9，結(jié)果見表4，以各T的lgt0.9對(duì)（1/T）進(jìn)行線性擬合，得到：lgt0.9＝7185.1（1/T）－20.0（r2＝0.9923），據(jù)此計(jì)算出保質(zhì)期約為1.5年（298 K），可見該溶液比較穩(wěn)定，可以開發(fā)為臨床使用的洗液。

表4 不同溫度(T)時(shí)lg C 對(duì)時(shí)間(t)的線性回歸方程及t0.9 Tab 4 Linear regression equation of lg C versus (t) at different temperatures (T) and t0.9

2.5 陰道黏膜刺激實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上研究結(jié)果，C12-R-OEt具有作為陰道抗菌洗液的潛力，故對(duì)其進(jìn)行了多次家兔陰道黏膜刺激實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組為C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），對(duì)照組為0.9%氯化鈉注射液。陰道解剖觀察結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組3只動(dòng)物中有2只出現(xiàn)充血，1只出現(xiàn)水腫，對(duì)照組3只動(dòng)物中1只出現(xiàn)充血，未見其他異常反應(yīng)。根據(jù)組織學(xué)觀察結(jié)果對(duì)陰道黏膜的刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平均計(jì)分為7.33 和 6.56，據(jù)此計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組的刺激指數(shù)為0.77，根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》[15]，刺激指數(shù)＜1為“無(wú)刺激性”，所以C12-R-OEt對(duì)家兔陰道黏膜刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果為無(wú)刺激性。

3 結(jié)論

三種氨基酸基陽(yáng)離子表面活性劑（C12-ROEt，C14-R-OEt 和C16-R-OEt）、兩種短脂肽（C10-RKWWK-NH2和C16-RK-NH2）和一種經(jīng)典陽(yáng)離子表面活性劑（醋酸氯己定）對(duì)于三種標(biāo)準(zhǔn)菌株（革蘭氏陰性菌E.coli、革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus和真菌C.albicans）都有抗菌活性，對(duì)耐藥菌株（P.aeruginosa和MRSA）也有很好的抑制作用；除了醋酸氯己定，都不易誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生；C12-R-OEt具有最快的殺菌速度，C10-RKWWK-NH2次之。

短脂肽的溶血活性較小，但是對(duì)于人陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7的毒性較大，所以短脂肽可以替代經(jīng)典陽(yáng)離子表面活性劑用于器械消毒，但是不適于作為念珠性陰道炎的候選藥劑，提示在設(shè)計(jì)抗菌脂肽時(shí)要尋找新的疏水片段代替脂肪酸鏈，如具有疏水側(cè)鏈的氨基酸。

C12-R-OEt結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易合成，對(duì)于念珠菌敏感，不易誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生，安全性高，穩(wěn)定性好，對(duì)陰道黏膜無(wú)刺激性，最有潛力開發(fā)為念珠性陰道炎抗菌洗液。