大腸桿菌中吡咯喹啉醌合成途徑的構(gòu)建

楊蒙雅， 張春月， 伊進(jìn)行， 王怡明， 卓明洋， 馬 倩， 謝希賢

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），4，5-二羰基-1-吡咯-2，3-f-喹啉-2，7，9-三羧酸，具有抗氧化[1]、維持線粒體功能[2]、介導(dǎo)電子傳遞等作用，在食品、農(nóng)業(yè)[3]、醫(yī)療保健[4]、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖[5-6]、傳感器制造[7-8]等行業(yè)應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)前景廣闊。目前，PQQ的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法、提取法和生物發(fā)酵法。早在1993年，Martin等人[9]就已經(jīng)能夠通過9步反應(yīng)將PQQ的產(chǎn)量提升至千克。目前PQQ的生產(chǎn)仍主要依靠化學(xué)法合成，但是利用化學(xué)法合成PQQ存在步驟多、得率低[10]、對(duì)環(huán)境污染較大、反應(yīng)能耗大等問題；提取法主要是從天然產(chǎn)物中提取，但是天然產(chǎn)品中PQQ含量極低，一般在ng/g或ng/mL的范圍內(nèi)[11]，且成本較高、利潤(rùn)較低。雖然目前有少量以納豆為原料經(jīng)提取法生產(chǎn)的PQQ，但是相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少；目前生物發(fā)酵法在一些高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)中已經(jīng)有了成功應(yīng)用。發(fā)酵法合成PQQ能夠減少對(duì)環(huán)境的污染，具有生產(chǎn)過程安全、能耗低、利潤(rùn)大的優(yōu)勢(shì)，更加符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。

PQQ生產(chǎn)菌株主要是一些革蘭氏陰性菌。其生物合成過程主要由pqq基因簇編碼的多個(gè)蛋白質(zhì)催化，不同來源的pqq基因簇存在一些差異，如肺炎克雷伯氏菌[12]（Klebsiella pneumoniae）含有一個(gè)單獨(dú)的pqqABCDEF基因簇，而氧化葡萄糖酸桿菌[13]（Gluconobacter oxydans） 和 醋 酸 鈣 不 動(dòng) 桿 菌[14]（Acinetobacter calcoaceticus）均 含 有 一 個(gè) 單 獨(dú) 的pqqABCDE基因簇，但是還有一些菌株的PQQ合成較為復(fù)雜，如Methylovorus sp.MP688[15]，除了含有一個(gè)單獨(dú)的pqqABCDE和pqqFG基因簇外，還含有4個(gè)單獨(dú)的pqqA基因；Hyphomicrobium denitrificans FJNU-R8[16]含有3個(gè)獨(dú)立的pqqA基因，一個(gè)pqqADE基因簇和一個(gè)pqqABCDE基因簇。目前研究的比較多的是氧化葡萄糖酸桿菌，相較其他來源的pqq基因，除pqqA與pqqB之間有一個(gè)較短的保守序列外，其余的pqqB、pqqC、pqqD、pqqE之間緊密相連，代謝途徑清晰，便于研究。在G.oxydans中，pqqA的作用在于生成一段含有Glu和Tyr的多肽，PqqD則是作為分子伴侶與PqqA形成一定的空間結(jié)構(gòu)，保障PqqA能夠在PqqE的作用下完成谷氨酸和酪氨酸殘基的連接，PqqC進(jìn)行PQQ合成最后一步的催化作用，PqqB則與PQQ中間產(chǎn)物在細(xì)胞周質(zhì)空間當(dāng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[17]。除pqqABCDE基因簇外，氧化葡糖酸桿菌中的tldD基因也與PQQ生物合成有關(guān)，可能與其他PQQ合成細(xì)菌中的pqqF基因具有類似的功能[18]。

PQQ天然生產(chǎn)菌株都能夠產(chǎn)生利用PQQ的蛋白質(zhì)，與這些菌株類似，大腸桿菌本身含有的D-葡萄糖脫氫酶（GDH）也以PQQ為輔酶，在合成全酶之后能夠氧化葡萄糖為葡萄糖酸，由于大腸桿菌自身缺少PQQ合成通路[19]，只能依靠攝取外源PQQ使醌蛋白表達(dá)功能[20]，但是在外源引入pqq基因簇后能夠合成PQQ[21]，這使得工程化大腸桿菌高產(chǎn)PQQ成為可能。

如表1所示，目前PQQ高產(chǎn)菌株的選育主要集中在菌種篩選和分子改造兩個(gè)方向，其中誘變篩選[22]、定向進(jìn)化[23]的效果相比基因改造更加明顯，但是定點(diǎn)篩選、定向進(jìn)化存在周期長(zhǎng)、工作量大、遺傳背景不清晰、篩選難度大、后續(xù)改造困難等一系列問題；以模式微生物為底盤進(jìn)行分子改造具有周期短、遺傳背景清晰、能夠精準(zhǔn)改造的優(yōu)點(diǎn)，其中以大腸桿菌為底盤生物進(jìn)行改造不僅在代謝合成內(nèi)源性化合物領(lǐng)域具有強(qiáng)大的工業(yè)潛力，其在重構(gòu)異源合成途徑代謝生產(chǎn)化學(xué)品領(lǐng)域也具有極大的應(yīng)用前景。

表1總結(jié)了部分前人的研究結(jié)果，目前對(duì)于pqq基因簇的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究較少，形式單一，一般是以質(zhì)粒為表達(dá)載體進(jìn)行單個(gè)基因的過表達(dá)，雖然改造周期短，效果明顯，但是質(zhì)粒和基因組上過表達(dá)的結(jié)果有一定差異。除此之外，雖然此前的研究從不同的角度進(jìn)行了嘗試，但是在大腸桿菌中異源表達(dá)pqq基因簇還沒有系統(tǒng)的研究。作者利用CRISPR/Cas9技 術(shù) 將G.oxydans 621H來 源 的pqqABCDE基因簇以及相關(guān)的基因在大腸桿菌基因組上進(jìn)行構(gòu)建與優(yōu)化，構(gòu)建的菌株72 h搖瓶發(fā)酵最高產(chǎn)量達(dá)到86.3 mg/L，是目前以大腸桿菌為底盤生物進(jìn)行基因組編輯生產(chǎn)PQQ的最高產(chǎn)量。已報(bào)道的以大腸桿菌為底盤生物進(jìn)行改造的PQQ工程菌最高產(chǎn)量為王朝絢[24]構(gòu)建的以質(zhì)粒為載體的PQQ生產(chǎn)菌，產(chǎn)量達(dá)到119.8 mg/L。與其相比，本研究的基因組改造表達(dá)更穩(wěn)定，能夠?yàn)楹罄m(xù)以大腸桿菌為底盤生物改造生產(chǎn)PQQ及相關(guān)代謝產(chǎn)物提供思路。

表1 不同微生物中PQQ提升策略及產(chǎn)量Table 1 Strategies and yields of PQQ production improvement in different microorganisms

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用的菌株與質(zhì)粒信息見表2，基因克隆與基因組編輯所用的引物信息見表3，利用E.coliDH5α進(jìn)行常規(guī)的基因克隆工作。以作者所在實(shí)驗(yàn)室 構(gòu) 建 的E.coli W3110、△lacIZ：：PxylF-T7RNAP、mlc：：mlc*即PQQ-0菌株為出發(fā)菌株；限制性內(nèi)切酶、STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶：均購自TaKaRa；引物、G.oxydans 621H來源的pqq基因簇及tlDd基因：均由蘇州金唯智科技有限公司合成；PQQ標(biāo)品：購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；KOH和NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）：購自aladdin。

表2 菌株信息Table 2 Strains used in this study

表3 本研究所用引物Table 3 Primers used in this study

續(xù)表2

續(xù)表3

續(xù)表3

1.2 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯

1.2.1 重組DNA片段構(gòu)建根據(jù)已知的目的基因序列，利用Primer Primier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過PCR獲得目的基因片段。在待敲除或待整合位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增500 bp左右的上下游同源臂。進(jìn)行基因整合時(shí)，對(duì)上游同源臂、目的基因、下游同源臂進(jìn)行重疊PCR，獲得一段完整的重組DNA片段。進(jìn)行基因敲除時(shí)，對(duì)上游同源臂和下游同源臂進(jìn)行重疊PCR。

1.2.2 pGRB質(zhì)粒的構(gòu)建利用CRISPR RGEN Tools（http：//www.rgenome.net/cas-designer/）選 擇 待整合/敲除位點(diǎn)附近的PAM序列（5′-NGG-3′），并通過合成線性化引物將相應(yīng)的20 bp的gRNA序列引入單鏈DNA中，之后通過PCR退火形成雙鏈片段。將雙鏈片段與線性化pGRB載體按照同源重組連接反應(yīng) 體系 （4 μL 5×CEⅡBuffer，50~200 ng pGRB載體，50~200 ng雙鏈目的片段，2 μL Exnase?Ⅱ重組酶，20 μL ddH2O），化學(xué)法轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)中，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒。

1.2.3 基因整合與敲除過程根據(jù)文獻(xiàn)[34]報(bào)道的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行E.coli基因組DNA的整合和敲除。操作體系由目標(biāo)重組DNA片段、提供gRNA片段的pGRB質(zhì)粒和提供Cas9蛋白及RED重組酶的pREDCas9質(zhì)粒構(gòu)成。具體方法為：先將pREDCas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至待改造的E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，然后將上述重組pGRB質(zhì)粒和重組DNA片段電轉(zhuǎn)至含有pREDCas9質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)后加入SOC復(fù)蘇液于32℃培養(yǎng)2 h，取100 μL菌液涂布于AmpR和SpeR抗性的培養(yǎng)皿，32℃培養(yǎng)，篩選陽性克隆。將篩選到的陽性菌株在含0.2 g/dL阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)pREDCas9中的pGRB消除系統(tǒng)，對(duì)pGRB質(zhì)粒進(jìn)行消除，篩選在奇霉素抗性平板生長(zhǎng)但在氨芐霉素抗性平板不生長(zhǎng)的陽性克隆，即為丟失了pGRB質(zhì)粒的克隆。利用pREDCas9的溫敏特性，可以在42℃培養(yǎng)過夜消除，篩選在無抗平板生長(zhǎng)而在SpeR平板不生長(zhǎng)的單克隆菌株，即為相應(yīng)改造的無質(zhì)粒工程菌株[34]。

1.3 搖瓶發(fā)酵

首先在5 mL LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L）中進(jìn)行菌種活化，其次在固體斜面培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，牛肉膏10 g/L，蔗糖1 g/L，瓊脂粉20 g/L）進(jìn)行菌種二代活化，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)移至新的固體斜面進(jìn)一步培養(yǎng)12 h。用接種環(huán)刮取菌體，接種于500 mL三角瓶中（含有30 mL培養(yǎng)基），用九層紗布封口，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)10~12 h至OD600為8.0左右。種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，體積分?jǐn)?shù)2%苯酚紅溶液，消泡劑1滴，pH 7.0~7.2。

將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.12 g/L，KH2PO43 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1 g/L，CaCl26H2O 0.219 g/L，MgSO4·7H2O 0.492 g/L，木糖10 g/L，2%苯酚紅溶液，pH 7.0，消泡劑1滴。在發(fā)酵過程中，根據(jù)苯酚紅指示劑的顏色變化，及時(shí)以氨水調(diào)整pH至7.0左右，以60 g/dL的葡萄糖溶液補(bǔ)充碳源。

1.4 PQQ檢測(cè)方法

1.4.1 幾種檢測(cè)方法的比較目前檢測(cè)PQQ的方法有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、酶法檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)、非酶法檢測(cè)等。PQQ極易溶于水，且攜帶3個(gè)羧基，顯酸性，液相檢測(cè)法在15.625~500 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，但是檢測(cè)時(shí)易拖尾且峰寬，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[39-40]。比高效液相色譜法更精確的檢測(cè)方法如液質(zhì)聯(lián)用[41]等檢測(cè)限也都遠(yuǎn)高于實(shí)際產(chǎn)量，且檢測(cè)前需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，由于在預(yù)處理過程中可能導(dǎo)致一部分PQQ損失，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。酶法檢測(cè)比較靈敏，能夠檢測(cè)到20×10-12g的PQQ[42]，但是由于PQQ易與親核的氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)[43]，因此目前在大腸桿菌中構(gòu)建PQQ代謝通路選擇的培養(yǎng)基均為細(xì)菌基本培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中僅有的碳源為葡萄糖，而發(fā)酵液中含有Mg2+、Ca2+，酶法檢測(cè)的原理是預(yù)先混合PQQ和純化后的D-GDH（或粗酶液）反應(yīng)一段時(shí)間后形成有活性的DGDH，隨后加入反應(yīng)液[44]（含DCIP、PMS、葡萄糖、MgSO4的混合溶液），形成了氧化還原反應(yīng)完整的反應(yīng)鏈，通過計(jì)算DCIP的褪色速率與標(biāo)準(zhǔn)品比較可以計(jì)算得到發(fā)酵液中PQQ的濃度。但是發(fā)酵液中濃度不等的殘留葡萄糖會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，尤其對(duì)于補(bǔ)料分批培養(yǎng)。非酶法檢測(cè)PQQ[45]應(yīng)用廣泛，主要利用PQQ在堿性條件下氧化甘氨酸，將電子傳遞給NBT，使得NBT生成藍(lán)紫色的甲臜類化合物，該物質(zhì)在OD530有最大吸光度，非酶法檢測(cè)不僅能夠同時(shí)處理多個(gè)樣品，檢測(cè)限可以低至3.906 ng/mL，而且發(fā)酵液中的殘?zhí)菍?duì)其無影響[24，28，32-51]?；谝陨媳容^，本實(shí)驗(yàn)選擇的檢測(cè)方法為非酶法。

1.4.2 PQQ的非酶法檢測(cè)將待測(cè)樣品于13 000 r/min離心3 min，取上清液。依次在96孔板中加入180 μL Gly-KOH溶液（2 mol/L Glycine，用KOH將pH調(diào)至10），80 μL PB溶液（NaH2PO4·2H2O 1.911 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.776 g/L），20 μL樣品，20 μL NBT母液（NBT固體2.943 g/L，用20 mmoL PB溶液溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻后于30℃避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD530條件下的吸光度。

1.5 菌體量的計(jì)算

使用分光光度計(jì)測(cè)量菌液稀釋后的OD600，并且對(duì)烘干后的菌體進(jìn)行稱重，得到細(xì)胞干質(zhì)量與OD600之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

DCW（g/L）=0.382×OD600×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 過表達(dá)pqqA和pqqB對(duì)PQQ產(chǎn)量及生物量的影響

在PQQ的合成中，PqqA作為其前體物質(zhì)，在分子伴侶PqqD的保護(hù)下經(jīng)過PqqE的作用完成谷氨酸和酪氨酸殘基的連接，PqqB負(fù)責(zé)中間產(chǎn)物在周質(zhì)空間當(dāng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)，PqqC負(fù)責(zé)合成最后的催化，TlDd可能起到切割作用。PqqA作為前體物提升其表達(dá)量能夠促進(jìn)PQQ的產(chǎn)生。以作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的E.coli W3110，△lacIZ：：PxylF-T7RNAP，mlc：：mlc*即PQQ-0為出發(fā)菌，該菌株基因組上已經(jīng)整合了T7RNA聚合酶，可以通過添加木糖控制T7RNA聚合酶的表達(dá)。由于基因距離啟動(dòng)子的位置不同會(huì)導(dǎo)致表達(dá)量不同，柯崇榕等[16]以雙質(zhì)粒系統(tǒng)分別過表達(dá)了脫氮生絲微菌來源的pqqA和pqqBCDEF，與單質(zhì)粒系統(tǒng)相比，產(chǎn)量有所提升。楊雪鵬等[29]比較了G.oxydans 621H來源的pqq基因簇在不同質(zhì)粒中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)以PET-28a為表達(dá)載體產(chǎn)量最高，能夠達(dá)到約2 mg/L，說明PT7啟動(dòng)子也適合于PQQ的合成。因此，在PQQ-0的基礎(chǔ)上，我們?cè)趍bha和ygay這兩個(gè)假基因位點(diǎn)以PT7為啟動(dòng)子整合了pqqA和pqqBCDE基因簇，打通了PQQ合成通路，構(gòu)建了PQQ-1菌株。

G.oxydans 621H中pqqABCDE共用一個(gè)啟動(dòng)子，Li等[46]的研究表明，pqqA的表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其余幾個(gè)pqq基因，這也符合PqqA作為PQQ合成前體物的特征。李盼盼[47]的研究也表明，外源添加PqqA就能夠提升PQQ產(chǎn)量。PQQ的結(jié)構(gòu)中有谷氨酸和酪氨酸，雖然谷氨酸和酪氨酸不是其直接的前體物，但已有實(shí)驗(yàn)證明了外源添加谷氨酸和酪氨酸能夠提升PQQ的產(chǎn)量[31-32]。增強(qiáng)pqqA的表達(dá)可以為PQQ的合成提供直接前體物，因此，本研究在菌株P(guān)QQ-1中利用PT7啟動(dòng)子強(qiáng)化了pqqA的表達(dá)，得到了PQQ-2菌株，搖瓶發(fā)酵72 h的結(jié)果見圖1。PQQ-1產(chǎn) 量 為62.6 mg/L，強(qiáng) 化 了PqqA合 成 的PQQ-2菌 株 產(chǎn) 量 為67.8 mg/L，較PQQ-1提 升8.3%，且生物量提升4.3%?？梢姡瑥?qiáng)化pqqA的表達(dá)對(duì)PQQ的合成與菌體生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。

圖1 過表達(dá)pqqA和pqqB對(duì)PQQ合成及菌體量的影響Fig.1 Effects of over-expression of pqqA and pqqB on PQQ synthesis and biomass

在PQQ-2的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步強(qiáng)化pqqB的表達(dá)，分別以Ptrc和PT7為啟動(dòng)子，在PQQ-2中同一假基因位點(diǎn)過表達(dá)了pqqB，構(gòu)建了菌株P(guān)QQ-3和PQQ-4。PQQ-3菌株與PQQ-4菌株72 h PQQ產(chǎn)量較PQQ-2均上升，產(chǎn)量分別為68.8 mg/L和82.3 mg/L。從生物量的角度考慮，PQQ-3的生物量較PQQ-2下降了3.6%，下降的幅度較小，而PQQ-4的生物量較PQQ-2下降了9.3%，也低于PQQ-1的菌體量。PQQ-4在搖管活化培養(yǎng)中也出現(xiàn)了菌體早衰的現(xiàn)象，結(jié)合后續(xù)改造的需要考慮，我們選擇了PQQ-3作為下一步改造的出發(fā)菌。PQQ-3和PQQ-4的產(chǎn)量和菌體量的差異可能是由于PT7的啟動(dòng)強(qiáng)度較Ptrc更強(qiáng)，PQQ-4在表達(dá)更多PqqB蛋白的同時(shí)對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響更大。Wang等[48]在G.oxydans WSH003中以pqqA的啟動(dòng)子和tufB啟動(dòng)子分別過表達(dá)pqq單個(gè)基因時(shí)也印證了強(qiáng)啟動(dòng)子能夠更大程度促進(jìn)PQQ的生產(chǎn)。

2.2 過表達(dá)pqqC、pqqD及pqqE對(duì)PQQ產(chǎn) 量及菌體量的影響

選擇篩選出的PQQ-3作為出發(fā)菌，探索過表達(dá)pqqC、pqqD、pqqE對(duì)產(chǎn)量提升以及對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。由于PT7啟動(dòng)子過強(qiáng)，在PQQ-4的培養(yǎng)和發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較大，因此后續(xù)改造均選擇Ptrc啟動(dòng)子進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)控制。分別在PQQ-3菌株中引入Ptrc控制的pqqC、pqqD、pqqE基因，得到PQQ-5、PQQ-6、PQQ-7菌株；在PQQ-5菌株中引入Ptrc控制的pqqC，構(gòu)建了PQQ-8；在PQQ-6中引入Ptrc控制的pqqD，得到PQQ-9；在PQQ-7中引入Ptrc控制的pqqE，得到PQQ-10，發(fā)酵結(jié)果見圖2。改造后只有PQQ-7產(chǎn)量較PQQ-3有所上升，72 h產(chǎn)量能夠達(dá)到74.8 mg/L，較改造前上升了8.7%，其余的菌株P(guān)QQ產(chǎn)量在改造后均出現(xiàn)了下降。

圖2 過表達(dá)pqqC、pqqD及pqqE對(duì)PQQ產(chǎn)量及菌體量的影響Fig.2 Effects of over-expression of pqqC,pqqD and pqqE on PQQ yield and biomass

本研究的結(jié)果表明，pqqA、pqqB和pqqE在大腸桿菌基因組上的過表達(dá)對(duì)PQQ產(chǎn)量的提升有正向作用，且在pqqA的過表達(dá)中強(qiáng)啟動(dòng)子PT7的效果優(yōu)于Ptrc。但是對(duì)于pqqC和pqqD的表達(dá)后出現(xiàn)了產(chǎn)量下降，推測(cè)原因可能是在PQQ的合成過程中，PqqC蛋白行使的是PQQ生成最后一步的催化功能，PqqD蛋白作為pqqA的分子伴侶，其參與的反應(yīng)可能不是PQQ合成的限速步驟，因此在pqqC和pqqD過表達(dá)以后，降低了其他關(guān)鍵酶的表達(dá)量，導(dǎo)致PQQ-5和PQQ-6較PQQ-3產(chǎn)量下降，因此選擇PQQ-7作為下一步改造的出發(fā)菌株。

2.3 過表達(dá)不同來源的tlDd基因?qū)QQ產(chǎn)量及生物量的影響

G.oxydans 621H中對(duì)PQQ合成有影響的除了pqqABCDE以外，還有距離該基因簇較遠(yuǎn)的tlDd基因，該基因編碼TlDd蛋白，TlDd蛋白可能執(zhí)行PqqF的剪切功能[18]。對(duì)G.oxydans 621H中tlDd進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，序列比對(duì)顯示，G.oxydans 621H與E.coli K-12 W3110中的tlDd基因同源性高達(dá)56%。大腸桿菌自身含有的tlDd可能在PQQ合成中發(fā)揮作用，這也是只在E.coli中過表達(dá)pqqABCDE基因簇就能合成PQQ的原因之一。為了比較兩個(gè)來源的tlDd基因過表達(dá)對(duì)PQQ產(chǎn)量的影響，我們?cè)赑QQ-7菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了4個(gè)菌株，均選擇對(duì)生長(zhǎng)影響較小的Ptrc啟動(dòng)子進(jìn)行過表達(dá)。

為了探究不同來源的tlDd基因?qū)QQ產(chǎn)量提升的影響，在PQQ-7菌株上以Ptrc啟動(dòng)子過表達(dá)E.coli來源的tlDd基因，分別得到了tlDd雙拷貝菌株P(guān)QQ-11和三拷貝菌株P(guān)QQ-13。在PQQ-7菌株上以Ptrc啟動(dòng)子過表達(dá)G.oxydans 621H來源的tlDd基因，分別得到了tlDd雙拷貝菌株P(guān)QQ-12和三拷貝菌株P(guān)QQ-14。發(fā)酵72 h后產(chǎn)量和菌體量見圖3。在不同批次的發(fā)酵中，由于搖瓶發(fā)酵過程中補(bǔ)氨和補(bǔ)糖的差異，導(dǎo)致PQQ-7產(chǎn)量和菌體量的差異。PQQ-11、PQQ-12、PQQ-13、PQQ-14這4株菌較PQQ-7產(chǎn)量均有所上升，說明本研究選擇的E.coli和G.oxydans兩種不同來源的tlDd基因?qū)τ赑QQ的產(chǎn)量提升都有促進(jìn)作用，而PQQ-11較PQQ-12的產(chǎn)量更高，原因可能為大腸桿菌對(duì)自身來源的基因適配性更好。對(duì)于同一來源的tlDd基因過表達(dá)，PQQ-11較PQQ-7產(chǎn)量和菌體量分別提高25.1%和5.2%；PQQ-12較PQQ-7產(chǎn)量提高9.8%，菌體量幾乎一樣，但是兩個(gè)參數(shù)的提升量均低于PQQ-11，說明在PQQ-11中進(jìn)一步強(qiáng)化表達(dá)tlDd基因會(huì)對(duì)菌體量和產(chǎn)量均產(chǎn)生不利影響。綜合PQQ產(chǎn)量和生物量?jī)蓚€(gè)參數(shù)的結(jié)果，選擇PQQ-11作為下一步改造的出發(fā)菌株。

圖3 過表達(dá)不同來源的tlDd基因?qū)QQ產(chǎn)量及生物量的影響Fig.3 Effects of over-expression of tlDd from different source on PQQ yield and biomass

2.4 敲除iscR、過表達(dá)gcd和ompA對(duì)PQQ產(chǎn)量及菌體量的影響

大腸桿菌中存在鐵-硫簇抑制[49]，柯崇榕的研究表明，在培養(yǎng)基中加入Fe2+或敲除大腸桿菌中Fe-S簇的轉(zhuǎn)錄抑制子iscR均能提高PqqE的表達(dá)量，但是通過添加Fe2+的方法需要實(shí)驗(yàn)確定添加量，過量反而會(huì)抑制PQQ的生產(chǎn)[16]，因此嘗試通過敲除iscR解除鐵-硫簇抑制。在PQQ-11菌株中敲除iscR基因，獲得PQQ-15菌株，PQQ產(chǎn)量由52.4 mg/L提升為69.2 mg/L，提升了32.1%，菌體量由5.6 g/L提升為6.4 g/L，提升了14.3%，見圖4。iscR的敲除在本研究中對(duì)PQQ提升的作用最大，表明E.coli中可能還存在一些內(nèi)源基因?qū)QQ的合成有抑制作用。

圖4 敲除iscR、過表達(dá)gcd和ompA對(duì)PQQ產(chǎn)量及生物量的影響Fig.4 Effects of knockout of iscR,and over-expression of gcd and ompA on PQQ yield and biomass

目前報(bào)道的PQQ的高產(chǎn)菌株仍然以甲基營(yíng)養(yǎng)菌居多，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，這類菌株的細(xì)胞膜上有多種能夠利用PQQ的蛋白質(zhì)[50]。由于GDH的合成并不依賴于PQQ，但是PQQ的合成卻在GDH合成之后才開始[43]。韓增葉[51]的研究表明，在大腸桿菌中引入外源PQQ合成途徑后，在高濃度葡萄糖的刺激下，GDH的表達(dá)量有明顯提升。由于GDH本身是脫輔基蛋白質(zhì)，只有在和PQQ以及Mg2+或Ca2+形成全酶后才有活性。隨著PQQ產(chǎn)量的增加，勢(shì)必要提升離子的濃度來適配高產(chǎn)量的PQQ，因此優(yōu)化Mg2+添加量[51]后能夠通過提升GDH的表達(dá)量間接促進(jìn)PQQ的生產(chǎn)。在PQQ-15菌株的基礎(chǔ)上，以Ptrc啟動(dòng)子過表達(dá)E.coli K-12 W3110自身來源的gcd基因，得到了菌株P(guān)QQ-16，與PQQ-15相比，PQQ-16產(chǎn)量由69.2 mg/L提升至86.2 mg/L，提升了24.6%，菌體量也由改造前的6.4 g/L提升至6.6 g/L。

ompA是大腸桿菌孔蛋白基因，文獻(xiàn)[24]在肺炎克雷伯氏菌中過表達(dá)ompA，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了胞內(nèi)PQQ向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。因此在PQQ-16的菌株基礎(chǔ)上以Ptrc強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)了ompA孔蛋白基因，試圖將胞內(nèi)產(chǎn)生的PQQ及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，避免其在胞內(nèi)的消耗，解除可能存在的反饋抑制。結(jié)果表明，與PQQ-16相比，PQQ-17產(chǎn)量略有上升，為86.3 mg/L，菌體量有一定上升，為7.0 g/L。結(jié)果表明，以強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc過表達(dá)E.coli自身來源的ompA孔蛋白基因能夠有限提升胞外PQQ濃度，但是產(chǎn)量提升幅度非常小，說明在PQQ-16菌株中，PQQ從胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)并沒有受到孔蛋白OmpA表達(dá)量的限制。

作者系統(tǒng)研究了異源表達(dá)G.oxydans 621H操縱子pqqABCDE以及優(yōu)化底盤相關(guān)基因?qū)QQ合成的影響，獲得了一株能夠高效合成PQQ的工程菌，搖瓶發(fā)酵72 h產(chǎn)量達(dá)到86.3 mg/L。

3 結(jié)語

作者成功構(gòu)建了PQQ生產(chǎn)工程菌，為了進(jìn)一步提升PQQ的產(chǎn)量，后續(xù)改造思路為對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[24，47-52]，如培養(yǎng)基中的酪氨酸和谷氨酸添加量、金屬離子添加量、發(fā)酵過程中的溶氧等；阻斷部分非必要的碳源代謝降低副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生[31]。