乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁降血糖與抗氧化活性機(jī)理

封 弦， 翁佩芳*， 吳祖芳， 李 杲

（1.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832；2.寧波市北侖玉健醫(yī)藥科技有限公司，浙江 寧波 315830）

接骨木（Sambucus nigra）為茜草目忍冬科接骨木屬植物，目前多集中于研究其根莖和花，而對(duì)接骨木果實(shí)的研究較少，僅局限于對(duì)接骨木果油的營(yíng)養(yǎng)和生物活性的研究。接骨木果（Elderberry）富含蛋白質(zhì)[1]、脂肪酸[2-3]、碳水化合物[4-5]、有機(jī)酸和維生素[6]等營(yíng)養(yǎng)成分以及多酚[7]、黃酮[8-9]、花青素[10-11]和酚酸[12]等生物活性物質(zhì)，是一種良好的藥食資源，可用于開(kāi)發(fā)新的功能食品。

接骨木果中花青素含量較高，故具有顯著的抗氧化能力。Olejnik[13]等使用接骨木果提取物在人結(jié)腸膜細(xì)胞中進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示降低了細(xì)胞中活性氧水平和DNA的損傷，說(shuō)明接骨木果對(duì)結(jié)腸細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。Wu[11]等研究了15個(gè)水果樣品的抗氧化能力，結(jié)果顯示接骨木果和草莓的抗氧化活性最強(qiáng)。Milbury[14]等研究表明，接骨木果中的花青素的抗氧化能力比維生素C和維生素E強(qiáng)。有研究表明，接骨木果花青素能避免血管上皮細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而防止血管病變[15]。Bratu[16]等研究表明接骨木果的提取物能顯著清除氧自由基。其他研究也表明，接骨木果汁和果酒均具有抗氧化作用，并且接骨木果酒的抗氧化能力與生產(chǎn)過(guò)程中所用的糖和水的比例以及果實(shí)的細(xì)度有關(guān)[17-18]。乳酸菌發(fā)酵可以增加果蔬的營(yíng)養(yǎng)和感官特性，延長(zhǎng)貨架期，同時(shí)乳酸菌發(fā)酵也可以促進(jìn)食品中植物化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化[19]，從而產(chǎn)生大量新的代謝產(chǎn)物，因此相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)功能等也會(huì)發(fā)生變化[20]。

H2O2是一種常用的刺激細(xì)胞氧化損傷的工具，它作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型可控性強(qiáng)，具有一定的模擬性[21]，因此常應(yīng)用于天然產(chǎn)物抗氧化研究中。

作者選用保加利亞乳桿菌BNCC336436和嗜熱鏈球菌ABT-T發(fā)酵接骨木果汁，通過(guò)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子清除率來(lái)判斷接骨木果汁發(fā)酵過(guò)程抗氧化活性變化；以未發(fā)酵為對(duì)照，進(jìn)行發(fā)酵接骨木果汁酚類(lèi)化合物細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)，比較發(fā)酵前后抗氧化活性變化并初步探究抗氧化機(jī)理，為接骨木果汁的發(fā)酵加工和果蔬發(fā)酵功能食品開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

接骨木果粉：寧波市北侖玉健醫(yī)藥科技有限公司提供；保加利亞乳桿菌BNCC336436（Lactobacillus bulgaricus，B）、嗜 熱 鏈 球 菌ABT-T（Streptococcus thermophilus，ST）：均保存于寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；蔗糖：購(gòu)于超市；MRS肉湯培養(yǎng)基、吐溫80、甘油：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HepG2細(xì)胞、PBS緩沖溶液、細(xì)胞凍存液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶緩沖液（EDTA緩沖液）、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒：購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素：購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、12孔板、96孔板：購(gòu)于寧波航景生物有限公司；CCK-8試劑盒：購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；細(xì)胞活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒：購(gòu)于南京建成生物有限公司；qPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物：購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA提取試劑盒 （HiPure Bacterial RNA Kit，R4182）：購(gòu)于廣州美基生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（UEIrisⅡIRT-PCR Svstem for First-StrandcDNA Svnthesis，R2028）：購(gòu)于蘇州宇恒生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒（PerfectStarrTM Green qPCR SuperMix）：購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ZJ-HCB-1200潔凈工作臺(tái)：廣州梓凈凈化設(shè)備有限公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱：江南儀器廠；5418R低溫超速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；311型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱、1300系列A2型生物安全柜、MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；XSP-63XDV熒光倒置顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；HWS-11恒溫水浴鍋：上?；厶﹥x器制造有限公司；LDZX-40B I型立式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DM-40L262-40℃冰箱：青島海爾特種電器有限公司；-80℃超低溫冰箱：賽默飛科技（蘇州）有限公司；qPCR儀：武漢俊杰電子有限公司；BD-252WY-20℃冰箱：容聲冰箱有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化取新鮮保藏的B和ST試管斜面分別接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)18 h得到菌種活化液，備用。

1.3.2 發(fā)酵接骨木果汁的制備按料液質(zhì)量體積比1 g∶50 mL配制接骨木果汁，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蔗糖，經(jīng)85℃水浴滅菌15 min后降至室溫得到發(fā)酵基質(zhì)。將B和ST按體積分?jǐn)?shù)3%接入發(fā)酵基質(zhì)中，于37℃恒溫靜置發(fā)酵36 h。

1.3.3 發(fā)酵接骨木果汁酚類(lèi)化合物的提取與純化分別取一定量的未發(fā)酵和發(fā)酵接骨木果汁與無(wú)水乙醇按體積比1∶1混合均勻，然后超聲提取30 min（功率40 W，溫度40℃）后過(guò)濾，得到的濾渣再按體積比1∶1的比例加入無(wú)水乙醇進(jìn)行提取，重復(fù)提取3次，將收集到的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，即得到酚類(lèi)化合物的粗提取物，于4℃保存待純化。 采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)接骨木果汁酚類(lèi)化合物的粗提取物進(jìn)行純化。具體操作步驟為：1）AB-8大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)無(wú)水乙醇浸泡24 h使其活化，用蒸餾水沖洗至無(wú)醇味；2）取適量烘干活化好的AB-8樹(shù)脂倒入燒杯中備用；3）在燒杯中加入酚類(lèi)物質(zhì)粗提取物濃縮液、無(wú)水乙醇和AB-8大孔樹(shù)脂，攪拌均勻放置磁力攪拌器攪拌過(guò)夜；4）收集乙醇洗脫液，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，備用；5）經(jīng)冷凍干燥后得到接骨木果汁的酚類(lèi)化合物純化物。

1.3.4 DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除能力的測(cè)定DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照馮文娟[22]等的方法；超氧陰離子清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]的方法；羥自由基清除能力的測(cè)定參考鄭時(shí)蓮[24]等的方法。

1.3.5 α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)α-淀粉酶抑制率用3，5-二硝基水楊酸試劑法測(cè)定[25]。稱(chēng)取α-淀粉酶粉末用pH 6.8的PBS溶液配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的α-淀粉酶溶液。取1 mL樣品與1 mL α-淀粉酶溶液，搖勻，25℃靜置反應(yīng)10 min。隨后加入1 mL體積分?jǐn)?shù)1%可溶性淀粉（pH 6.8的PBS溶液溶解），再加入1 mL DNS溶液沸水浴5 min進(jìn)行顯色反應(yīng)，冷卻至室溫。加入蒸餾水稀釋至10 mL，540 nm處檢測(cè)吸光值，空白組以蒸餾水做對(duì)照。

式中：Ac為空白組吸光值，As為樣品組吸光值。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)α-葡萄糖苷酶抑制率參考Marilisa[26]的方法，稍做修改。具體操作為：分別取1 mL磷酸鹽緩沖液、0.2 mL α-葡萄糖苷酶溶液、0.4 mL果汁發(fā)酵液加入試管中搖勻，37℃水浴10 min，加入0.5 mL pNPG溶液搖勻，再于37℃水浴10 min，最后加入8 mL Na2CO3溶液，于405 nm處測(cè)定其吸光值，結(jié)果記為A1。取2支試管做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中不加底物pNPG的試管吸光值記為A2，另一支不加果汁的試管吸光值記為A3。

式中：A1為添加α-葡萄糖苷酶溶液、果汁和底物pNPG的吸光值，A2為添加α-葡萄糖苷酶溶液和果汁的吸光值，A3為添加α-葡萄糖苷酶溶液和底物pNPG的吸光值。

1.3.7 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代將HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好后灌滿培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到生物安全柜中操作。如細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%，將瓶中的培養(yǎng)基移入無(wú)菌瓶中留作培養(yǎng)使用，保留5~8 mL培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至90%~100%后，按要求消化傳代。棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用無(wú)菌PBS緩沖液清洗2次，加入適量胰蛋白酶消化，待細(xì)胞完全脫壁后加入培養(yǎng)基吹打均勻，分瓶培養(yǎng)，按需傳代或鋪板。

1.3.8 細(xì)胞凍存將培養(yǎng)至90%~100%的HepG2細(xì)胞于生物安全柜中棄掉舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2遍，然后加入適量0.25% EDTA溶液消化2~3 min后，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化。最后將細(xì)胞收集至15 mL離心管中，于1 000 r/min離心5 min，棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞凍存液（提前預(yù)冷）加入細(xì)胞中，吹打之后分裝到2 mL細(xì)胞凍存管中，寫(xiě)好標(biāo)簽后，用封口膜封好，最后放至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.3.9 建立HepG2細(xì)胞氧化損傷模型以未經(jīng)過(guò)樣品和H2O2處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，經(jīng)過(guò)不同濃度的H2O2處理的細(xì)胞為模型組，經(jīng)過(guò)樣品處理再經(jīng)過(guò)H2O2處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。選擇質(zhì)量濃度0、125、250、500、1 000 μg/mL的H2O2溶液（DMEM培養(yǎng)基配制）作為本實(shí)驗(yàn)濃度，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，每個(gè)孔中加入200 μL細(xì)胞懸液后置于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗1次，每個(gè)孔中加入不同質(zhì)量濃度的200 μL H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后測(cè)定細(xì)胞存活率，獲得HepG2細(xì)胞氧化損傷模型。

1.3.10 HepG2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)按照CCK-8試劑盒步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 ROS、LDH、T-AOC和CAT活力的測(cè)定取適量經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照相應(yīng)的測(cè)定試劑盒測(cè)定步驟進(jìn)行。其中ROS以熒光強(qiáng)度計(jì)，LDH用相對(duì)釋放率表示，T-AOC單位為U/mL，CAT其活力單位為U/mL。

1.3.12 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集各組細(xì)胞?？俁NA的提取根據(jù)RNA提取試劑盒提供的方法執(zhí)行，接著使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GAPDH購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)B661104。

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequence of qPCR primer

1.3.13 數(shù)據(jù)分析每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁體外抗氧化活性變化

乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁過(guò)程中抗氧化能力的變化見(jiàn)圖1?？梢钥闯?，發(fā)酵接骨木果汁對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除能力呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加對(duì)自由基的清除率提高，且發(fā)酵結(jié)束時(shí)接骨木果汁的抗氧化能力最大。經(jīng)菌種B和ST發(fā)酵后，接骨木果汁對(duì)DPPH自由基的清除能力從44.67%提高到了60.76%，對(duì)羥自由基清除率達(dá)到了75.37%，較未發(fā)酵果汁提高了20.39%，對(duì)超氧陰離子的清除能力從43.27%增加到了57.45%，表明接骨木果汁經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵后提高了抗氧化能力。這可能是由于乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵基質(zhì)中酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物的釋放以及乳酸菌分泌的抗氧化酶的抗氧化能力不同引起的。延莎[27]等使用乳酸菌發(fā)酵茶花粉后發(fā)現(xiàn)其總多酚和總黃酮含量都有明顯的增加，發(fā)酵茶花粉提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基等自由基的清除能力均高于對(duì)照組。沙棘-蘋(píng)果汁的復(fù)合果汁經(jīng)不同種類(lèi)乳酸菌發(fā)酵后，植物乳桿菌對(duì)其黃酮醇含量和抗氧化能力的提高更為明顯[28]。乳清蛋白藍(lán)莓汁混合物經(jīng)保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌單獨(dú)發(fā)酵和混菌發(fā)酵后對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除率和脂質(zhì)過(guò)氧化能力與發(fā)酵前相比均有提高[29]。

圖1 接骨木果汁發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子清除率的變化Fig.1 Changes in the scavenging rates of DPPH radicals，hydroxyl radicals and superoxide anions during the fermentation of elderberry juice

2.2 酶抑制實(shí)驗(yàn)

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶可以分解碳水化合物，從而增加人體血糖水平，通過(guò)抑制這兩種酶的活性可以有效地延緩糖類(lèi)的水解從而起到降低血糖的作用。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵接骨木果汁過(guò)程中對(duì)這2種酶抑制能力變化見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，發(fā)酵接骨木果汁對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；經(jīng)36 h的發(fā)酵，接骨木果汁對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率從52.97%提高至72.39%，對(duì)α-淀粉酶的抑制率從48.75%增加到68.62%，表明乳酸菌發(fā)酵有效提高了接骨木果汁的酶抑制能力。有文獻(xiàn)報(bào)道，Aronia果汁經(jīng)發(fā)酵后具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性[30]。李云姣[31]等發(fā)現(xiàn)，水果酵素在發(fā)酵120 d后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分別達(dá)到了99.57%和81.67%，證明水果酵素具有良好的降血糖作用。有研究表明，采用植物乳桿菌發(fā)酵黑葡萄汁后對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性顯著提高[32]。南瓜乳酸菌發(fā)酵飲料對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到（95.89±0.03）%[33]，證明南瓜經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可用于開(kāi)發(fā)降糖飲料。

圖2 接骨木果汁發(fā)酵過(guò)程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力的變化Fig.2 Changes in the inhibitory capacity of α-glucosidase and α-amylase during the fermentation of elderberry juice

2.3 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁酚類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用

不同質(zhì)量濃度酚類(lèi)物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞存活率見(jiàn)圖3。可以看出，發(fā)酵前后的接骨木果汁酚類(lèi)化合物質(zhì)量濃度在0~500 μg/mL范圍內(nèi)作用于HepG2細(xì)胞，細(xì)胞存活率均在85%以上，說(shuō)明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酚類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。

圖3 不同質(zhì)量濃度接骨木果汁酚類(lèi)物質(zhì)作用下的HepG2細(xì)胞存活率Fig.3 Survival of HepG2 cells under the different mass concentrations of phenolic substances of elderberry juice

2.4 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷質(zhì)量濃度的確定

為了確定H2O2的刺激濃度，選取質(zhì)量濃度0、125、250、500、1 000 μg/mL的H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行氧化刺激，不同質(zhì)量濃度作用下HepG2細(xì)胞存活率見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，H2O2質(zhì)量濃度在0、125、250 μg/mL下HepG2細(xì)胞存活率都在80%以上，說(shuō)明該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞沒(méi)有造成氧化損傷；而在500、1 000 μg/mL質(zhì)量濃度刺激下，HepG2細(xì)胞存活率分別為47.31%和31.27%，如果細(xì)胞存活率太高或太低，那么樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的作用效果就會(huì)不明顯，參考意義不大[34]。因此選擇刺激條件下細(xì)胞存活率接近50%的H2O2質(zhì)量濃度進(jìn)行下一步分析。

圖4 不同質(zhì)量濃度H2O2刺激下HepG2細(xì)胞存活率Fig.4 Survival rate of HepG2 cells under different mass concentrations of H2O2 stimulation

2.5 接骨木果汁酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選了誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的H2O2質(zhì)量濃度。從圖5可以看出，在質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500 μg/mL未發(fā)酵和發(fā)酵接骨木果汁酚類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度作用下，HepG2細(xì)胞的存活率都高于刺激組，說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)可有效降低H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化損傷程度。而在200 μg/mL和300 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率接近85%，有利于下一步實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。為了確保下一步實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，作者研究了200 μg/mL和300 μg/mL接骨木果汁酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

圖5 不同質(zhì)量濃度酚類(lèi)物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞的存活率Fig.5 Survival rate of HepG2 cells under the effect of different mass concentrations of phenolic substances

2.6 ROS、T-AOC、CAT、LDH的測(cè)定

不同處理?xiàng)l件下HepG2細(xì)胞中ROS水平的變化見(jiàn)圖6?？梢钥闯?，與空白組相比，僅添加H2O2處理后提高了HepG2細(xì)胞中ROS的水平，說(shuō)明促進(jìn)了氧化應(yīng)激的發(fā)生；而HepG2細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理后明顯減弱了氧化應(yīng)激作用，抑制了ROS的積累，說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)在一定程度上起到了保護(hù)作用。為了探究接骨木果汁酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，HepG2細(xì)胞先用酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理24 h，然后測(cè)定HepG2細(xì)胞T-AOC、CAT和LDH相對(duì)釋放率的變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。經(jīng)質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞總抗氧化能力顯著提高，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)的作用降低了HepG2細(xì)胞的氧化損傷程度。發(fā)酵接骨木果汁酚類(lèi)物質(zhì)的總抗氧化能力比未發(fā)酵酚類(lèi)物質(zhì)強(qiáng)。同時(shí)，用質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞的過(guò)氧化氫酶活力顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)可以有效降低H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激。乳酸脫氫酶的釋放可能是因?yàn)樵贖2O2的刺激下細(xì)胞膜受到損傷，通透性增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞中乳酸脫氫酶濃度的增加。如圖6所示，用質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞的乳酸脫氫酶相對(duì)釋放率明顯高于空白組，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。這些都說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)在一定程度上降低了H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞膜的破壞。

圖6 不同質(zhì)量濃度酚類(lèi)物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞ROS、T-AOC、CAT和LDH的變化Fig.6 Changes of ROS，T-AOC，CAT and LDH in HepG2 cells under the different mass concentrations of phenolic substances

2.7 抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的變化

抗氧化酶可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害，抑制細(xì)胞中ROS的過(guò)量生成，以維持細(xì)胞氧化還原平衡。同時(shí)，抗氧化酶可以將過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為毒性較小或無(wú)害的物質(zhì)。通過(guò)測(cè)定HO-1、NQO1和GCLC基因相對(duì)表達(dá)量，證明酚類(lèi)物質(zhì)處理后是否提高了相關(guān)酶的抗氧化活性。HO-1可以催化血紅素分解，生成的小分子產(chǎn)物具有抗氧化損傷的功能[35]，是一種重要的抗氧化酶。如圖7所示，HO-1的基因表達(dá)在經(jīng)H2O2處理的HepG2細(xì)胞中明顯降低，而在經(jīng)200、300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中明顯提高。NQO1可以通過(guò)還原反應(yīng)降低ROS的產(chǎn)生，因此NQO1能阻止外源性刺激條件對(duì)DNA造成氧化損傷，是重要的抗氧化酶之一。在H2O2刺激下HepG2細(xì)胞中的NQO1基因表達(dá)量減少，而采用質(zhì)量濃度為200、300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中NQO1基因表達(dá)量明顯增加。同時(shí)，經(jīng)H2O2刺激后HepG2細(xì)胞中GCLC表達(dá)量減少，使用質(zhì)量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中NQO1基因表達(dá)量上升。因此可以說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)可以加強(qiáng)HepG2細(xì)胞中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量。

圖7 不同質(zhì)量濃度酚類(lèi)物質(zhì)作用下HepG2細(xì)胞氧化損傷模型中的抗氧化酶相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of antioxidant enzyme-related genes in a model of oxidative damage in HepG2 cells under the different phenolic substance mass concentrations

3 結(jié)語(yǔ)

選用B和ST發(fā)酵接骨木果汁后，果汁的抗氧化活性提高，對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力也提高。研究還表明，用酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞T-AOC、CAT明顯提高；LDH相對(duì)釋放率明顯增加并且降低了細(xì)胞中活性氧的積累；這說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)能使HepG2細(xì)胞免受H2O2氧化損傷，并且發(fā)酵后的酚類(lèi)物質(zhì)作用比發(fā)酵前強(qiáng)。細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)證明，HO-1、NQO1和GCLC相關(guān)抗氧化酶的基因表達(dá)在經(jīng)H2O2處理的HepG2細(xì)胞中明顯降低，而經(jīng)酚類(lèi)物質(zhì)預(yù)處理的HepG2細(xì)胞中明顯提高。由此可見(jiàn)，發(fā)酵后果汁抗氧化能力提高的原因可能是在酚類(lèi)物質(zhì)的作用下提高了HepG2細(xì)胞中相關(guān)抗氧化酶的基因表達(dá)水平。