紫山藥多酚分離純化及其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

朱延勝，魏明，錢森和，趙世光

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

紫山藥(DioscroreaalataL.)是山藥的一種，具有養(yǎng)胃潤肺、益腎健脾等功效，是一種藥食兩用植物[1]。紫山藥含有多糖、花青素、薯蕷皂苷、尿囊素、多酚等活性成分，具有抗氧化、延緩衰老、降血糖、降血脂等功能，這些功能與其生物活性物質(zhì)密切相關(guān)[2-4]。

抑制α-葡萄糖苷酶的活性是防治糖尿病的有效手段，通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可以防止餐后血糖水平升高[5]。KWON等[6]研究發(fā)現(xiàn)，從茄子里提取的酚類物質(zhì)具有抑制糖代謝相關(guān)酶活性的作用。LES等[7]發(fā)現(xiàn)石榴汁中的酚類物質(zhì)具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。GUO等[8]研究發(fā)現(xiàn)，紫山藥乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。因此，分離純化紫山藥多酚，并研究其α-葡萄糖苷酶抑制活性，對明確紫山藥多酚的降血糖作用具有重要意義。

大孔樹脂具備較強的選擇性和吸附性能，使用成本低，受雜質(zhì)及酸堿的影響較小，性質(zhì)穩(wěn)定再生能力強，在天然活性成分的分離純化方面得到了廣泛應(yīng)用[9]。不同的植物所含的酚類物質(zhì)性質(zhì)不同，不同樹脂的極性、顆粒大小和比表面積均能影響其對酚類物質(zhì)純化的效果，所以，選擇適宜的樹脂至關(guān)重要[10]。近年來，大孔樹脂在植物多酚分離純化方面的研究已有大量文獻(xiàn)報道，且取得了良好的效果[11-12]。ZHANG等[13]利用離子液體協(xié)同超聲提取紫山藥多酚，取得了良好的提取效率。大孔樹脂分離純化紫山藥多酚尚未見報道。

本文探討了大孔樹脂對紫山藥多酚的分離純化效果，利用不同洗脫劑獲得不同洗脫組分，比較不同洗脫組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并分析多酚的組成，研究結(jié)果為闡明紫山藥酚類物質(zhì)的降血糖活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫山藥產(chǎn)自廣州增城縣；D4006、AB-8、D101、ADS-7、NKA-9型大孔樹脂，鄭州和成新材料科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside,pNPG)，分析純，Amresco 公司；各種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，Sigma公司其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHL-B型電腦恒流泵，上海青浦滬西儀器廠；BSZ-100型自動部分收集器，上海琪特分析儀器有限公司；RE52-AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JC-LDGZ-12S型冷凍干燥機，青島聚創(chuàng)環(huán)保有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫山藥粗多酚的制備

將紫山藥洗滌后，切片冷凍干燥，研磨成粉末后過100目篩備用。取100 g紫山藥粉于10 L提取罐中，加入7 L蒸餾水，60 ℃條件下浸提2.5 h，過濾去渣后將溶液濃縮至100 mL，加入400 mL無水乙醇，放入4 ℃冰箱內(nèi)靜置24 h后過濾除去絮狀沉淀，收集濾液濃縮后，置于冷凍干燥機內(nèi)干燥48 h，得到紫山藥粗多酚備用。

1.3.2 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂預(yù)處理和篩選參考楊希娟等[12]的方法略作修改，將一定量的大孔樹脂預(yù)處理后風(fēng)干備用，稱取5種大孔樹脂各1 g，置于5個250 mL的三角瓶中，分別加入200 mL、0.91 g/L的紫山藥粗多酚溶液，在室溫下于120 r/min振蕩12 h后，測定多酚濃度，過濾取出吸附飽和的樹脂，放入5個250 mL三角瓶中，分別加入50%的乙醇溶液200 mL，振蕩解吸12 h后測定多酚濃度。根據(jù)公式(1)和公式(2)分別計算樹脂的吸附率和解吸率[14]。

(1)

(2)

式中：C0，吸附前溶液中多酚質(zhì)量濃度，g/L；C1，吸附平衡后溶液中剩余多酚的質(zhì)量濃度，g/L；C2，解吸平衡后溶液中多酚的質(zhì)量濃度，g/L。

1.3.3 AB-8樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗

1.3.3.1 吸附時間確定

準(zhǔn)確稱取AB-8樹脂1 g，放入5個250 mL的三角瓶中，分別加入200 mL、2.0 g/L的紫山藥粗多酚溶液。在室溫下于120 r/min下振蕩，每隔1 h測定各三角瓶中溶液多酚濃度，計算吸附率。

1.3.3.2 多酚濃度對大孔樹脂吸附率的影響

參考巫永華等[14]的方法略作修改，準(zhǔn)確稱取6份AB-8樹脂各1 g，將其放入6個250 mL的三角瓶中，加入200 mL質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L 的紫山藥粗多酚溶液，在室溫下于120 r/min下振蕩4 h，測定各三角瓶中溶液多酚濃度，計算吸附率。

1.3.3.3 pH值對吸附率的影響

準(zhǔn)確稱取7份AB-8樹脂各1 g，分別放入7個250 mL的三角瓶中，分別加入200 mL、2.0 g/L的不同pH值的紫山藥粗多酚溶液(pH= 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，在室溫下于120 r/min振蕩4 h，測定各三角瓶中溶液多酚濃度，計算吸附率。

1.3.3.4 乙醇濃度對解吸率的影響

參考巫永華等[14]的方法略作修改，準(zhǔn)確稱取8份AB-8樹脂各1 g，放入8個250 mL的三角瓶中，分別加入200 mL、2.0 g/L 的紫山藥粗多酚溶液，在室溫下于120 r/min下振蕩4 h，測定各三角瓶中溶液多酚濃度，抽濾取出樹脂后，再放入8個250 mL的三角瓶中，分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液200 mL，振蕩解吸12 h后，測定各三角瓶中溶液多酚濃度，計算解吸率。

1.3.4 AB-8樹脂動態(tài)吸附-解吸試驗

1.3.4.1 上樣流速對樹脂吸附效果的影響

將適量的AB-8大孔樹脂濕法填充入25 mm×300 mm的色譜柱中，用蒸餾水沖壓至平衡無氣泡。用質(zhì)量濃度為2.0 g/L的紫山藥粗多酚，分別以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速進(jìn)行上樣，底部收集流出液，自動收集器設(shè)定每管5 mL，每管吸取0.1 mL溶液測定其多酚的濃度。

1.3.4.2 洗脫流速對解吸率的影響

大孔樹脂吸附飽和后，以50%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇為洗脫劑，分別以0.6、1.2、1.8 mL/min的流速洗脫，底部收集流出液，自動收集器設(shè)定每管5 mL，每管吸取0.1 mL溶液測定其多酚的濃度。

1.3.5 總酚含量的測定

參考LUENGO[15]的方法略作修改。配制質(zhì)量濃度為0.10 g/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.792 6x+0.009 4，R2=0.999 4。測定樣品中多酚含量時，按照作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行操作，根據(jù)回歸方程計算樣品中多酚濃度。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定

參照GHANI等[16]的方法略作修改，具體如下：96微孔板反應(yīng)體系中加入40 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，然后加入不同待測樣品40 μL，置于37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min，再加入pNPG溶液40 μL，然后恒溫孵育30 min，再加入120 μL 0.2 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于405 nm處檢測吸光度值，計算其IC50。

(3)

式中：A0，酶與底物反應(yīng)后的吸光值；A1，加入樣品后酶與底物反應(yīng)的吸光值；A2，樣品自身吸光值。

1.3.7 不同洗脫劑洗脫組分的α-葡萄糖苷酶的抑制活性

分別用50%的乙醇、三氯甲烷和乙酸乙酯作為洗脫劑，洗脫飽和吸附紫山藥粗多酚的樹脂柱，收集不同的洗脫組分，分別測定不同洗脫組分的α-葡萄糖苷酶活性抑制率，以阿卡波糖為陽性對照，以粗多酚作為陰性對照。

1.3.8 高效液相色譜法分析紫山藥多酚單酚成分

準(zhǔn)確稱取一定量的兒茶素、山奈酚、槲皮素、蘆丁、沒食子酸、表兒茶素、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.4 g/L的單一標(biāo)準(zhǔn)液，各取200 μL混合，再用0.22 μm濾膜過濾后用于HPLC檢測。

分析條件：依利特 C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃，紫外檢測波長280 nm，進(jìn)樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min。流動相梯度洗脫程序：A:甲醇；B：0.1%冰乙酸；流動相梯度：0 min(85%B)，10 min(75%B)，25 min(65%B)，35 min(55%B)，60 min(5%B)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，采用Origin 2019b制圖。做3次平行測定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳樹脂的篩選

由圖1可知，不同的樹脂對紫山藥多酚的吸附能力差異較大，NKA-9吸附率最高，為77.3%，而AB-8吸附率為72.2%，二者差異不明顯(P>0.05)，D101吸附率最低，僅為52.2%。從解吸效果上看，D101解吸率最高，為89.6%，AB-8的解吸率為87.7%，二者差異不明顯(P>0.05)，D4006解吸率最低，為69.3%。不同的大孔樹脂由于其極性、比表面積和孔徑等不同，對天然產(chǎn)物會表現(xiàn)出不同的吸附和解吸性能[14]。NKA-9具有較高的吸附率，但解吸率較低。D101解吸率高，但吸附率較低。綜合比較考慮，AB-8樹脂保持了較高的吸附率，同時又具有較高的解吸率。所以，選擇AB-8樹脂分離純化紫山藥多酚較為合適。

圖1 五種大孔樹脂的吸附-解吸效果比較Fig.1 Comparison of adsorption and desorption properties of five resins注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 靜態(tài)吸附、解吸試驗結(jié)果

2.2.1 AB-8樹脂的靜態(tài)吸附曲線

由圖2可知，在AB-8大孔樹脂吸附紫山藥多酚的過程中，吸附時間小于4 h時，吸附率與吸附時間呈明顯的正相關(guān)性。但當(dāng)吸附時間超過4 h，吸附率的增加放緩，這是由于樹脂對于紫山藥多酚的吸附接近飽和狀態(tài)。因此，選定AB-8樹脂對于紫山藥多酚的靜態(tài)吸附時間為4 h，此時吸附率為85.43%。

圖2 AB-8樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curve of AB-8 resin

2.2.2 樣品濃度對AB-8樹脂吸附率的影響

由圖3可知，在質(zhì)量濃度低于2.0 g/L時，紫山藥多酚質(zhì)量濃度與吸附率呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度為2.0 g/L時吸附率最大，濃度繼續(xù)增大，吸附率有所降低。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度增加有利于酚類物質(zhì)分子與樹脂的接觸，提高樹脂的吸附率，但是濃度過高溶液黏度增加，流動性降低，且體系中相關(guān)雜質(zhì)也會增加，不利于酚類物質(zhì)與樹脂的接觸，從而降低了吸附率[17]。因此，選擇多酚質(zhì)量濃度為2.0 g/L作為分離純化的上樣濃度，此時吸附率為89.33%。

圖3 樣品濃度對AB-8樹脂吸附率的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption rate of AB-8 resin

2.2.3 樣品溶液pH對AB-8樹脂吸附率的影響

由圖4可知，溶液的pH值為2～5時，AB-8樹脂對紫山藥多酚的吸附率與溶液的pH值呈正相關(guān)，樣品液的pH值為5時吸附率最高，此時吸附率為91.97%。當(dāng)pH繼續(xù)升高時，吸附率反而降低。多酚是一類含有羥基的化合物，pH的大小直接影響酚類物質(zhì)在溶液中的狀態(tài)[18]。紫山藥多酚溶液在弱酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，有利于AB-8樹脂對酚類物質(zhì)的吸附，當(dāng)溶液酸性減弱時，更多的酚羥基電離，致使酚類物質(zhì)與大孔樹脂間的作用減弱，從而降低了大孔樹脂對多酚的吸附能力，導(dǎo)致吸附率降低[19]。

圖4 pH值對AB-8樹脂吸附率的影響Fig.4 Effects of pH value on absorption rate of AB-8 resin

2.2.4 乙醇濃度對解吸率的影響

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～90%時，解吸率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%時，其對紫山藥多酚的解吸率最大，為87.7%。乙醇水溶液對多酚的解吸率與其極性有關(guān)，隨著乙醇濃度的增大，其極性降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，紫山藥中酚類物質(zhì)的極性可能與此時溶液的極性更相近，更多的酚類物質(zhì)被解吸下來。因此，選擇50%的乙醇作為解吸劑較為適宜。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8樹脂解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on desorption rate of AB-8 resin

2.3 動態(tài)吸附-解吸試驗結(jié)果

2.3.1 動態(tài)吸附曲線

由圖6可知，上樣流速對AB-8樹脂吸附有較大影響，隨著樣品流速的增大，泄漏點出現(xiàn)的時間越早，樹脂的吸附量越少，這個可能與流速過大會導(dǎo)致吸附的多酚重新被洗脫下來有關(guān)[20]。當(dāng)樣品流速分別為0.5、1.0、1.5 mL/min時，泄露點分別在110、80、40 mL時出現(xiàn)，此時的吸附量分別為198、144、72 mg。試驗結(jié)果表明，上樣流速越慢，樹脂吸附的多酚越多，為了提高整個樹脂吸附效率，縮短分離純化時間，上樣流速為1.0 mL/min較為適宜。

圖6 上樣流速對吸附效果的影響Fig.6 Effect of loading velocity on adsorption

2.3.2 動態(tài)洗脫曲線

由圖7可知，洗脫速度為0.6 mL/min時，洗脫液的濃度峰值出現(xiàn)在第4管，酚類物質(zhì)主要集中在1～12管；而流速為1.2、1.8 mL/min時，洗脫液的濃度峰值均在第6管，但后者的洗脫液濃度峰值較低，酚類物質(zhì)分別集中在1～14管與1～17管，由此可見，以流速為1.2 mL/min洗脫時，酚類物質(zhì)洗脫的較為集中且耗時短。一般來說，洗脫液的流速慢有利于洗脫劑與樹脂上的多酚接觸從而充分解吸，但如果流速過慢，會導(dǎo)致解吸的時間過長，流動過程中一些被洗脫下來的多酚可能會被重新吸附[21]，而洗脫液的流速過快時，會導(dǎo)致洗脫劑與樹脂接觸時間過短，洗脫劑不能充分解吸多酚，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，降低生產(chǎn)效率[21]。因此，選擇1.2 mL/min的洗脫流速較為適宜，在此條件下，洗脫液體積為104 mL，多酚回收率為72.7%，多酚純度由13.91%提升到59.06%，純度提高了3.25倍。

圖7 洗脫流速對解吸效果的影響Fig.7 Effect of elution velocity on desorption

2.4 不同溶劑洗脫組分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

α-葡萄糖苷酶是一種重要的碳水化合物水解酶，抑制α-葡萄糖苷酶的活性能有效減少碳水化合物的水解，降低腸道對葡萄糖的吸收，從而降低血糖濃度，對于治療和預(yù)防糖尿病具有重要的意義[22]。分別用50%乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷作為洗脫劑，獲得了3種洗脫組分，測定了其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。結(jié)果如圖8所示，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品濃度與α-葡萄糖苷酶的抑制率呈正相關(guān)，但不同洗脫溶劑洗下來的多酚組分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用差異較大，由圖8可知，乙酸乙酯洗脫組分>50%乙醇洗脫組分>三氯甲烷洗脫組分。由表1可知，乙酸乙酯洗脫組分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性的IC50值最小，為0.126 g/L，50%乙醇的IC50值為0.216 g/L，而三氯甲烷的IC50值為14.69 g/L。由此可見，乙酸乙酯洗脫組分中含有較多的抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分。

圖8 不同溶劑洗脫物的α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.8 The α-glucosidase inhibition ability of eluted fractions with different solvents

表1 不同洗脫組分的α-葡萄糖苷酶活性抑制比較(IC50值)Table 1 Comparison of α-glucosidase inhibition of eluted fractions with different solvents (IC50value)

2.5 紫山藥多酚不同洗脫組分分析

由圖9可知，與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對照，50%乙醇洗脫組分主要含有兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁和槲皮素；乙酸乙酯洗脫物中主要含有綠原酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁和槲皮素；三氯甲烷含有沒食子酸，其他未知。有研究表明，綠原酸[23]、槲皮素[24]、蘆丁等具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且蘆丁[25]對α-葡萄糖苷酶的抑制作用較強，這與實驗得出的乙酸乙酯洗脫組分具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性相一致。

1-沒食子酸；2-兒茶素；3-綠原酸；4-咖啡酸；5-表兒茶素；6-阿魏酸；7-蘆丁；8-槲皮素；9-山奈酚a-標(biāo)準(zhǔn)品；b-50%乙醇洗脫物；c-乙酸乙酯洗脫物；d-三氯甲烷洗脫物圖9 標(biāo)準(zhǔn)品和不同洗脫組分的高效液相色譜圖Fig.9 The HPLC results of polyphenols standard,and eluted fractions with different solvents

3 結(jié)論

(1)AB-8大孔樹脂較適于紫山藥多酚分離純化，其分離純化工藝為：靜態(tài)吸附4 h，溶液pH為5.0，上樣質(zhì)量濃度為2.0 g/L，上樣流速為1.0 mL/min；用50%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇作為洗脫劑，在流速為1.2 mL/min時洗脫，收集洗脫液體積104 mL，此時多酚回收率為72.7%，多酚純度由13.91%提升到了59.06%，純度提高了3.25倍。

(2)比較了50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷洗脫組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，乙酸乙酯洗脫組分具有最強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其抑制率達(dá)到91.92%，經(jīng)高效液相色譜分析其主要含有蘆丁、綠原酸、表兒茶素、阿魏酸和槲皮素，試驗結(jié)果為紫山藥多酚降血糖的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，后續(xù)研究進(jìn)一步分離單組分，采用質(zhì)譜、核磁共振對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，明確其功能。