高良姜素過飽和自納米乳的制備及質(zhì)量評價

方杰，李顏伶，秦銘，吉莉，徐廣，馬群（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

高良姜素（galangin）是從姜科多年生草本植物高良姜的根及根莖中提取的黃酮類活性成分[1]?，F(xiàn)代研究表明，高良姜素在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、降尿酸等方面具有較好的藥理作用。但高良姜素在水中溶解度較差，導(dǎo)致其進(jìn)入體內(nèi)吸收少，生物利用度較低，嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用[2]。近年來，已有學(xué)者通過納米粒[3]、自微乳[4]等增溶技術(shù)改善高良姜素的溶解度，但仍存在制備工藝復(fù)雜、穩(wěn)定性差等問題。因此，尋找一種制備工藝簡單、穩(wěn)定性好的增溶技術(shù)來改善高良姜素的溶解度及釋放度，成為目前亟待解決的問題。

過飽和自納米乳遞藥系統(tǒng)（supersaturating self-nanoemulsifying drug delivery systems，SSNEDDS）是在自納米乳遞藥系統(tǒng)（self-nanoemulsifying drug delivery systems，SNEDDS）的基礎(chǔ)上加入水溶性纖維聚合材料或兩親性聚合物等促過飽和物質(zhì)形成的，能夠有效抑制或延緩自納米乳進(jìn)入體內(nèi)后的析晶情況[5]。過飽和自納米乳既能提高難溶性藥物的溶解度，又能維持藥物的過飽和狀態(tài)，達(dá)到延長藥物在體內(nèi)的吸收時間，提高藥物生物利用度的目的；同時過飽和自納米乳還可避免使用大量表面活性劑而帶來的安全問題。因此，為解決高良姜素水溶性差、生物利用度低的問題，本試驗采用過飽和自納米乳技術(shù)來增溶高良姜素，結(jié)合星點設(shè)計-效應(yīng)面法、體外溶出試驗等篩選優(yōu)化高良姜素過飽和自納米乳處方，并對其理化性質(zhì)、過飽和度、體外釋放及穩(wěn)定性等進(jìn)行評價，以期增加高良姜素溶解度，改善藥物口服吸收，為高良姜素新劑型的研發(fā)及其他難溶性藥物水溶性的改善提供依據(jù)。

1 材料

BT 125D電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；XW-80A渦旋混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；XZQ-QX全溫振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司），RCT Basic磁力攪拌器（IKA）；Eclipse E200偏光顯微鏡（Nikon）；JEM-1400Flash透射電子顯微鏡（日本電子）；ZRS-8G智能溶出試驗儀（天大天發(fā)）；Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀（Malvern）。

高良姜素對照品（批號：B20430，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；高良姜素原料藥（批號：DST210511-020，HPLC≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯（isopropyl myristate，IPM）、丙三醇（glycerol）、羥丙基甲基纖維素K4M（HPMC K4M）、羥丙基甲基纖維素 E6（HPMC E6）（上海麥克林生化科技有限公司）；油酸乙酯（Ethyl Oleate，EO）、中鏈甘油三酯（MCT）、吐溫80（Tween 80）、聚乙二醇400（PEG 400）、聚乙二醇4000（PEG 4000）、聚乙二醇6000（PEG 6000）、蘇丹紅、亞甲藍(lán)（源葉生物）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M1944CS）、丙二醇辛酸酯（Capryol 90）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）、二乙二醇單乙基醚（Transcutol HP）（法國嘉法獅公司，由廣州天潤藥業(yè)有限公司贈送樣品）；聚氧乙烯蓖麻油（Kolliphor ELP）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Kolliphor RH 40）、聚乙二醇15羥基硬脂酸酯（Solutol HS15）、聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）（巴斯夫股份公司，由北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司贈送樣品）；甲醇（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化鈉、磷酸二氫鉀（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；1，2-丙二醇（1，2-propanediol）、氫氧化鈉、鹽酸（北京化工廠）；蒸餾水（屈臣氏）；聚乙烯吡咯烷酮K90（PVP K90）、聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，山河藥輔）。

2 方法與結(jié)果

2.1 高良姜素含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液（64∶36），等度洗脫；流速為1.0 mL·min－1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為266 nm。

2.1.2 溶液配制 精密稱量高良姜素對照品10.0 mg置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解，定容至刻度，即得1.0 mg·mL－1的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液，加適量甲醇稀釋，分別配制成高（100 μg·mL－1）、中（50 μg·mL－1）、低（20 μg·mL－1）質(zhì)量濃度的對照品溶液。

2.1.3 專屬性考察 稱取0.1 g空白過飽和自納米乳（固定油相、表面活性劑和助表面活性劑總質(zhì)量為1 g，按比例精密稱定各組分，磁力攪拌均勻后，加入促過飽和物質(zhì)0.3 g，渦旋混勻，超聲助溶，置于37 ℃全溫振蕩器中靜置24 h，即得空白過飽和自納米乳），并取1 mL高良姜素對照品儲備液，分別加入適量甲醇稀釋至100μg·mL－1，進(jìn)樣測定，并記錄圖譜。結(jié)果高良姜素峰形良好，空白溶劑在出峰處無干擾，表明該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 空白過飽和自納米乳（A）和高良姜素對照品（B）的液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of blank SSNEDDS（A）and galangin reference solution（B）

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品儲備液，加適量甲醇稀釋，配制成0.8、2、10、20、50、100 μg·mL－1系列質(zhì)量濃度的高良姜素對照品溶液，進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y＝4.245×104X－1.407×104，R2＝1.000。結(jié)果表明高良姜素在0.8～100 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察 取“2.1.2”項下高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，考察日內(nèi)精密度；同法操作，連續(xù)6 d相同時間測定樣品，記錄峰面積，考察日間精密度。經(jīng)計算，高良姜素高、中、低濃度對照品溶液日內(nèi)精密度峰面積的RSD分別為0.36%、0.20%、0.72%；日間精密度峰面積的RSD分別為0.34%、0.22%和0.33%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察 取“2.1.2”項下高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液各6份，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。經(jīng)計算，高良姜素高、中、低濃度對照品溶液峰面積的RSD分別為0.36%、0.060%和0.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取“2.1.2”項下高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液，放置于室溫下，分別于0、2、4、8、12、24 h取樣測定，記錄峰面積。經(jīng)計算，高良姜素高、中、低濃度對照品溶液峰面積的RSD分別為0.28%、0.17%和0.19%，表明高良姜素的穩(wěn)定性良好。

2.1.8 回收率考察 精密量取“2.1.2”項下高良姜素對照品儲備液，稀釋不同倍數(shù)，加入到空白過飽和自納米乳中，配制成高（100 μg·mL－1）、中（50 μg·mL－1）、低（20 μg·mL－1）質(zhì)量濃度的供試品溶液，進(jìn)樣分析并計算其回收率，結(jié)果高良姜素高、中、低濃度供試品溶液的回收率分別為101.16%、101.40%、98.99%，RSD值分別為1.1%、0.20%和1.6%，表明方法回收率符合要求。

2.2 緩沖溶液的制備

按《中國藥典》2020年版四部緩沖溶液的配制方法配制pH 4.5緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH 6.8和pH 7.4為PBS緩沖液。另稱取氯化鈉2.52 g，加水900 mL，用70 g·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為1.2，加水稀釋定容至1000 mL，即得到pH 1.2的酸性氯化鈉溶液。

2.3 高良姜素在不同輔料中的平衡溶解度考察

稱取過量的高良姜素原料藥于15 mL具塞離心管中，分別加入等量不同的油相（Capryol 90、Labrafil M1944CS、IPM、MCT、EO）、表面活性劑（Labrasol、Kolliphor ELP、Tween 80、Solutol HS15、Kolliphor RH 40）和助表面活性劑（Transcutol HP、Ethanol anhydrous、PEG 400、1，2-propanediol、Glycerol），渦旋混勻，以（37±0.5）℃，100 r·min－1振 蕩24 h，充分平衡后 以9000 r·min－1離心15 min，取上清液加入適量甲醇稀釋，濾過，進(jìn)樣分析，計算高良姜素在各輔料中的溶解度。結(jié)果顯示，高良姜素在油相中的平衡溶解度大小依次為Capryol 90（8.43 mg·g－1）＞Labrafil M1944CS（3.40 mg·g－1）＞IPM（2.58 mg·g－1）＞MCT（2.56 mg·g－1）＞EO（2.31 mg·g－1）；在表面活性劑中的平衡溶解度大小依次為Labrasol（10.93 mg·g－1）＞Kolliphor ELP（10.21 mg·g－1）＞Tween 80（7.23 mg·g－1）＞Solutol HS15（7.17 mg·g－1） ＞Kolliphor RH40（6.28 mg·g－1）；在助表面活性劑中的平衡溶解度大小依次為Transcutol HP（144.49 mg·g－1）＞Ethanol anhydrous（22.34 mg·g－1）＞PEG 400（7.75 mg·g－1）＞1，2-propanediol（7.37 mg·g－1）＞Glycerol（2.91 mg·g－1）。因此，油相選擇Capryol 90和Labrafil M1944CS，表面活性劑和助表面活性劑選擇溶解能力較好的4種。

2.4 油相與表面活性劑的配伍試驗

將油相和表面活性劑以1∶9～6∶4的質(zhì)量比，以總質(zhì)量為1 g準(zhǔn)確稱定各組分，磁力攪拌器[（37±0.5）℃，400 r·min－1]攪拌混勻，加入100倍量蒸餾水，觀察并記錄乳化情況，按照目測評分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行評價，A/B級視為乳化效果良好，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。試驗得到Labrafil M1944CS與Kolliphor ELP和Solutol HS15在 設(shè)定比例下配伍后乳化效果較好；而Capryol與各表面活性劑配伍后乳化效果均較差。因此，選擇Labrafil M1944CS為 油 相，Kolliphor ELP和Solutol HS15為表面活性劑進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 乳化效果評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Evaluation standard of emulsification effect

2.5 助表面活性劑的篩選

固定總質(zhì)量為1 g，將表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比（Km）固定為1∶1。按質(zhì)量比1∶9～4∶6準(zhǔn)確稱取油相和混合表面活性劑（表面活性劑與助表面活性劑）于西林瓶中，攪拌混合均勻，加入100倍量蒸餾水中，觀察乳化情況。結(jié)果顯示，Labrafil M1944CS為油相，Kolliphor ELP為表面活性劑，PEG 400為助表面活性劑時在各比例下自乳化評價結(jié)果均為A級，高于其他組方，故選擇Kolliphor ELP為表面活性劑，PEG 400為助表面活性劑。

2.6 偽三元相圖的構(gòu)建

將表面活性劑與助表面活性劑按質(zhì)量比9∶1～1∶9混合均勻，再與油相按質(zhì)量比9∶1～4∶6 混勻。取0.1 g分散至100倍量蒸餾水中，觀察乳化情況，記錄評分為A/B級的處方比例，采用Origin 2018軟件繪制偽三元相圖，見圖2。根據(jù)結(jié)果確定各相（Labrafil M1944CS，Kolliphor ELP和PEG 400）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的取值范圍分別為10%～60%、15%～80%、5%～70%。

圖2 空白自納米乳偽三元相圖Fig 2 Pseudo-ternary phase diagram of blank SNEDDS

2.7 高良姜素自納米乳處方優(yōu)化

2.7.1 星點設(shè)計-效應(yīng)面法 以油相的百分含量（X1：10%～60%）、Km（X2：0.25～4）為考察因素，以粒徑（Y1）、多分散系數(shù)PDI（Y2）作為評價指標(biāo)。采用兩因素五水平（±α、0、±1）的星點設(shè)計法確定油相和Km的具體用量。因素水平見表2。按照Design Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計的試驗方案對輔料進(jìn)行準(zhǔn)確稱重制備自納米乳，取適量加入到100倍量蒸餾水中，攪拌均勻，得到水分散液，用納米粒徑電位分析儀測定其粒徑及PDI。高良姜素自納米乳不同試驗設(shè)計的效應(yīng)值結(jié)果見表3。

表2 試驗設(shè)計的因素水平及響應(yīng)值Tab 2 Factor，level and response values of test design

表3 星點設(shè)計試驗因素水平與結(jié)果Tab 3 Factor and level in central composite design

2.7.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，Y1、Y2采用二次多項式回歸擬合效果較好。擬合方程如下：

粒徑：Y1＝32.92＋25.55X1－17.66X2－11.58X1X2＋10.21X12＋15.49X22（R2＝0.9650，P＜0.0001）

PDI：Y2＝0.054＋0.046X1＋0.015X2－0.079X1X2＋0.11X12＋0.091X22（R2＝0.9617，P＜0.0001）

由上述方程可知，Y1和Y2的二次多項式回歸方程的回歸系數(shù)均＞0.9，表明方程的擬合效果較好，且P＜0.05，說明結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3D響應(yīng)面圖和等高線圖可直觀反應(yīng)出各因素與響應(yīng)值及各因素間的交互作用[7]。如圖3、4，在各取值范圍內(nèi)，固定一因素，粒徑隨油相百分含量的增加而增大，隨Km的增大而減??；PDI隨油相的增大及Km的增大呈先減小后增大的趨勢。試驗按照粒徑和PDI最小進(jìn)行處方優(yōu)化，得到高良姜素自納米乳的最佳處方為油相百分含量為26.68%，Km為2.10。即Labrafil M1944CS∶Kolliphor ELP∶PEG 400＝26.68%∶49.67%∶23.65%。

圖3 油相濃度和Km的交互作用對粒徑影響的3D響應(yīng)曲面和等高線圖Fig 3 3D response surface and contour map of the interaction between oil phase concentration and Km on particle size

圖4 油相濃度和Km的交互作用對PDI影響的3D響應(yīng)曲面和等高線圖Fig 4 3D response surface and contour map of the interaction between oil phase concentration and Km on PDI

2.7.3 最優(yōu)條件的驗證 根據(jù)優(yōu)化的處方平行制備3批自納米乳，分別測定其粒徑及PDI，計算兩者的偏差，驗證模型預(yù)測的可靠性。模型預(yù)測粒徑和PDI分別為23.44 nm、0.056，實測值分別為（23.92±0.07）nm和（0.054±0.01），計算偏差分別為2.04%和3.57%，表明所建立模型的預(yù)測性良好，準(zhǔn)確度較高。

2.8 高良姜素過飽和自納米乳處方優(yōu)化

2.8.1 促過飽和物質(zhì)種類的篩選 按照處方制備空白自納米乳，再分別加入過量的高良姜素原料藥和等量的促過飽和物質(zhì)（PVP K30、PVP K90、CMCNa、HPMC K4M、HPMC E6、Soluplus、PEG 4000、PEG 6000），超聲助溶并于37℃恒溫攪拌混勻，置于37℃水浴中靜置24 h得到高良姜素過飽和自納米乳。取適量過飽和自納米乳分散于100倍量蒸餾水中，測定粒徑、PDI和Zeta電位。另取適量過飽和自納米乳分散至100倍量蒸餾水中，靜置，每隔一定時間以3000 r·min－1離心20 min，取下層液體置于偏振光顯微鏡下觀察其析晶情況。結(jié)果顯示，PVP K30和Soluplus與高良姜素自納米乳處方相容性較好，且粒徑小于100 nm，24 h內(nèi)抑晶效果較好，其他促過飽和物質(zhì)與自納米乳處方相容性較差，且抑晶效果相對較差。因此，初步選擇PVP K30和 Soluplus作為該處方的促過飽和物質(zhì)。

2.8.2 促過飽和物質(zhì)用量的篩選

① 促過飽和物質(zhì)的種類及用量范圍：根據(jù)處方制備高良姜素自納米乳，分別加入不同量的PVP K30和Soluplus，渦旋混勻，超聲助溶，于37℃全溫振蕩器中靜置24 h，制得高良姜素過飽和自納米乳，按照“2.8.1”項下操作觀察其析晶情況，并對其粒徑及PDI進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，PVP K30的用量與處方的相容性成負(fù)相關(guān)，與抑晶效果成正相關(guān)。而Soluplus的用量在0.1%～1.0%內(nèi)，與處方的相容性和抑晶效果均較好，成正相關(guān)且粒徑和PDI較小。因此選擇Soluplus作為該處方的促過飽和物質(zhì)。

② 體外溶出度試驗：采用磁力攪拌法[8]對Soluplus的用量進(jìn)行篩選。分別稱取適量含有等量高良姜素的自納米乳和過飽和自納米乳，分散至50 mL蒸餾水中，于 0.5、1、2、4、8、16 h 取樣2 mL，同時補加等量蒸餾水，平行3份，濾過，按 “2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算高良姜素的累積溶出度，繪制體外溶出曲線和高良姜素的質(zhì)量濃度-時間曲線下面積（AUC），見圖5。由結(jié)果可知，AUC大小為：1.0% Soluplus＞0.3% Soluplus≈0.5% Soluplus＞0.1% Soluplus＞高良姜素自納米乳。不同用量的Soluplus均有一定程度的抑晶效果，高良姜素過飽和自納米乳的AUC較高良姜素自納米乳均有顯著增加。而①中結(jié)果顯示，1.0% Soluplus處方的PDI較大且乳化時間較長，綜合考慮確定處方中促過飽和物質(zhì)Soluplus的用量為0.3%，即3.0 mg·g－1。

圖5 不同用量促過飽和物質(zhì)處方中高良姜素體外溶出曲線（A）和AUC（B）（n＝3）Fig 5 In vitro dissolution curve（A）and AUC value（B）of galangin in prescription of supersaturated substances with different dosages（n＝3）

2.8.3 高良姜素過飽和自納米乳投藥量考察 按各相平衡溶解度之和110%、130%和150%的投藥量，制備高良姜素過飽和自納米乳。取適量分散于37℃的不同pH介質(zhì)中，100 r·min－1攪拌，于不同時間點取樣1 mL，濾過，甲醇稀釋適宜倍數(shù)后進(jìn)樣分析，GraphPad Prism 8.0軟件繪制濃度-時間曲線，結(jié)果如圖6。由結(jié)果可知，在兩種分散介質(zhì)中，高良姜素過飽和自納米乳的釋放量均顯著高于高良姜素自納米乳，且當(dāng)投藥量超過一定范圍后，會導(dǎo)致制劑不穩(wěn)定。130%投藥量的高良姜素過飽和自納米乳在各pH介質(zhì)的釋放量相對較高且恒定。因此，確定高良姜素投藥量為130%，即28.0 mg·g－1。

圖6 不同pH介質(zhì)中不同載藥量高良姜素濃度-時間曲線Fig 6 Concentration-time curve of galangin with different drug loading in different pH media

2.9 高良姜素過飽和自納米乳體外評價

2.9.1 外觀性狀 高良姜素原料藥為黃色粉末，制得空白過飽和自納米乳為無色透明略黏稠液體。加入高良姜素制備高良姜素過飽和自納米乳，為金黃色黏稠液體，如圖7A。加水分散后得到略泛藍(lán)光、澄清透明的微乳液。

平行取兩份高良姜素過飽和自納米乳0.4 g，分散至40 mL蒸餾水中。分別加入蘇丹紅和亞甲藍(lán)染料，觀察兩種染料的擴散速度。若紅色擴散快，說明微乳為W/O型，反之則為O/W型。結(jié)果如圖7B所示，亞甲藍(lán)染料在乳液中快速擴散。因此，制備得到的高良姜素過飽和自納米乳經(jīng)自乳化后得到O/W型乳劑。

圖7 高良姜素過飽和自納米乳（A）和其分散液（B）外觀性狀及類型鑒別Fig 7 Appearance and type of galangin-SSNEDDS（A）and its dispersion（B）

2.9.2 粒徑分布及自乳化速率 取適量高良姜素自納米乳和過飽和自納米乳分散至100倍蒸餾水中，計時并測定分散液的粒徑、PDI及Zeta電位，平行3次，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，高良姜素過飽和自納米乳與自納米乳的乳化效率、粒徑和電位的差異相對較小，兩種劑型的粒徑均較小且分布較為集中。

表4 高良姜素遞藥系統(tǒng)粒徑分布及自乳化效率結(jié)果(n＝3)Tab 4 Particle size distribution and self-emulsifying efficiency of galangin drug delivery system (n＝3)

2.9.3 形態(tài)學(xué)考察 取高良姜素過飽和自納米乳和高良姜素自納米乳，分散至50倍蒸餾水中，取一滴垂直滴加至銅網(wǎng)正面，室溫下自然陰干，于37℃烘箱中過夜，形成薄膜后，置于透射電鏡下觀察乳液形態(tài)并拍照。結(jié)果如圖8所示，觀察到高良姜素自納米乳乳滴形狀呈圓球形，粒徑在20～30 nm，大小分布均勻；加入高分子材料后形成高良姜素過飽和自納米乳經(jīng)分散后粒徑仍小于200 nm，呈圓球形或橢球形，符合納米制劑要求。

圖8 高良姜素過飽和自納米乳（A）和高良姜素自納米乳（B）的形態(tài)學(xué)觀察Fig 8 Morphology of galangin-SSNEDDS（A）and galangin-SNEDDS（B）

2.9.4 體外過飽和度評價 取空白自納米乳，加入100倍量37℃的不同pH介質(zhì)中，100 r·min－1攪拌至分散均勻，得到空白膠束溶液，加入過量高良姜素充分溶解，在“2.1.1”項色譜條件下測定高良姜素在空白膠束中的含量，計算溶解度（C空白）。另取載藥量為2.8%的高良姜素過飽和自納米乳和高良姜素自納米乳適量，分散于100倍量不同pH介質(zhì)中，測定其體外稀釋過程濃度（C分散）的變化，計算過飽和度（S＝C分散/C空白），繪制折線圖。如圖9所示，高良姜素過飽和自納米乳在各pH介質(zhì)中均保持較高的過飽和度，其中在pH 1.2的酸性介質(zhì)中藥物濃度較高，說明該藥物遞送系統(tǒng)更易于在胃液中分散，有利于在胃中吸收。

圖9 高良姜素過飽和自納米乳體外過飽度Fig 9 Supersaturation in vitro evaluation of galangin-SSNEDDS

2.9.5 體外釋放度研究 采用《中國藥典》2020年版四部通則中的溶出度與釋放度測定法，分別取pH 1.2的酸性氯化鈉溶液和pH 6.8的緩沖溶液各500 mL作為釋放介質(zhì)，溫度為（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為（100±1）r·min－1。精密稱取18.0 mg高良姜素原料藥、0.65 g高良姜素自納米乳和高良姜素過飽和自納米乳（約含高良姜素18.0 mg）分別加到0號膠囊，置于溶出杯中，同時開啟溶出儀，在5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h和2 h各取樣3 mL，同時補加等量溶出介質(zhì)，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，繪制藥物體外釋放曲線。結(jié)果如圖10所示，30 min內(nèi)，高良姜素遞藥系統(tǒng)在pH 1.2酸性溶液中的釋放達(dá)到80%，在pH 6.8緩沖溶液中的釋放達(dá)到50%，顯著提高了高良姜素的釋放速度和釋放量。高良姜素過飽和自納米乳和高良姜素自納米乳在兩種介質(zhì)中未見顯著差異，但根據(jù)前期溶出度試驗可發(fā)現(xiàn)，高良姜素自納米乳在2～4 h溶出快速下降，而高良姜素過飽和自納米乳在8 h內(nèi)均保持相對穩(wěn)定的釋放。因此體外釋放度結(jié)果與溶出度試驗結(jié)果相符合，也與賴章婷[9]的研究結(jié)果相符合。

圖10 高良姜素體外釋放曲線Fig 10 In vitro release curve of galangin

2.9.6 高良姜素過飽和自納米乳初步穩(wěn)定性研究

① 室溫穩(wěn)定性：按照最優(yōu)處方制備高良姜素過飽和自納米乳，將其保存在具塞西林瓶中，在室溫下放置，分別于0、30、60、90 d取樣觀察，取適量高良姜素過飽和自納米乳分散于100倍量蒸餾水中，采用納米粒徑電位分析儀測定其粒徑及PDI；另取高良姜素過飽和自納米乳加甲醇稀釋至一定濃度，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定其含量。結(jié)果顯示，高良姜素過飽和自納米乳室溫下儲存90 d，其粒徑在30.0 nm左右，PDI小于0.300，含量高于96.0%，各項指標(biāo)變化均較小，表明高良姜素過飽和自納米乳在室溫下能夠穩(wěn)定存在。

② 不同pH條件下的穩(wěn)定性：取適量高良姜素過飽和自納米乳分散至100倍量模擬胃腸液中，置于37℃烘箱中，于設(shè)定時間點取樣，稀釋至適宜濃度后濾過，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算高良姜素含量。結(jié)果顯示，高良姜素過飽和自納米乳在pH 1.2、pH 4.5、pH 6.8和pH 7.4的分散介質(zhì)中，含量變化無顯著差異，24 h的藥物含量均在90%以上，表明高良姜素過飽和自納米乳在模擬胃腸液中穩(wěn)定性良好。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件中獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

高良姜素近年來的研究多集中在藥理作用及作用機制方面[10-14]，研究結(jié)果表明高良姜素的藥理作用廣泛，在多種疾病的治療上都具有較好的作用，但其未在臨床上廣泛使用，可能與高良姜素的水溶性極低，進(jìn)入體內(nèi)的吸收利用較差有關(guān)。關(guān)于改善其水溶性的研究相對較少，嚴(yán)重限制了高良姜素的應(yīng)用。自納米乳被認(rèn)為是脂質(zhì)制劑中改善低水溶性及口服生物利用度效果最好的劑型之一，也是口服藥物遞送系統(tǒng)中研究最多的系統(tǒng)之一[15]，但其為高濃縮狀態(tài)的藥物液體制劑，進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)乳化后形成過飽和狀態(tài)，容易析出藥物晶體分子，降低藥物在體內(nèi)的吸收分布[16]。因此，在自納米乳基礎(chǔ)上加入合適的促過飽和物質(zhì)進(jìn)一步制備成過飽和自納米乳可有效解決這一問題，其作用機制主要有氫鍵及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、分子量、黏度和疏水作用等[17]。將高良姜素制備成過飽和自納米乳既可改善高良姜素的水難溶性，又能延緩藥物體內(nèi)過飽和析出，可顯著提高藥物的生物利用度。

過飽和自納米乳的處方篩選中，油相與表面活性劑及助表面活性劑的配伍極其重要，本研究為得到較好的乳化效果，將油相分別與對藥物溶解度較大的4種表面活性劑和助表面活性劑進(jìn)行配伍篩選，以得到三者相容性和乳化效果好的處方。在自納米乳中載藥量過高會導(dǎo)致制劑的穩(wěn)定性差，一般通過減少載藥量或增加表面活性劑的用量提高制劑穩(wěn)定性，但表面活性劑的用量過大會對機體產(chǎn)生不良反應(yīng)。過飽和自納米乳能夠在保持較高載藥量的基礎(chǔ)上，減少表面活性劑的用量，得到既安全又穩(wěn)定的制劑。

在過飽和自納米乳體系中，促過飽和物質(zhì)的選擇要優(yōu)先考慮與處方的相容性，在研究中發(fā)現(xiàn)PVP K90的抑晶效果較好，但與處方相容性較差。而篩選出的Soluplus在一定范圍內(nèi)與處方相容性好，且在較低含量時仍具有較好的抑晶效果。作為一種新型的藥用高分子材料，Soluplus在難溶性給藥系統(tǒng)如口服納米膠束、包合物、過飽和自納米乳系統(tǒng)等方面已展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景[18]。

本研究對高良姜素過飽和自納米乳外觀性狀的表征、理化性質(zhì)、過飽和度、體外釋放及穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明高良姜素過飽和自納米乳的粒徑較小且分布均勻，能維持較高的過飽和度，顯著提高了高良姜素原料藥的體外釋放量，且在pH 1.2的酸性介質(zhì)中釋放更高，可為臨床應(yīng)用提供參考。穩(wěn)定性結(jié)果顯示高良姜素過飽和自納米乳在室溫條件及不同pH分散介質(zhì)中可穩(wěn)定存在。綜上所述，本研究篩選優(yōu)化得到的高良姜素過飽和自納米乳可有效改善高良姜素的水溶性，且穩(wěn)定性良好，可為高良姜素過飽和自納米乳及其他難溶性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。