右美托咪定預(yù)處理對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的影響

周文杰，楊海榮，張 楠，劉勤富，馬希剛

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)人民醫(yī)院，銀川750021；

3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院手術(shù)室，銀川 750004）

膿毒癥是引發(fā)膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合征的重要因素[1]。膿毒癥相關(guān)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）具有病情危重、死亡率高、預(yù)后差、易發(fā)展為慢性腎臟病等特點[2-3]，對患者和社會是沉重的負(fù)擔(dān)。膿毒癥相關(guān)AKI是一種涉及炎癥、腎毒性、缺血性損傷等多因素的綜合征，致病機制復(fù)雜，目前尚無有效的預(yù)防或干預(yù)藥物[4]。因此，尋求有效減輕膿毒癥相關(guān)AKI的治療藥物對于改善預(yù)后尤為重要。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種新型α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用[5-6]。但DEX預(yù)處理是否對膿毒癥AKI具有保護作用尚不清楚。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備大鼠膿毒癥AKI模型，探討DEX預(yù)處理對膿毒癥AKI的保護作用，為臨床治療膿毒癥AKI患者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（250±20）g，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（寧）2015-0001。按照隨機數(shù)表法分為4組：假手術(shù)（Sham）組、DEX對照組、盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）組、DEX干預(yù)組，每組15只。

1.2 大鼠膿毒癥模型制備

采用CLP法制備大鼠膿毒癥AKI模型。即稱重后腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g充分麻醉大鼠，于腹部行1.5 cm切口，開腹分離出盲腸，在盲腸根部用3.0絲線結(jié)扎，避免結(jié)扎回盲瓣，在盲腸被結(jié)扎段避開血管，用直徑2.6 mm的三棱針穿刺3孔，擠出少量糞便后回納腹腔，分層關(guān)腹。Sham組和DEX對照組僅開關(guān)腹，不結(jié)扎，不穿孔。術(shù)后皮下注射復(fù)方氯化鈉3 mL/100 g補液，保暖復(fù)溫后放回鼠籠，自由進(jìn)食水。各組分別于術(shù)后6、12和24 h處死5只大鼠取材待測。本實驗中所有動物處理方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理審查委員會批準(zhǔn)（審批號：2019-228）。

1.3 DEX干預(yù)措施

采用預(yù)處理的方法進(jìn)行干預(yù)。1）DEX對照組和DEX干預(yù)組：制模前1 h經(jīng)尾靜脈持續(xù)泵入右美托咪定（江蘇恩華，批號：H20110085），速率為5 μg·（kg·h）-1，泵注時間為1 h；2）Sham組和CLP組：制模前1 h經(jīng)尾靜脈泵入等體積生理鹽水。

1.4 標(biāo)本收集

各組術(shù)后6、12和24 h分別取5只大鼠，沿腹中線打開腹腔，經(jīng)腹主動脈采血3~5 mL，以3 000 r·min-1速度、4℃離心15 min分離血清，存于-80℃冰箱備用。打開后腹膜，分離左側(cè)腎臟，去除包膜，沿腎橫軸切取厚約3 mm組織置于4%多聚甲醛中固定，待行病理形態(tài)學(xué)觀察。同時在左腎皮髓質(zhì)交界區(qū)切取大小為1 mm×1 mm×2 mm組織置于2%戊二醛中固定，待行電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 腎組織病理形態(tài)學(xué)檢測 將腎組織于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，二次取材后置于包埋盒中，流水沖洗3 h，70%乙醇過夜，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片，厚度4 μm，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色。切片置于光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)，并參照文獻(xiàn)[7]對腎小管損傷程度進(jìn)行評價。據(jù)損傷程度按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量評分：無損傷為0分；≤25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。

1.5.2 腎組織超微結(jié)構(gòu)觀察 將腎組織置于2%戊二醛中固定2 h，0.1 mol·L-1二甲胂酸鈉緩沖液沖洗，每2 h更換一次，1%鋨酸浸泡2 h，每15 min更換一次緩沖液，共沖洗2次，30%~100%乙醇依次脫水，環(huán)氧丙烷滲透，包埋組織，制作切片，在透射電鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。

1.5.3 血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）檢測 腹主動脈采血后離心分離血清，采用全自動生化分析儀（日立7180型）檢測血清Cr和BUN水平。

1.5.4 血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）和腎損傷分子-1（KIM-1）的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定血清NGAL和KIM-1水平。各組大鼠腹主動脈采血制備血清，標(biāo)準(zhǔn)孔加標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣品孔加樣品稀釋液40 μL及待測樣品10 μL，37℃溫育1 h，洗滌5次后避光顯色15 min，終止反應(yīng)，在450 nm波長測量各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)ELISA試劑盒中提供標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出每個樣品吸光度OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算得出樣本濃度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q

檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下可見Sham組和DEX對照組各時間點腎組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理學(xué)改變。CLP組可見腎小球水腫瘀血，有核細(xì)胞數(shù)增多；腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分刷狀緣丟失，腎小管擴張，部分有管型，腎間質(zhì)水腫、灶性出血；CLP術(shù)后6 h損傷程度最輕，隨術(shù)后時間延長，損傷呈加重趨勢，至24 h最為顯著。DEX干預(yù)組各時間點腎損傷程度較CLP組均減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE×400）

2.2 各組大鼠術(shù)后不同時間腎小管損傷評分比較

各組大鼠術(shù)后不同時間腎小管損傷評分，Sham組和DEX對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CLP組術(shù)后各時間點腎小管損傷評分均高于Sham組（P均<0.01），DEX干預(yù)組各時間點腎小管損傷評分均較CLP組降低（P均<0.01），見表1。

表1各組大鼠術(shù)后不同時間腎小管損傷評分（±s，分）

表1各組大鼠術(shù)后不同時間腎小管損傷評分（±s，分）

與Sham組比較aP＜0.01；與CLP組比較bP＜0.01。

組別 12 h 24 h Sham組 0.39±0.18 0.42±0.20 DEX對照組 0.38±0.16 0.39±0.24 CLP組 2.62±0.34a 3.52±0.34a DEX干預(yù)組 1.34±0.26ab 2.08±0.38ab n 15 15 15 15 6 h 0.36±0.25 0.34±0.24 1.98±0.37a 0.66±0.27ab

2.3 各組大鼠術(shù)后不同時間腎組織超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡下顯示，Sham組和DEX對照組腎小球結(jié)構(gòu)正常，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞器完整，足突排列整齊、無倒伏或融合、裂孔清晰，基底膜厚薄均勻。近曲小管結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞核膜清晰，線粒體數(shù)目豐富、形狀規(guī)則、嵴清晰。CLP組可見腎小球結(jié)構(gòu)局部損傷，腎小管損傷較腎小球更明顯。6 h見足細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚正常，足突腫脹呈矮柱狀，有輕微融合，基底膜厚薄不均；近曲小管上皮可見空泡變性，線粒體腫脹，界限不清，部分嵴溶解。12 h損傷進(jìn)一步加重，足突局灶性倒伏、融合，基底膜厚薄不均；近曲小管上皮細(xì)胞可見較多大空泡，線粒體數(shù)量減少、嵴溶解加重。24 h足細(xì)胞細(xì)胞器輪廓不清，足突倒伏、融合程度加重，裂孔模糊不清，基底膜厚薄不均；近曲小管上皮核固縮，線粒體損傷加重，部分空泡化。DEX干預(yù)組6 h腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，12 h腎小球可見足突有輕微融合，腎小管線粒體腫脹，部分嵴溶解。24 h可見足突局灶融合，基底膜基本均勻；腎小管核膜清晰，線粒體致密、嵴溶解，見圖2。

圖2 透射電鏡下各組大鼠腎小球和腎小管超微結(jié)構(gòu)改變（腎小球×5 000，腎小管×100 000）

2.4 各組大鼠術(shù)后不同時間血清Cr和BUN水平的變化

血清Cr和BUN水平在6 h各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。CLP組于12 h、24 h的血清Cr和BUN水平均高于Sham組（P均<0.01）；DEX干預(yù)組12 h和24 h的Cr及BUN水平均低于CLP組（P均<0.01）。Sham組與DEX對照組各時間點Cr和BUN水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），見表2。

表2各組大鼠術(shù)后不同時間血清Cr和BUN水平的變化

2.5 各組大鼠術(shù)后不同時間血清NGAL和KIM-1水平的變化

CLP組大鼠血清NGAL和KIM-1水平在6、12和24 h均高于Sham組（P均<0.01）；DEX干預(yù)組大鼠血清NGAL水平在6 h和12 h，KIM-1在6、12和24 h均高于Sham組（P均<0.01）；DEX干預(yù)組大鼠血清NGAL和KIM-1水平在6、12和24 h均低于CLP組（P均<0.01）。Sham組與DEX對照組各時間點NGAL和KIM-1水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），見表3。

表3各組大鼠術(shù)后不同時間血清NGAL和KIM-1水平的變化

3 討論

CLP法制模大鼠術(shù)后精神萎靡，少食懶動，寒顫、蜷縮、豎毛，眼角及鼻腔可見淡血性分泌物，腹脹腹瀉，上述表現(xiàn)隨術(shù)后時間延長而逐漸加重，處死大鼠開腹可聞及惡臭，有較多淡血性渾濁腹腔積液，結(jié)扎段盲腸擴張壞死明顯，呈紫黑色，與周圍組織粘連嚴(yán)重，表明膿毒癥模型復(fù)制成功。同時，Sham組和DEX對照組探查膀胱充盈、尿液清亮，CLP組大鼠膀胱攣縮無尿，且部分膀胱內(nèi)可見白色結(jié)晶，而DEX干預(yù)組膀胱充盈欠佳、尿色深，大鼠尿量的變化符合臨床膿毒癥AKI的特點。同時檢測膿毒癥組大鼠血清NGAL和KIM-1在腎損傷早期已明顯升高，血清Cr和BUN反映早期腎損傷有較大的局限性，但隨時間延長出現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。并且CLP組出現(xiàn)腎損傷的病理改變，且腎小管損傷評分升高。綜合尿量、腎損傷標(biāo)記物及腎臟病理學(xué)改變的情況，證實膿毒癥誘發(fā)了AKI[8]。

膿毒癥患者中AKI發(fā)病率高，同時與患者病死率增加獨立相關(guān)[9]。腎小管上皮細(xì)胞凋亡已被認(rèn)為是膿毒癥AKI的顯著特征，與患者腎功能惡化及死亡率增加密切相關(guān)[10]。氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、缺血等均可造成細(xì)胞凋亡[11-12]。本研究在光鏡下觀察到CLP組大鼠腎組織水腫、間質(zhì)灶性出血，可以明顯見到腎小管的損傷，諸如空泡變性、刷狀緣丟失、腎小管擴張、管型形成等改變，同時在電鏡下證實了小管上皮細(xì)胞中有線粒體的損傷，同時出現(xiàn)核固縮、上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。足細(xì)胞是維持腎小球濾過屏障的重要結(jié)構(gòu)，本研究在透射電鏡下還觀察到了腎小球的損害，主要以足突局灶性倒伏融合為主，其形態(tài)改變會增加濾過屏障的通透性，導(dǎo)致腎功能惡化[13]，說明膿毒癥發(fā)生時，以炎性反應(yīng)為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時伴隨氧化應(yīng)激、局部缺血損害、能量代謝障礙等過程，不僅破壞腎小管上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，同時還損害腎小球濾過屏障的正常結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致急性腎損傷。在給予DEX預(yù)處理后，大鼠腎小管及腎小球的病理改變均明顯減輕，血清Cr、BUN和NGAL、KIM-1的水平也有所下降，說明對膿毒癥AKI具有一定的保護作用。

DEX激動α2腎上腺素能受體具有高選擇性和特異性，不僅應(yīng)用于鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜領(lǐng)域，近年來，其器官保護作用也成為研究熱點。有研究[14-15]顯示，DEX具有抑制炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等作用，對腦、心臟、肺、腎、腸等器官具有保護作用，但其具體機制仍在進(jìn)一步研究中。在膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷小鼠模型中，DEX能通過上調(diào)TIPE2并抑制NF-κB和JNK信號通路的激活，減輕肺組織炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而對急性肺損傷起到保護作用[16]。本實驗中給予DEX預(yù)處理后各時間點大鼠腎損傷程度均減輕，腎功能得到改善，提示DEX對膿毒癥大鼠AKI有一定的保護作用，其保護機制可能與抑制炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，降低腎小球屏障的通透性有關(guān)。

綜上所述，DEX預(yù)處理可以減輕膿毒癥AKI大鼠腎功能，有望成為臨床治療膿毒癥AKI的有效藥物，其具體機制仍需進(jìn)一步研究。