基于頂空固相微萃取-氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析固樣方法對(duì)茶葉揮發(fā)性成分的影響

李炫燁，陳思，劉毓婕，陳亮，俞曉敏，馬建強(qiáng)*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州，310008)2(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京，100081)3(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物學(xué)及代謝組學(xué)研究中心，福建 福州，350002)

香氣是衡量茶葉質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中顯示，香氣因子占綜合得分25%以上。茶葉中的揮發(fā)性成分，例如香葉醇、芳樟醇等萜類(lèi)及衍生物，苯甲醇、苯乙醇等芳香族類(lèi)化合物，以及水楊酸甲酯、己酸葉醇酯等脂肪酸衍生物等，大多具有較好的香型和較低的閾值，對(duì)茶葉香氣風(fēng)味的形成具有重要作用[1]。但是這些揮發(fā)性成分在茶葉樣品制備過(guò)程中易受影響，因此選擇合適的固樣方法對(duì)于開(kāi)展茶葉香氣研究至關(guān)重要。

目前測(cè)定茶葉品質(zhì)成分常用的固樣方法包括熱風(fēng)固樣(hot-air drying,HA)、微波固樣(microwave drying,MW)和真空冷凍固樣(vacuum freeze drying,VF) 等[2-3]。項(xiàng)麗慧等[4]比較了真空冷凍、微波和熱風(fēng)固樣對(duì)茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿等物質(zhì)含量的影響，認(rèn)為微波固樣具有較好的簡(jiǎn)便性、保真性和節(jié)能性。朱善良[5]的研究表明，微波殺青+烘干的固樣方法更適用于鮮葉生化成分的檢測(cè)。龔志華等[6]比較了6種固樣方法對(duì)茶多酚、蛋白質(zhì)、可溶性糖等成分的影響，發(fā)現(xiàn)真空冷凍固樣的效果最好。但上述研究都是針對(duì)非揮發(fā)性成分，而固樣方法對(duì)茶葉揮發(fā)性成分的影響鮮有報(bào)道[7]。

本研究以‘黃旦(HS)’、‘黃奇(HQ)’、‘福鼎大白茶(FD)’和‘尖波黃13號(hào)(JBH)’等4個(gè)茶樹(shù)品種鮮葉為供試材料，采用頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF-MS)，對(duì)真空冷凍、微波和熱風(fēng)等3種固樣方法處理的茶葉樣品以及綠茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，為開(kāi)展茶葉香氣成分批量檢測(cè)和高香茶樹(shù)品種選育等工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹(shù)鮮葉原料來(lái)源于浙江省杭州市國(guó)家茶樹(shù)種質(zhì)資源圃，2020年10月采摘‘黃旦’、‘黃奇’、‘福鼎大白茶’、和‘尖波黃13號(hào)’等4個(gè)品種的一芽二葉新稍，使用真空冷凍、微波和熱風(fēng)等3種固樣方法以及烘青綠茶(green tea,GT)工藝制成茶葉樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

FD8-3P-GOLD-SIM凍干機(jī)，金西盟(北京)儀器有限公司；7890B氣相色譜，美國(guó)安捷倫公司；Pegasus HT飛行時(shí)間質(zhì)譜，美國(guó)力可公司，G70F23 N1P微波爐，廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司；CHM-901型電熱式碧螺春烘干機(jī)，浙江春江茶葉機(jī)械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固樣方法

真空冷凍固樣：鮮葉置于液氮速凍后，使用凍干機(jī)在-70 ℃和10 mTorr條件下真空冷凍處理48 h。微波固樣：鮮葉使用微波爐在800 W條件下微波處理7 min。熱風(fēng)固樣：鮮葉使用碧螺春烘干機(jī)120 ℃初烘14 min，然后80 ℃烘至足干。綠茶樣品：鮮葉經(jīng)攤放(5 h)、殺青(220～280 ℃，1.5～2 min)、揉捻、干燥(初烘120 ℃，復(fù)烘80 ℃)等工序制成綠茶樣品。樣品名稱(chēng)及編號(hào)見(jiàn)表1，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 樣品名稱(chēng)及編號(hào)Table 1 Sample names and codes

1.3.2 揮發(fā)性成分提取與檢測(cè)

將茶葉樣品研缽成均勻粉末，稱(chēng)取1.5 g置于20 mL 頂空瓶中，參考CHEN等[8]方法采用HS-SPME提取揮發(fā)性成分，然后使用GC-TOF-MS進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)每個(gè)樣品取等量進(jìn)行混合，制成質(zhì)量控制樣品，在數(shù)據(jù)采集時(shí)每隔5個(gè)茶葉樣品加入1個(gè)質(zhì)量控制樣品，以檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性。

SPME條件：萃取針PDMS/DVB(美國(guó)Supelco公司)，孵化溫度80 ℃，孵化時(shí)間30 min，萃取時(shí)間30 min，解吸附時(shí)間5 min。GC-TOF-MS條件：色譜柱Restek Rxi-5Sil MS capillary column(30 m×0.25 mm×0.25 μm film thickness)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度275 ℃；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；程序升溫為：50 ℃保持5 min，3 ℃/min升至210 ℃保持3 min，15 ℃升至230 ℃保持5 min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲200 s，掃描范圍30～500 AMU，采集速率10譜圖/s，檢測(cè)器電壓1 570 V，EI電離能量 -70 eV，離子源溫度250 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChromaTof軟件(version 4.51.6，美國(guó)LECO公司)，經(jīng)解卷積、峰對(duì)齊后得到揮發(fā)性成分的峰面積。根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，利用標(biāo)準(zhǔn)樣品和NIST 2014(National Institute of Standards and Technology)數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行化合物鑒定，以3次生物學(xué)重復(fù)的平均峰面積代表相對(duì)含量。采用SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，使用‘悟空’在線分析平臺(tái)(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)繪制韋恩圖和熱圖，利用SPSS 18(美國(guó)IBM公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA和相關(guān)性分析

全部樣品共檢測(cè)到1 085個(gè)峰，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾(剔除質(zhì)量控制樣品RSD>30%的峰)，共得到341個(gè)化合物，導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行PCA。結(jié)果顯示，不同固樣方法的樣品可以被很好地區(qū)分開(kāi)，而在相同的固樣方法樣品組中，4個(gè)品種樣品間的差異則相對(duì)較小。由PCA得分圖可見(jiàn)，PC1(第一主成分)貢獻(xiàn)率為46.4%，PC2(第二主成分)貢獻(xiàn)率為17.7%(圖1)，其中真空冷凍樣品明顯區(qū)別于其他3組樣品，微波、熱風(fēng)和綠茶樣品僅在PC2方向上呈現(xiàn)出一定的分離趨勢(shì)，而熱風(fēng)和綠茶樣品的差異性相對(duì)較小。

圖1 四個(gè)茶樹(shù)品種不同固樣方法和綠茶樣品的揮發(fā)性成分PCA分析Fig.1 PCA analysis of total volatiles of green tea and tea leaf samples of four cultivars derived from different drying methods

皮爾遜相關(guān)性分析與PCA分析結(jié)果類(lèi)似：相同固樣方法處理的樣品，其揮發(fā)性成分的相似性系數(shù)最高，而同一品種中的真空冷凍樣品與其他3種樣品的相似性系數(shù)最低，并且綠茶樣品與熱風(fēng)樣品的相似性高于微波樣品(圖2)。上述結(jié)果表明，固樣方法會(huì)對(duì)茶葉的揮發(fā)性成分造成較大影響，真空冷凍樣品明顯區(qū)別于微波、熱風(fēng)和綠茶樣品，同時(shí)熱風(fēng)和綠茶樣品比較相似。

圖2 四個(gè)茶樹(shù)品種不同固樣方法和綠茶樣品的揮發(fā)性成分相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of total volatiles of green tea and tea leaf samples of four cultivars derived from different drying methods

2.2 揮發(fā)性成分的定性分析

根據(jù)化合物保留時(shí)間及質(zhì)譜信息，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品信息比對(duì)和NIST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共鑒定出95種揮發(fā)性成分(附表)，按照化合物類(lèi)型大致可分為七大類(lèi)(圖3-A)，其中酯類(lèi)化合物數(shù)量最多，共26種，占比27%，隨后依次為烯類(lèi)18種(19%)、醇類(lèi)13種(14%)、醛類(lèi)11種(12%)、酮類(lèi)9種(9%)、吡咯類(lèi)及其衍生物6種(6%)，以及其他化合物12種(13%)。

全部樣品中檢測(cè)到的共有揮發(fā)性成分有44種(附表)，以烯類(lèi)(27%)最多，其后為醇類(lèi)(20%)、酯類(lèi)(16%)、酮類(lèi)(14%)、醛類(lèi)(14%)、吡咯類(lèi)及其衍生物(2%)、以及其他化合物(7%)(圖3-B)。其中相對(duì)含量較多的揮發(fā)性成分包括：香葉醇、芳香醇及其氧化物、苯甲醇、苯乙醇、檸檬烯、青葉醇、β-羅勒烯、正己醇、丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯、己酸葉醇酯、β-紫羅酮、橙花叔醇、α-法呢烯等。這些化合物大多是茶葉的重要香氣成分，這與前人的研究結(jié)果基本一致[9-10]。

A-95個(gè)揮發(fā)性成分；B-44個(gè)共有揮發(fā)性成分圖3 鑒定出的95個(gè)揮發(fā)性成分和44個(gè)共有揮發(fā)性成分的類(lèi)別和數(shù)量百分比Fig.3 Types and percentages of 95 volatiles detected in all samples and 44 common volatiles in each sample

2.3 不同固樣方法茶葉的揮發(fā)性成分比較

分析4個(gè)品種不同固樣方法樣品的揮發(fā)性成分種類(lèi)差異，結(jié)果如圖4所示?！S旦’品種真空冷凍、微波、熱風(fēng)和綠茶樣品的揮發(fā)性成分分別為73、72、70和67種，‘黃奇’為71、71、73和70種、‘福鼎大白茶’ 為80、68、67和70種，‘尖波黃13號(hào)’為79、62、66和69種。從數(shù)量上看，真空冷凍樣品檢測(cè)到的揮發(fā)性成分相對(duì)較多，而熱風(fēng)、微波與綠茶樣品大致相當(dāng)。同時(shí)，真空冷凍樣品含有較多的特異揮發(fā)性成分，主要包括甲酸葉醇酯、己酸乙酯、水楊酸乙酯等酯類(lèi)化合物；其次為微波樣品，主要包括2-乙酰基吡咯、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等吡咯類(lèi)及其衍生物；而熱風(fēng)和綠茶樣品中的特異揮發(fā)性成分相對(duì)較少。

將鑒定到的95種揮發(fā)性成分進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果劃分為三個(gè)大類(lèi)(圖5)。Cluster 1主要包括乙酸葉醇酯、香葉醇、苯乙醇、水楊酸甲酯以及芳樟醇及其氧化物等31個(gè)化合物，這些成分大都在真空冷凍樣品組中含量較高。Cluster 2包含29個(gè)化合物，其中2,2,6-三甲基環(huán)己酮、β-環(huán)檸檬醛、(-)-α-古蕓烯、檸檬烯、丁酸丁酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯在熱風(fēng)樣品組中含量較高；而水楊酸-2-乙基己酯、2-甲基四氫呋喃-3-酮、三乙酸甘油酯、棕櫚酸甲酯、二甲基芐基原醇、對(duì)薄荷烷在微波樣品組中含量較高。Cluster 3主要包括茉莉酮、α-法呢烯、橙花叔醇、2-甲基丁酸己酯、己酸葉醇酯、β-丁香烯、β-羅勒烯等35個(gè)化合物，其含量大都在綠茶樣品組中較高。

圖5 鑒定到的95種揮發(fā)性成分聚類(lèi)熱圖Fig.5 The cluster heat map of 95 volatiles

以每個(gè)品種的綠茶樣品為對(duì)照，分析不同固樣處理對(duì)15個(gè)已知的綠茶重要香氣成分[11]含量的影響(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)品種的整體變化趨勢(shì)基本一致，真空冷凍樣品的香葉醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯、正己醇、β-紫羅酮、青葉醇、檸檬烯、苯乙醇等10個(gè)揮發(fā)性成分含量均高于綠茶樣品；同時(shí)，熱風(fēng)和微波樣品的香葉醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、水楊酸甲酯、青葉醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、丁酸葉醇酯、α-法呢烯、β-羅勒烯等10個(gè)揮發(fā)性成分含量均低于綠茶樣品。上述結(jié)果進(jìn)一步表明固樣方法對(duì)茶葉的揮發(fā)性成分具有顯著影響，真空冷凍固樣能較好地保留大多數(shù)重要的揮發(fā)性成分，而微波和熱風(fēng)固樣可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分種類(lèi)減少和含量大幅變化。

表2 不同固樣方法和綠茶樣品的主要揮發(fā)性成分相對(duì)含量比較Table 2 Relative content ratios of main volatiles of green tea and tea leaf samples derived from different drying methods

3 討論

香氣是茶葉風(fēng)味的重要組成部分。近年來(lái)高香茶樹(shù)品種選育成為茶樹(shù)遺傳育種研究的重要方向，但茶葉香氣的影響因素復(fù)雜，研究難度較大。準(zhǔn)確測(cè)定茶葉中的揮發(fā)性成分對(duì)于開(kāi)展茶樹(shù)種質(zhì)資源和育種材料的香氣成分鑒定和育種潛力評(píng)價(jià)等工作至關(guān)重要。樣品固定是揮發(fā)性成分檢測(cè)的重要步驟，本研究利用HS-SPME/GC-TOF-MS技術(shù)對(duì)4個(gè)代表性茶樹(shù)品種3種固樣方法及綠茶樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，以評(píng)估固樣方法對(duì)茶葉揮發(fā)性成分組成的影響。研究結(jié)果表明不同固樣方法會(huì)導(dǎo)致茶葉的揮發(fā)性成分種類(lèi)和含量呈現(xiàn)明顯差異。CHEN等[12]研究發(fā)現(xiàn)茶鮮葉中超過(guò)20%的揮發(fā)性成分在其成品茶葉中低于檢測(cè)閾值。本研究中在真空冷凍樣品中檢測(cè)到一些特異的揮發(fā)性成分，主要是酯類(lèi)化合物，例如甲酸葉醇酯、己酸乙酯等，推測(cè)可能是在微波、熱風(fēng)處理和綠茶加工時(shí)，這些化合物因受熱揮發(fā)或轉(zhuǎn)化而大量損失。同時(shí)，大部分重要的香氣成分，例如香葉醇、苯乙醇、芳樟醇及其氧化物等，其含量在微波、熱風(fēng)和綠茶樣品中比真空冷凍樣品相對(duì)較低，這與綠茶加工工藝相關(guān)研究的結(jié)果一致[13]。

本研究中的真空冷凍固樣方法是在茶鮮葉采摘后立即使用液氮處理以抑制生物酶活性,然后在真空超低溫條件下通過(guò)直接升華方式脫去水分，理論上可以較好地保留茶鮮葉中的內(nèi)源揮發(fā)性成分[14-15]。CHEN等[16]比較了茶鮮葉、液氮保存茶鮮葉、以及真空冷凍干燥茶鮮葉的揮發(fā)性成分差異，發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥處理仍會(huì)對(duì)揮發(fā)性成分組成產(chǎn)生一定影響，其原因可能是在冷凍干燥過(guò)程中，一些高揮發(fā)性化合物大量損失，以及極少量的物質(zhì)代謝形成新的化合物。但是在茶樹(shù)遺傳育種研究中往往需要進(jìn)行大批量的樣品分析，如果直接對(duì)茶鮮葉或液氮保存茶鮮葉進(jìn)行揮發(fā)性成分測(cè)定，因樣品中仍存在大量水分，在樣品保存和前處理方面較為復(fù)雜，影響檢測(cè)效率。從本研究結(jié)果來(lái)看，真空冷凍固樣保留了較多的內(nèi)源揮發(fā)性成分，能相對(duì)真實(shí)地反映茶鮮葉中的揮發(fā)性成分組成，因此可作為大批量茶鮮葉內(nèi)源揮發(fā)性成分研究時(shí)較優(yōu)的固樣方法。

熱物理化學(xué)作用是影響茶葉香氣成分的重要因素[17-18]。茶葉在高溫烘焙過(guò)程中氨基和羰基化合物能通過(guò)美拉德反應(yīng)能形成吡咯類(lèi)、吡嗪類(lèi)等雜環(huán)化合物[19]。由于茶鮮葉中水分分布不均，在微波固樣時(shí)局部過(guò)熱，這可能是本研究中微波樣品含有較多特異吡咯類(lèi)及其衍生物的原因。此外，茶鮮葉采后的酶促反應(yīng)是另一個(gè)影響茶葉香氣成分的重要因素，通過(guò)萜類(lèi)合成代謝和β-亞麻酸代謝能促進(jìn)萜類(lèi)和脂肪酸衍生物香氣成分的增加[17]。本研究中綠茶樣品的攤放工序可能是導(dǎo)致其β-羅勒烯、β-丁香烯、β-蓽澄茄烯、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯等揮發(fā)性成分含量高于其他樣品的原因，這與WANG等[20]研究結(jié)果基本一致。從整體來(lái)看，熱風(fēng)固樣和綠茶樣品的揮發(fā)性成分組分是較為相似的。在育種工作中，通常需要耗費(fèi)大量精力制作茶樣才能進(jìn)行香氣評(píng)價(jià)，并且一些稀有種質(zhì)資源或單株材料，由于鮮葉量有限，制作茶樣較難。因此針對(duì)上述情況，可以考慮使用熱風(fēng)固樣進(jìn)行鮮葉快速處理和香氣成分鑒定，作為篩選高香綠茶育種材料的初步依據(jù)。

對(duì)比本研究中的4個(gè)品種樣品，發(fā)現(xiàn)香葉醇、青葉醇、乙酸葉醇酯、苯甲醇、芳樟醇及其氧化物等是共有的主要揮發(fā)性成分，但其含量在不同品種中差異較大，這與前人的研究大體一致[21-22]。2個(gè)烏龍茶品種‘黃旦’和‘黃奇’相同固樣方法處理的樣品，其揮發(fā)性成分組分較為相似，且萜類(lèi)化合物含量都較高。其原因可能與它們的親緣關(guān)系較近有關(guān)，‘黃奇’ 是由‘黃旦’與‘白奇蘭’的自然雜交后代選育而來(lái)，而揮發(fā)性萜類(lèi)化合物是烏龍茶品種的核心香氣組分[23]。WANG等[24]通過(guò)對(duì)‘黃旦’和2個(gè)綠茶品種的比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)萜類(lèi)合成酶家族基因的擴(kuò)增和特異性高表達(dá)是‘黃旦’高香氣特征的分子基礎(chǔ)。

綜上所述，真空冷凍、微波和熱風(fēng)固樣方法會(huì)導(dǎo)致茶葉揮發(fā)性成分發(fā)生不同變化，本研究認(rèn)為在針對(duì)大批量茶鮮葉的揮發(fā)性成分分析時(shí)真空冷凍可能是普遍適宜的固樣方法，而在育種研究中，熱風(fēng)固樣可作為育種材料揮發(fā)性成分快速鑒定和香氣潛力評(píng)估的輔助方法。值得注意的是，本研究中的熱風(fēng)固樣方法是參考常規(guī)的生化茶葉樣品制作方法，未來(lái)可以有針對(duì)性地開(kāi)展系統(tǒng)深入研究進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。