藻酸鹽裂解酶對高黏液性肺炎克雷伯桿菌生物被膜的影響

肖紅梅，姜 維，劉 偉，楊雨婷，羅甫花*

（1. 邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院，邵陽 422000；2. 長沙金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，長沙 410205）

肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種革蘭氏陰性的乳糖發(fā)酵桿菌，具有突出的莢膜［1］，是醫(yī)院感染常見的致病菌之一。2020年，全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)公布的數(shù)據(jù)顯示，革蘭陰性菌中KP耐藥率排第二［2］。根據(jù)KP毒力，可將其分為兩大類，經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classicKlebsilla pneu-moniae）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsilla pneumoniae，HvKP）。HvKP能夠在年輕健康的個(gè)體中引起危及生命的社區(qū)獲得性感染，包括肝膿腫并發(fā)眼內(nèi)炎、腦膜炎、骨髓炎和壞死性筋膜炎，因此其與高發(fā)病率和死亡率有關(guān)［3］。據(jù)最新的國內(nèi)多中心研究顯示，黏液型KP的檢出率可高達(dá)73.9%，并呈明顯上升趨勢［2］。經(jīng)我院院感監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，KP檢出率在所有病原菌中排名第三。據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院統(tǒng)計(jì)，80%以上的人類微生物感染均由細(xì)菌生物被膜（bacterial biofilm，BF）引起［4］。BF是細(xì)菌的多耐藥機(jī)制之一，通過屏障作用、耐藥基因的表達(dá)等機(jī)制保護(hù)細(xì)菌逃逸宿主免疫和抗菌藥物的殺傷作用，從而產(chǎn)生對抗菌藥物高度耐藥，給臨床治療帶來難度，導(dǎo)致臨床相關(guān)感染的難治性和復(fù)發(fā)性［5-6］。KP是容易形成BF的細(xì)菌之一，它有豐富的莢膜，依靠莢膜多糖和細(xì)菌分泌的黏附分子在物體表面形成生物被膜［7］。朱冰等［8］在臨床分離KP的分布、耐藥性及生物被膜形成能力的分析中發(fā)現(xiàn)，臨床分離的KP具有較強(qiáng)的耐藥性及生物被膜形成能力。KP生物被膜形成已成為感染性疾病中的常見問題。

目前對BF的研究較多，同時(shí)其也是抗生素感染研究的熱點(diǎn)。國內(nèi)外有不少研究通過聯(lián)合用藥提高生物被膜的清除率［9-10］。藻酸鹽裂解酶（alginate lyase，AlgL）能特異性地降解藻酸鹽，降低細(xì)菌的黏附性，影響生物被膜的形成。藻酸鹽單克隆抗體能中和被膜內(nèi)的藻酸鹽，使抗生素被膜的密度降低，結(jié)構(gòu)完整性被破壞，從而提高抗生素對被膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷力。Cho等［11］在銅綠假單胞菌生物被膜研究中發(fā)現(xiàn)，使用有效的AlgL可能是一個(gè)有前途的治療策略 ；Lamppa等［12］和Tavafi等［13］的研究表明，AlgL有消除銅綠假單胞菌生物膜和提高抗生素療效的機(jī)制。細(xì)菌因子RpoS是響應(yīng)多重環(huán)境脅迫的調(diào)控因子，當(dāng)細(xì)菌面臨營養(yǎng)缺乏、環(huán)境壓力或進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，RpoS含量就會增加［14］。Tto等［15］研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌生物被膜的耐藥性升高與RpoS基因的表達(dá)增加相關(guān)，RpoS基因通過調(diào)節(jié)參與能量代謝基因、熱休克蛋白基因、多藥耐藥性基因等影響大腸桿菌生物被膜的生長能力以及其對氨芐青霉素的抗性。Muhanad等［16］在對沙門菌生物被膜研究中闡述了關(guān)鍵基因RpoS對沙門菌生物被膜形成具有正調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些壓力應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)在細(xì)菌抗脅迫中發(fā)揮功能。

目前，國內(nèi)外AlgL對HvKP生物被膜和RpoS基因影響的研究少有報(bào)道。本研究以HvKP為試驗(yàn)材料，通過質(zhì)譜鑒定、拉絲試驗(yàn)、熒光定量PCR試驗(yàn)、生物膜半定量試驗(yàn)來確定AlgL對HvKP的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

本項(xiàng)研究工作使用的儀器有全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（型號：VITEK，法國生物梅里埃公司）、全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)（型號：VITEK-2 Compact，法國生物梅里埃公司）、veritiTM Dx PC擴(kuò)增儀（美國Thermo公司）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、熒光定量PCR儀［appliedbiosystems QuantStudio 5（美國 Thermo公司）］；核酸濃度檢測儀器［NanoDropTM One超微量紫外-可見分光光度計(jì)美國Thermo公司）］。研究工作使用的酶和生化試劑見表1。

表1 研究所用酶與生化試劑Tab. 1 Enzymes and biochemical reagents for research

1.2 HvKP的臨床分離

本試驗(yàn)所使用的HvKP分離于2019年1月—2020年12月邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染性疾病患者的痰液樣本，通過全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)VITEK進(jìn)行鑒定，并將拉絲試驗(yàn)陽性的菌株定義為HvKP。質(zhì)控菌株鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobncter baumannii）和KP購自北京市臨床檢驗(yàn)中心。本研究已通過倫理委員會的審查（批件號：2019007）。

1.3 藥敏試驗(yàn)

從30位患者中對應(yīng)分離鑒定的30株KP菌株依次編號為Sample 1～Sample 30組，再通過全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)對分離鑒定的KP菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4 拉絲試驗(yàn)

將菌株通過三段劃線方法接種于血平板中，在37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后，用細(xì)菌接種環(huán)沾取單菌落向上挑起，如挑起的菌落黏液絲長度大于0.5 cm，則為拉絲試驗(yàn)陽性。

1.5 RpoS基因鑒定

本研究中引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。使用Axygen公司的DNA提取試劑盒提取HvKP的DNA，以HvKP的DNA為模板，用RpoS的引物擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL（20 ng）、上游引物0.4 μL、下游引物 0.4 μL、2×SYBR Green Mix（2.5 mmol/L）10.0 μL、1×ROX dye 0.4 μL、無菌超純水 7.8 μL，總體積20.0 μL。PCR反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 15 s，60℃退火30 s，72℃延伸 2 min，40 個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)平10 min，16℃保存。以鮑曼不動(dòng)桿菌作為陰性對照組，試驗(yàn)組為Sample 1～Sample 30組。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

表2 目的基因擴(kuò)增引物及其序列Tab. 2 Objective gene amplification primers and their sequences

1.6 抑制生物被膜形成試驗(yàn)

取對數(shù)生長期的菌落，先用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液含量為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋∕cFarland，MCF），再進(jìn)行稀釋，其菌液與生理鹽水的體積比為1:19。將菌液與設(shè)定梯度濃度的AlgL進(jìn)行充分混勻，再將其轉(zhuǎn)種到血平板上，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期，觀察菌落的生長情況。用新鮮的麥?zhǔn)希∕ueller Hinton，MH）培養(yǎng)液調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)后的各組菌液含量至3.33 MCF，并將其接種于96孔板中，每孔200 μL，每菌株設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24 h。棄去上清液，每孔加200 μL MH培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24 h。棄去上清液，每孔加入200 μL結(jié)晶紫水溶液，染色2 min，棄去染液，用蒸餾水輕輕沖洗96孔板，直至陰性對照沒有顏色（陰性對照組為MH培養(yǎng)液）。室溫晾干，95%乙醇脫色。酶標(biāo)儀測定波長為630 nm處的光密度（optical density，OD）。生物膜形成量的判斷標(biāo)準(zhǔn)：將陰性對照的平均OD630nm與標(biāo)準(zhǔn)差之和定義為光密度閾值，將OD平均值連續(xù)3次顯著性超過光密度閾值的待測菌株定義為產(chǎn)生物被膜菌株。

以鮑曼不動(dòng)桿菌作為陰性對照組；Sample 7菌液為HvKP組；據(jù)Sample 7菌液添加不同量的AlgL依次命名為HvKP+AlgL（62.5 U）、HvKP+AlgL（312.5 U）、HvKP+AlgL（1 562.5 U）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用One-way analysis of variance檢驗(yàn)，事后多重比較采用 Dunnett’s multiple comparisons test。P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床特征

通過全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，將從臨床呼吸系統(tǒng)感染患者中分離的30株菌株的質(zhì)譜圖與KP的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，30株菌株鑒定為KP。其臨床特征包括性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、最高體溫（表3）。KP感染患者為中老年人，同時(shí)患至少2種以上疾病，其中具有肺部感染臨床特征患者占56.7%，符合KP的流行病學(xué)人群。

表3 臨床呼吸系統(tǒng)感染肺炎克雷伯桿菌患者的臨床特征Tab. 3 Clinical characteristics of HvKP in respiratory infections

2.2 藥敏試驗(yàn)

通過全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)對30株KP菌株進(jìn)行藥敏分析，其耐藥率結(jié)果見表4。我們通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的耐藥率為100.0%，慶大霉素的耐藥率為10.0%，頭孢吡肟的耐藥率為33.3%，復(fù)方新諾明的耐藥率為13.3%，環(huán)丙沙星的耐藥率為33.3%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Sample 7組標(biāo)本的耐藥性最強(qiáng)，其對氨芐西林、慶大霉素、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星5種抗生素均耐藥。Sample 7組標(biāo)本取自神經(jīng)內(nèi)科一位70歲患者，該患者被診斷出急性上呼吸道感染、急性腎盂腎炎、腎結(jié)石、腎功能不全、膿毒血癥、2型糖尿病性酮癥、輸尿管擴(kuò)張、電解質(zhì)混亂、低蛋白血癥、腦動(dòng)脈供血不足、營養(yǎng)性貧血、慢性乙型病毒肝炎、女性盆腔積液等多種疾病。

表4 30株KP對抗菌藥物的耐藥率Tab. 4 Resistance of 30 strains of KP to antibacterial drugs

2.3 HvKP鑒定

本文通過拉絲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臨床分離的30株KP其挑起的菌落黏液絲長度均大于0.5 cm，呈陽性，可判定為HvKP，結(jié)果見圖1。

圖1 拉絲試驗(yàn)Fig. 1 Drawing experiment

2.4 耐藥基因RpoS檢測

PCR檢測基因結(jié)果如圖2所示，各菌株在1 000 bp左右出現(xiàn)表達(dá)的條帶，符合RpoS基因的大小，表明通過試驗(yàn)篩選的30株HvKP中包含RpoS基因。通過熒光定量PCR試驗(yàn)檢測各組樣本中的RpoS基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)陰性對照鮑曼不動(dòng)桿菌組的循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold value，CT）為0，HvKP菌株組的CT為22.75±3.14，其中Sample 7組的CT為30.91，RpoS基因表達(dá)水平最高。HvKP是糖尿病患者細(xì)菌性肝膿腫的優(yōu)勢致病菌株［17］，老年患者因?yàn)闄C(jī)體免疫功能下降，容易發(fā)生HvKP院內(nèi)感染［18］，RpoS基因與生物被膜的形成呈正相關(guān)［15］。綜上所述，RpoS基因在宿主的表達(dá)可能與機(jī)體免疫功能水平相關(guān)。

圖2 RpoS基因凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 The PCR amplification results of RpoS gene

2.5 AlgL對HvKP生物被膜的抑制作用

通過生物膜半定量試驗(yàn)對HvKP進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Sample 7 組菌液形成的生物被膜水平最高，將其命名為J-7組。將0、12.5、62.5、312.5、1 562.5 U的AlgL與J-7組菌株共孵育后進(jìn)行生物膜半定量試驗(yàn)，生物膜半定量試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，HvKP組的OD值顯著升高，表明HvKP成功產(chǎn)生生物被膜；與HvKP組相比，HvKP+AlgL（62.5 U）組的OD值顯著降低；與HvKP+AlgL（62.5 U）組相比，HvKP+AlgL（312.5 U）組OD值顯著降低；與HvKP+AlgL（312.5 U）組比，HvKP+AlgL（1 562.5 U）組無顯著性差異，表明在一定AlgL濃度范圍內(nèi)，OD值隨著AlgL濃度的升高而降低。綜上所述，AlgL能抑制HvKP生物被膜的形成。

圖3 生物膜半定量試驗(yàn)Fig. 3 Agarose gel electrophoresis

3 討論

HvKP具有極強(qiáng)的播散能力，呼吸系統(tǒng)是其最常見的感染部位。在中國，HvKP感染率從8.33%到73.9%不等［19］。有研究報(bào)告稱，糖尿病患者患有肺炎克雷伯菌并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)會增加［20］，并且大多數(shù)KP感染會導(dǎo)致肺炎或尿路感染［21］。HvKP是肺炎、轉(zhuǎn)移性糖尿病感染、肝膿腫、腦膜炎及化膿性關(guān)節(jié)炎的重要病原體之一，嚴(yán)重威脅人類的健康［22］。本研究從臨床送檢標(biāo)本分離出的KP，經(jīng)鑒定30株均為HvKP，且發(fā)現(xiàn)在感染者的疾病分布中，肺部感染占56.7%，糖尿病疾病占26.7%。在臨床中應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注伴有肺炎的糖尿病患者，做好HvKP的預(yù)防、監(jiān)測以及治療。

KP的細(xì)菌生物被膜是影響其致病性的原因之一［23］。KP由1型和3型菌毛黏附素組裝而成，它能促進(jìn)細(xì)菌黏附到上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和非生物表面［22］。在大腸桿菌中，生物膜的形成取決于各種調(diào)節(jié)劑，其中包括RpoS。RpoS是一種應(yīng)激反應(yīng)西格瑪因子，允許細(xì)菌在應(yīng)激條件下生存和適應(yīng)［24］。KP具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，RpoS基因過度表達(dá)會導(dǎo)致3型菌毛編碼基因的轉(zhuǎn)錄本豐度降低3～10倍，缺乏RpoS基因的KP的應(yīng)激耐受性會減弱［25］。KP生物膜形成過程中最重要的表面結(jié)構(gòu)就是3型菌毛和莢膜多糖［26］。有研究發(fā)現(xiàn)，RpoS基因可以介導(dǎo)鞭毛及生物膜等特殊結(jié)構(gòu)的形成［27］。與野生型溶藻弧菌相比，RNAi處理的細(xì)菌其黏附、生物膜產(chǎn)生和毒力能力顯著受損［28］。本研究分離鑒定的30株HvKP均擴(kuò)增出耐藥基因RpoS。30株HvKP中Sample 7組樣本耐藥性最強(qiáng)，并且其RpoS表達(dá)水平最高。Sample 7患者為患有急性上呼吸道感染、2型糖尿病性酮癥等13種疾病的70歲老年人，該患者同時(shí)患有的疾病數(shù)目最多。在臨床上，針對患有多種疾病免疫力低下的老年患者，我們需要加強(qiáng)對HvKP的監(jiān)測。

生物膜是由不同病原體形成的復(fù)雜動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，可引起慢性持續(xù)性和復(fù)發(fā)性感染［29］。氧化應(yīng)激可能會氧化和破壞肺炎克雷伯菌的生物膜，導(dǎo)致主要膜蛋白和肺炎克雷伯菌的活性喪失［30］。在伯克霍爾德菌中，RpoS基因通過增強(qiáng)過氧化氫酶的活性在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用［31］。黏液性的銅綠假單胞菌的特征就是海藻外多糖增加，從而抵御抗生素和宿主免疫系統(tǒng)能力增強(qiáng)。AlgL可以降解這種糖，并被提議作為生物治療劑來溶解銅綠假單胞菌的生物膜［32］。幽門螺桿菌生物膜的抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，克拉霉素與AlgL結(jié)合可提高抗生素的治療效果［33］。HvKP也是一種高毒力高黏液性的病原微生物。本研究用AlgL對HvKP進(jìn)行生物膜半定量試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AlgL對HvKP生物被膜的形成有顯著性的抑制作用。

本研究表明，患有肺部感染等多種疾病的老年患者應(yīng)為HvKP重點(diǎn)監(jiān)測人群，這為臨床診療提供了一定的參考。本文在AlgL治療HvKP感染上進(jìn)行了一些探索，也為臨床上解決HvKP耐藥性提供了一定的參考。但本研究只進(jìn)行了體外試驗(yàn)，缺乏體內(nèi)試驗(yàn)研究，有一定的局限性，需要通過進(jìn)一步的試驗(yàn)來確定AlgL用于臨床上治療細(xì)菌性感染疾病的用法、療效、毒副作用等。