燒傷后制動致創(chuàng)面愈合延遲的機制研究

徐子寒，朱秀梅，王本峰，高文杰，雷 諾，韓 峰

（1.陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科，西安 710000；2.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院，西安 710072；3.西安市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，西安 710072）

燒傷作為嚴(yán)重危害患者身體健康的疾病，是人們生產(chǎn)生活、災(zāi)害事故中極為常見的外傷，目前針對深度燒傷主要采用積極補液抗休克、早期切（削）痂去除壞死組織、同期或二期行自體皮移植方案等方法，而創(chuàng)面受皮區(qū)移植皮片存活狀況是手術(shù)成功和患者預(yù)后的關(guān)鍵[1]。燒傷不但導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重的生理性創(chuàng)傷，諸如劇烈疼痛、容貌損毀、軀體功能障礙以及皮膚汗腺受損而致排汗困難等，而且使燒傷患者出現(xiàn)心理障礙，如緊張感、恐懼感、孤獨感以及自卑感，從而產(chǎn)生焦慮以及抑郁癥狀[2]。我國普通人群抑郁癥的發(fā)病率為3%～5%，而燒傷患者焦慮、抑郁的發(fā)病率可高達(dá)55%[3]。

創(chuàng)面修復(fù)的內(nèi)在病理生理機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，理解創(chuàng)面修復(fù)的機制與愈合轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，有助于更好地進(jìn)行創(chuàng)面修復(fù)臨床實踐[4]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，燒傷患者，尤其是大面積燒傷患者需長期制動以防移植皮片脫落，但長期制動可能對患者的心理健康造成不良影響，進(jìn)而間接影響創(chuàng)面愈合。目前制動是否延緩創(chuàng)面愈合的作用及相關(guān)機制仍不清楚。本研究通過評估抑郁患者與燒傷面積及創(chuàng)面愈合率的關(guān)系，進(jìn)一步構(gòu)建燒傷后制動的小鼠模型，評估制動與創(chuàng)面愈合的關(guān)系，同時檢測相關(guān)炎性因子和抑郁相關(guān)指標(biāo)分析潛在的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及燒傷患者的抑郁評估

選取2018年1月至2021年6月就診于陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科的106例燒傷患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷創(chuàng)面為深Ⅱ～Ⅲ度燒傷，均需行創(chuàng)面自體皮移植術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～淺Ⅱ度燒傷，或深Ⅱ～Ⅲ度燒傷但拒絕行植皮手術(shù)治療的患者。

根據(jù)漢密爾頓抑郁量表（HAMD）24項評分，將燒傷患者分為重度抑郁（HAMD評分≥35分）、中度抑郁（20分≤HAMD評分＜35分）、輕度抑郁（8分≤HAMD評分＜20分）、無抑郁（HAMD評分＜8分）。根據(jù)病情進(jìn)行常規(guī)自體皮移植術(shù)，患者植皮術(shù)后第3、7、10、14天分別測量合并抑郁與無抑郁組燒傷患者的創(chuàng)面植皮區(qū)愈合面積，計算第14天創(chuàng)面愈合率（愈合率=愈合面積/植皮面積×100%）。所有患者均簽訂知情同意書，該研究經(jīng)過陜西省人民醫(yī)院倫理委員會審批通過（202001047）。

1.2 實驗動物及分組

健康雄性BALB/c小鼠24只，平均體質(zhì)量（20.45±1.36）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，術(shù)前7 d運達(dá)西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院SPF動物房，人工照明，明暗各12 h，室溫24~26℃，濕度40%~70%，常規(guī)飲食。構(gòu)建小鼠燒傷模型后隨機分為4組：制動組、活動組、活動+鎮(zhèn)痛組和制動+鎮(zhèn)痛組。模型構(gòu)建及小鼠飼養(yǎng)于西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院SPF動物房，實驗動物倫理經(jīng)過西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會審批通過（202002014）。

1.3 裸鼠燒傷并制動模型的構(gòu)建和燒傷創(chuàng)面及體質(zhì)量監(jiān)測

采用YLS-5Q臺式超級控溫燙傷儀（湖南益延科技發(fā)展有限公司）于小鼠中下背部灼燒15 s，接觸質(zhì)量300 g，制動組小鼠于燒傷后放入特制的50 mL離心管中限制活動，離心管前后均開孔透氣，制動組模型小鼠頭部可自由轉(zhuǎn)動并可正常進(jìn)食水，每日制動6～8 h；活動組小鼠待燒傷模型構(gòu)建完畢后即可自由活動和進(jìn)食水。鎮(zhèn)痛組小鼠采用局部涂抹利多卡因凝膠（購于華潤紫竹藥業(yè)有限公司）。于燒傷模型構(gòu)建成功后的第3、8、15、19天測量小鼠燒傷創(chuàng)面的剩余面積，隔日監(jiān)測小鼠體質(zhì)量變化。

1.4 燒傷后制動裸鼠模型的抑郁評估

模型構(gòu)建完畢，分別于燒傷模型構(gòu)建成功后第19天將制動組、活動組、活動+鎮(zhèn)痛組、制動+鎮(zhèn)痛組小鼠倒掛，并將其尾部固定于水平桿上，小鼠頭部與地面保持10 cm的距離，記錄每只小鼠在6 min中的后4 min里懸尾靜止的次數(shù)和懸尾靜止時間（s）。

1.5 ELISA檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8，抗抑郁指標(biāo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及營養(yǎng)指標(biāo)血清白蛋白（serum albumin，ALB）表達(dá)

人植皮術(shù)后第7天和小鼠術(shù)后第19天獲取外周血血清，采用雙抗體夾心法ELISA試驗檢測血清相關(guān)炎性因子的表達(dá)。TNF-α（人F0121-A；小鼠F2132-B）、IL-6（人F0049-A；小鼠F2163-B）、IL-8（人F1551-A；小鼠F2123-B）、BDNF（人F10420-A；小鼠F2204-B）均購于上海凡科維商城。預(yù)包被抗體的ELISA 96孔板微孔中依次加入血清標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品HRP標(biāo)記的檢測抗體，溫育60 min并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中相關(guān)炎性因子的表達(dá)呈正相關(guān)。酶標(biāo)儀在波長450 nm下測定OD值，計算樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；兩因素的重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；兩組連續(xù)正態(tài)分布的線性數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)性分析，兩組連續(xù)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Spearman相關(guān)性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷患者HAMD評分與燒傷面積、植皮術(shù)后創(chuàng)面愈合率的關(guān)系

106例燒傷患者術(shù)前采用HAMD評分（24項），將燒傷患者分為重度抑郁組（61例）、中度抑郁組（23例）、輕度抑郁組（17例）和無抑郁組（5例）。Pearson相關(guān)性分析提示HAMD評分與燒傷面積呈正相關(guān)（r=0.590，P＜0.001），Spearman相關(guān)性分析提示HAMD評分與燒傷后植皮創(chuàng)面愈合率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.634，P＜0.001），見圖1。

圖1 HAMD評分與燒傷面積和植皮術(shù)后創(chuàng)面愈合率的關(guān)系

2.2 抑郁患者外周血炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8和抗抑郁相關(guān)因子BDNF的表達(dá)水平

根據(jù)HAMD評分，重度抑郁患者的表型最明確，故將HAMD 35分作為本研究的截斷值，將106例燒傷患者分為兩組：HAMD≥35分（61例）、HADM＜35分（45例）。經(jīng)比較，HAMD≥35分的燒傷患者TNF-α［（320 40±7 277）ng·L-1］、IL-6［（19 553±3 705）ng·L-1］和IL-8［（16 907±2 993）ng·L-1］分別均高于HAMD＜35分組患者［（15 986±7 001）ng·L-1、（13 511±3 048）ng·L-1、（10 137±3 461）ng·L-1］，而HAMD≥35分組的BDNF［（17 428±7 947）ng·L-1］低于HAMD＜35分組患者［（35 063±14 191）ng·L-1］（P均<0.01），見圖2。

圖2 抑郁患者HAMD評分與外周血中TNF-α、IL-6、IL-8和BDNF的表達(dá)變化

2.3 各組小鼠懸尾靜止次數(shù)和懸尾靜止時間比較

制動組小鼠較活動組的懸尾靜止次數(shù)［（12.83±2.32）次vs（.6.01±2.89）次］增加，懸尾靜止時間［（95.33±26.46）s vs（.3.67±17.87）s］亦延長（P均＜0.01）；制動+鎮(zhèn)痛組小鼠較活動+鎮(zhèn)痛組的懸尾靜止次數(shù)［（11.33±2.25）次vs（.7.67±2.16）次］增加，懸尾靜止時間［（86.83±19.90）s vs（.49.83±6.08）s］亦延長（P均＜0.01），見圖3。

圖3 燒傷后聯(lián)合制動或局部鎮(zhèn)痛小鼠的懸尾靜止次數(shù)和懸尾靜止時間

2.4 制動對小鼠背部大面積燒傷創(chuàng)面愈合的影響

自背部大面積燒傷模型構(gòu)建成功后，連續(xù)觀察19 d，并于第3天、8天、15天和第19天測量制動組、活動組、活動+鎮(zhèn)痛組和制動+鎮(zhèn)痛組小鼠的創(chuàng)面剩余面積，活動組小鼠的創(chuàng)面剩余面積少于制動組（F=6.417，P=0.000 3），活動+鎮(zhèn)痛組小鼠的創(chuàng)面剩余面積較制動+鎮(zhèn)痛組亦減少（F=4.505，P=0.003 5）。在觀察終點第19天，活動組小鼠的創(chuàng)面剩余面積［（86.62±25.88）mm2］小于制動組（190.70±51.49）mm2］（P=0.001 3），活動+鎮(zhèn)痛組小鼠創(chuàng)面剩余面積［（151.80±36.86）mm2］較制動+鎮(zhèn)痛組（236.67±49.46）mm2］（P=0.007 2）減小，見圖4。

進(jìn)一步排除疼痛對創(chuàng)面愈合的影響，采用局部涂抹利多卡因凝膠的局部鎮(zhèn)痛方式會延緩創(chuàng)面愈合速度，重復(fù)測量的方差分析結(jié)果提示，活動組小鼠的創(chuàng)面剩余面積較活動+鎮(zhèn)痛組減?。‵=3.421，P=0.015），制動組小鼠的燒傷創(chuàng)面剩余面積則較制動+鎮(zhèn)痛組有改變（F=1.141，P=0.348 1），見圖4。

圖4 燒傷后制動或聯(lián)合局部鎮(zhèn)痛的小鼠燒傷創(chuàng)面愈合能力的差異

2.5 燒傷后制動的小鼠外周血炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8，抑郁相關(guān)指標(biāo)BDNF和營養(yǎng)相關(guān)指標(biāo)ALB的表達(dá)水平比較

在實驗觀察終點（第19天）于眼球取血并離心獲取血清，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)燒傷后制動組小鼠的血清BDNF較活動組［（4.08±0.86）ng·L-1vs.（6.33±1.22）ng·L-1］降低（P＜0.05）；制動+鎮(zhèn)痛組小鼠血清BDNF較活動+鎮(zhèn)痛組［（3.92±0.74）ng·L-1vs.（5.57±1.13）ng·L-1］降低（P＜0.05）；制動組的IL-6［（171.1±32.71）ng·L-1vs（.65.75±16.09）ng·L-1］、IL-8［（10.79±2.41）ng·L-1vs（.6.07±1.89）ng·L-1，C］和TNF-α［（185.1±31.23）ng·L-1vs.（96.3±49.31）ng·L-1］均高于活動組，而制動+鎮(zhèn)痛組小鼠血清的IL-6［（254.3±72.39）ng·L-1vs（.121.7±40.61）ng·L-1］、IL-8［（19.15±4.51）ng·L-1vs.（10.76±1.67）ng·L-1］和TNF-α［（323.7±72.51）ng·L-1vs（.199.7±62.06）ng·L-1］均高于活動+鎮(zhèn)痛組（P均＜0.05），見圖5。

為排除制動影響小鼠進(jìn)飲食導(dǎo)致營養(yǎng)不良所致的創(chuàng)面愈合不良，隔日檢測小鼠體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，制動組、活動組、活動+鎮(zhèn)痛組和制動+鎮(zhèn)痛組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.923 7，P=0.577 8），在實驗觀察終點同樣證實制動組與活動組、制動+鎮(zhèn)痛組與活動+鎮(zhèn)痛組的ALB表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），見圖5。

圖5 燒傷小鼠血清中炎性因子、抗抑郁因子及營養(yǎng)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化

3 討論

組織和細(xì)胞學(xué)研究提示，創(chuàng)面修復(fù)是機體自主調(diào)控、高度程序化、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜、多因素參與的漸進(jìn)過程。外科技術(shù)不斷發(fā)展迭代，對創(chuàng)面愈合亦存在多重評價標(biāo)準(zhǔn)，包括直接評估創(chuàng)面的愈合率、組織病理學(xué)檢測增殖和凋亡指標(biāo)及相關(guān)信號通路、檢測血清學(xué)炎性指標(biāo)（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8）和相關(guān)生長因子（成纖維細(xì)胞生長因子FGF、表皮生長因子EGF、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-α等）的表達(dá)[4-8]。目前尚缺乏從患者整體角度評估和干預(yù)燒傷創(chuàng)面愈合的相關(guān)研究報道。

抑郁癥是以心境和情緒低落、思維和意志活動減退為主要特征的全身性疾患，其發(fā)病因素和相關(guān)機制多樣，一般認(rèn)為與生物化學(xué)、遺傳及社會環(huán)境因素密切相關(guān)。燒傷作為一種嚴(yán)重危害患者身體健康、容貌及肢體功能的疾病，會經(jīng)歷特殊的應(yīng)激反應(yīng)和心理反應(yīng)。有研究[9]報道，在燒傷早期，患者有39.7%的抑郁發(fā)生率，而在燒傷康復(fù)期抑郁的發(fā)生率可高達(dá)58.3%。抑郁情緒是一種負(fù)性情緒，會延長創(chuàng)面愈合時間。臨床常針對抑郁癥患者給予口服藥物、心理疏導(dǎo)、調(diào)換生活環(huán)境等改善抑郁的策略，但療效均有限[10]。燒傷引發(fā)的抑郁與多種機制有關(guān)，包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說、炎性細(xì)胞因子、腸道菌群失調(diào)等多種機制。目前認(rèn)為：炎性反應(yīng)因子的升高會引起炎性因子瀑布效應(yīng)，致使腸道細(xì)菌失調(diào)和腸道毒素吸收，會加重原發(fā)疾病的惡化[11]。本研究入組106例燒傷患者，采用HAMD評估抑郁程度并分析其與燒傷創(chuàng)面大小及愈合速率的相關(guān)性，結(jié)果證實患者的抑郁程度與燒傷面積呈正相關(guān)，與創(chuàng)面愈合率呈負(fù)相關(guān)。本研究入組患者在治療過程中，伴隨體液大量滲出、進(jìn)食受限等多種因素，反復(fù)合并低蛋白血癥，體質(zhì)量較入院時會有2～20 kg的下降。為排除營養(yǎng)狀況可能對患者創(chuàng)面愈合的影響，本研究針對性采用持續(xù)腸內(nèi)+腸外營養(yǎng)補充和間斷補充人血白蛋白對癥處理，因此可排除營養(yǎng)不良對創(chuàng)面愈合的干擾。在重度抑郁患者（HADM評分≥35分）血清中檢測發(fā)現(xiàn)，炎性相關(guān)因子TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)升高。有報道[12]證實，隨著燒傷創(chuàng)面的反復(fù)多次治療，患者的焦慮抑郁評分持續(xù)升高，而燒傷創(chuàng)面治療的效果逐漸降低。上述結(jié)果提示抑郁癥狀誘發(fā)的系統(tǒng)性炎癥可能是延緩創(chuàng)面愈合的主要因素之一。

近年來，康復(fù)運動在改善抑郁癥狀中的重要性及必要性日益受到關(guān)注，軀體運動是改善心理狀態(tài)的良好手段，適度的鍛煉對抑郁癥狀具有顯著的改善作用[13]。軀體運動與抑郁的關(guān)系研究主要源于普通人群，而燒傷患者長期臥床制動是否會誘發(fā)抑郁并影響創(chuàng)面愈合目前尚不明確[14]。本研究構(gòu)建燒傷后制動小鼠模型，發(fā)現(xiàn)制動小鼠懸尾次數(shù)增加且懸尾時間延長，提示制動與小鼠燒傷后抑郁相關(guān)。同時，各組之間小鼠的體質(zhì)量及外周血ALB的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，排除小鼠營養(yǎng)不良對燒傷創(chuàng)面愈合的影響。持續(xù)觀察還證實，制動組小鼠創(chuàng)面愈合速率較活動組延遲，殘余燒傷面積較大。而聯(lián)合局部采用利多卡因凝膠鎮(zhèn)痛的小鼠，制動組的愈合速率亦降低。本實驗結(jié)果可以證實，燒傷后制動可能是誘發(fā)抑郁的因素之一，進(jìn)而影響燒傷植皮創(chuàng)面的愈合，而通過積極的適度運動可能對改善抑郁、提高創(chuàng)面植皮存活率、促進(jìn)燒傷良性轉(zhuǎn)歸具有重要意義。

機體炎性反應(yīng)與疾病嚴(yán)重程度和焦慮抑郁情緒存在相關(guān)性，燒傷后患者的交感神經(jīng)興奮，兒茶酚胺升高、糖皮質(zhì)激素分泌和血清炎性因子均改變，這種相互影響可能是抑郁癥狀持久存在甚至持續(xù)加重的原因。BDNF可通過多種途徑調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、生存、生長、分化和凋亡，并直接參與了神經(jīng)突觸的可塑性和重構(gòu)，提示BDNF可作為抑郁的檢測指標(biāo)[15]。隨著醫(yī)學(xué)模式由生物模式向生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)重度抑郁患者和制動后抑郁小鼠的血清中的抗抑郁相關(guān)指標(biāo)BDNF表達(dá)均降低，進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)炎性相關(guān)因子TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)升高。為排除疼痛可能對創(chuàng)面愈合的間接影響，本研究聯(lián)合局部采用利多卡因凝膠鎮(zhèn)痛，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面較未使用組愈合延遲，同時伴隨有部分炎性因子的表達(dá)升高，推測可能局麻藥利多卡因凝膠對局部血管生成有影響或直接對創(chuàng)面有刺激作用，進(jìn)而影響創(chuàng)面的愈合。本研究結(jié)果證實，抑郁癥狀與制動相關(guān)，而適度運動可能改善燒傷創(chuàng)面愈合速率，相關(guān)機制與降低血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)和上調(diào)抗抑郁分子BDNF的水平有關(guān)。

綜上所述，燒傷患者抑郁情緒會延緩創(chuàng)面愈合時間，燒傷后制動是引發(fā)抑郁的原因之一，可能通過引起多種血清中炎性相關(guān)因子改變，導(dǎo)致組織器官炎癥-免疫微環(huán)境失衡，最終影響植皮創(chuàng)面愈合及患者病情轉(zhuǎn)歸，而術(shù)后完全制動可能加劇燒傷患者抑郁發(fā)生，不利于患者植皮創(chuàng)面的愈合，對術(shù)后的康復(fù)治療亦有嚴(yán)重影響。