B淋巴細(xì)胞調(diào)控炎癥細(xì)胞聚集促進(jìn)血管緊張素Ⅱ/苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚

王西強(qiáng) ,劉成峰 ,劉 平 ,馬愛群 ,劉小祥 ,石 爽

(1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西西安 710068;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西西安 710061)

心力衰竭(心衰)是心血管疾病的終末階段,心室重構(gòu)在心衰發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1]。越來越多的證據(jù)表明,炎癥反應(yīng)在心室重構(gòu)中具有關(guān)鍵作用,但不同種類的免疫細(xì)胞在心衰發(fā)生發(fā)展過程中的作用目前并不十分清楚[2]。B淋巴細(xì)胞是小鼠心肌組織中最為豐富的免疫細(xì)胞之一,B淋巴細(xì)胞向T細(xì)胞提供抗原并產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子,最終調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能[3]。既往研究表明,急性心肌損傷和慢性心肌損傷中,通過調(diào)節(jié)心肌B淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能對(duì)心臟具有保護(hù)作用[4-7]。ZOUGGARI等[4]的研究顯示,B淋巴細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子ccl7 從骨髓中招募Ly6C+單核細(xì)胞,從而促進(jìn)心肌梗死后的左心室重構(gòu)。HORCKMANS等[6]的研究顯示,B淋巴細(xì)胞能夠顯著減輕心肌梗死后及心包脂肪組織中免疫細(xì)胞的增殖。目前,B 淋巴細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ/腎上腺素(angiotensinⅡ/phenylephrine,AngⅡ/PE)誘導(dǎo)的非缺血性心肌病中的作用還不清楚。本研究用血管緊張素Ⅱ/苯腎上腺素,AngⅡ/PE 建立心室肥厚動(dòng)物模型,以探索B 淋巴細(xì)胞在AngⅡ/PE 誘導(dǎo)的心室肥厚中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 AngⅡ/PE心室肥厚模型的建立

選用10～14周齡雌性C57BL/B6J野生型小鼠(WT)及B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J(μMT)B淋巴細(xì)胞敲除小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠均在無病原體的環(huán)境中,按照指南自由給予食物及水進(jìn)行飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)根據(jù)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物協(xié)議進(jìn)行。

將AngⅡ/PE(血管緊張素Ⅱ,1.5μg/g·d,Bachem;苯腎上腺素,50μg/g·d,Millipore Sigma)及生理鹽水(SAL,對(duì)照組)裝入微量泵中,隨后將滲透性微量泵通過手術(shù)植入小鼠皮下,并輸注AngⅡ/PE或SAL(對(duì)照組)于小鼠體內(nèi)(2周或4周)。小鼠滲透性微量泵植入手術(shù)根據(jù)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物研究委員會(huì)發(fā)布的指導(dǎo)方案進(jìn)行。

1.2 血壓測(cè)量

采用尾袖CODA 無創(chuàng)血液監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Kent Scientific Corporation,Torrington,CT),通過容積描記的方法測(cè)量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的基線、給藥后2周及4周小鼠尾部血壓,確定收縮壓、舒張壓和脈搏率,連續(xù)測(cè)量3 d,求平均值。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

提前準(zhǔn)備好小鼠CO2處死箱,打開CO2控制器,控制CO2流量約2 L/min,取出各組小鼠,將小鼠放入充滿CO2的小鼠CO2處死箱中,處死小鼠。使用10 m L平衡鹽溶液(HBSS)溶液從右心室底部沖洗心臟。將心臟放入盛有Hank’s HBSS的100 mm培養(yǎng)皿中擠出心臟中的殘留血液。去除心臟表面液體,稱量左心室,使用刀片切碎左心室,均為2 min。之后,于含有3 m L HBSS的15 m L 離心管中,并換洗1次。向盛有標(biāo)本的各離心管中分別加入膠原酶(450 U/m L)、透明質(zhì)酸酶(60 U/m L)、DNAseⅠ(60 U/m L)。將所有標(biāo)本置于37℃的震蕩器中恒溫、勻速消化45 min后加入6 m L HBB 終止消化。40μm 濾膜過濾細(xì)胞,轉(zhuǎn)入新的15 m L 離心管中,4℃,400 r/min,離心7 min。去上清,每個(gè)樣品加入1 m L ACK lysis buffer,混勻后于冰上靜置12 min,加入5 m L FACS buffer,4℃、400 r/min再次離心7 min。去上清,加入45μL FACS buffer,取體積的1/3轉(zhuǎn)入1.5 m L離心管中,加入目標(biāo)抗體混合物,上機(jī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門策略見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門策略Fig.1 Gating strategy for the flow cytometric analysis

1.4 小鼠心臟超聲檢查

超聲檢查使用Vevo 770超聲系統(tǒng)(VisualSonics Inc,Toronto,Ontario,Canada)。腹腔注射(0.005 mL/g)20 g/L Tribromoethanol麻醉小鼠,根據(jù)超聲檢查時(shí)間,可每隔30 min予初始劑量的1/5作為維持劑量。使用化學(xué)脫毛劑從前胸脫掉毛發(fā),將小鼠以左側(cè)臥位放置在保暖墊上,以維持體溫(37℃),用直腸溫度計(jì)監(jiān)測(cè)體溫。胸口部位涂抹適當(dāng)超聲用凝膠,注意保持適當(dāng)接觸的同時(shí),避免過度按壓胸部。通過手持操作超聲換能器獲得二維多普勒?qǐng)D像。超聲檢測(cè)左心室質(zhì)量(LVM)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)。

1.5 形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察

AngⅡ/PE給藥2周或4周,處死小鼠后,取心臟稱重,確定心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度的比值(HW/TB)。心臟經(jīng)過處理,石蠟包埋后,使用Masson三色染色法進(jìn)行染色[8]。使用ImageJ軟件對(duì)Masson’s三色染色的連續(xù)切片進(jìn)行纖維化程度的量化檢測(cè),以左心室纖維化陽性的平均百分比表示其纖維化程度。為使用麥胚凝集素(WGA)染色心肌細(xì)胞細(xì)胞膜,用Zeiss共聚焦顯微鏡觀察熒光,用Zeiss Axiovision軟件分析和測(cè)量數(shù)字圖像,以明確心肌細(xì)胞橫截面積。

1.6 CD68+巨噬細(xì)胞和Ly6G+中性粒細(xì)胞染色及計(jì)數(shù)分析

處死小鼠,迅速取出心臟,放入盛有心臟停搏液的培養(yǎng)皿中,充分沖洗后稱重,于40 g/L多聚甲醛溶液(PFA)中固定24 h,再放入300 g/L 蔗糖溶液中24 h。用OCT 包埋后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。制?0μm 厚切片,于濕盒中,30 g/L 牛血清白蛋白(BSA)孵育過夜后,加入30 g/L BSA 配制的CD68(1∶400)一 抗100μL,室溫孵育1 h。PBS 清洗3次,5 min/次。加入30 g/L BSA 配制的熒光二抗(Alexa Fluor 555,1∶1 000),避光室溫孵育30 min 后,PBS清洗后加入含DAPI的抗熒光淬滅劑100μL,蓋上蓋玻片,避光保存30 min后,封片劑封片。使用激光共聚焦掃描完整的心臟切片,并使用Image J軟件計(jì)數(shù)CD68+的巨噬細(xì)胞數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(S.E.M)表示,兩組間比較采用Student’sT檢驗(yàn),兩組以上比較采用One-way Anova檢驗(yàn)。生存曲線采用Kaplan-Meier法,log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad prism 8.0(Graphpad software,Inc.,Cary,NC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 B淋巴細(xì)胞在AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心室肥厚模型心肌組織中大量聚集

實(shí)驗(yàn)組(WT_AngⅡ/PE)小鼠的CD45+白細(xì)胞、CD64-Ly6C+單核細(xì)胞、CD64+Ly6C-巨噬細(xì)胞和Ly6g+中性粒細(xì)胞在2周時(shí)顯著增加(P<0.05),4周時(shí)各免疫細(xì)胞數(shù)量較2周時(shí)有所下降(圖2A～圖2D)。2周及4周模型組B淋巴細(xì)胞、B1淋巴細(xì)胞和B2淋巴細(xì)胞(為CD45+CD19+細(xì)胞、CD45+CD19+CD11b+細(xì)胞、CD45+CD19+CD11b-細(xì)胞)在心肌組織中大量聚集(P<0.05),與對(duì)照組(WT_SAL)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞相比,WT_AngⅡ/PE 小鼠心臟CD45+CD19+CD11b-(B2)細(xì)胞數(shù)量有增加趨勢(shì),但在第4周時(shí)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2E～圖2G)。結(jié)果顯示,AngⅡ/PE 作用心肌細(xì)胞后導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞在心肌組織中聚集,提示B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在心臟損傷中可能發(fā)揮著重要作用。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AngⅡ/PE作用2周及4周時(shí)小鼠心臟免疫細(xì)胞浸潤情況Fig.2 B cells deficiency alleviated cardiac hypertrophy at 2 and 4 weeks in AngⅡ/PE treatment mice

2.2 B淋巴細(xì)胞敲除可減輕AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心肌肥厚

技術(shù)路線圖如圖3A 所示。AngⅡ/PE作用2周及4 周時(shí),各組小鼠(WT_SAL、μMT_SAL、WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE)血壓檢測(cè)結(jié)果表明,B淋巴細(xì)胞敲除時(shí)不影響AngⅡ/PE 所致的血壓升高(圖3B)。

與WT_SAL及μMT_SAL組相比,4周時(shí)WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE 組的HW/TB 和左心室質(zhì)量(LVM)顯著增加(P<0.01,P<0.000 1);而WT_AngⅡ/PE 小鼠心臟HW/TB和LVM 同μMT_AngⅡ/PE相比顯著增大(P<0.05,圖3C、圖3D)。與上述結(jié)果一致,WGA 染色結(jié)果顯示,與WT_SAL和μMT-SAL組小鼠相比,WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE小鼠心臟的心肌細(xì)胞橫截面積顯著增加(P<0.000 1),而μMT_AngⅡ/PE 組心肌細(xì)胞橫截面積明顯小于WT_AngⅡ/PE 組(P<0.000 1,圖3E、圖3F)。提示B細(xì)胞敲除可減輕AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心肌肥厚。

圖3 B淋巴細(xì)胞缺乏可改善AngⅡ/PE作用4周的小鼠心肌肥厚Fig.3 B lymphocyte deficiency alleviated myocardial hypertrophy after 4 weeks of AngⅡ/PE treatment in mice

心動(dòng)超聲結(jié)果顯示,給予AngⅡ/PE 干預(yù)4 周時(shí),WT_SAL、μMT_SAL、WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE 四組間的LVEF、LVEDV、LVESV 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4A～圖4C)。心臟Masson 三色染色結(jié)果顯示,AngⅡ/PE可誘導(dǎo)WT 和μMT 小鼠心臟纖維化;WT_AngⅡ/PE小鼠與μMT_AngⅡ/PE 小鼠比較,4周時(shí)心肌細(xì)胞Masson's膠原染色百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4D、圖4E)。

圖4 B淋巴細(xì)胞缺乏改善AngⅡ/PE作用4周時(shí)小鼠心臟的結(jié)構(gòu)及功能Fig.4 B lymphocyte deficiency improved cardiac structure and function in mice treated with AngⅡ/PE for 4 weeks

2.3 B淋巴細(xì)胞敲除可減輕2周時(shí)AngⅡ/PE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

在AngⅡ/PE作用2周時(shí),對(duì)各組心肌細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,結(jié)果顯示,與WT_SAL AngⅡ/PE心肌組織中CD45+細(xì)胞數(shù)量顯著增加和μMT_SAL 心臟相比,WT_AngⅡ/PE和μMT_(P<0.000 1);而與WT_AngⅡ/PE 小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞相比,μMT_AngⅡ/PE 心臟的CD45+細(xì)胞數(shù)量較WT_AngⅡ/PE 小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)顯著減少(P<0.04,圖5A)。

考慮到B 淋巴細(xì)胞缺乏使μMT_AngⅡ/PE 心肌損傷后白細(xì)胞的浸潤減少,進(jìn)一步確定特定的免疫細(xì)胞類型,結(jié)果表明,同WT_SAL 和μMT_SAL 組相比,WT_AngⅡ/PE和μMT_AngⅡ/PE 小鼠心肌組織中CD45+Ly6C+CD64-單核細(xì)胞顯著聚集,但μMT_AngⅡ/PE 組心肌組織CD45+Ly6C+CD64-單核細(xì)胞較WT_AngⅡ/PE 組有減少的趨勢(shì)(P=0.051 3,圖5B)。與上述結(jié)果類似的是,在AngⅡ/PE作用2周時(shí),可誘導(dǎo)CD45+Ly6C-CD64+巨噬細(xì)胞在WT_AngⅡ/PE 和μMT_AngⅡ/PE 組顯著增加,但μMT_AngⅡ/PE 組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)CD45+Ly6C-CD64+巨噬細(xì)胞較WT_AngⅡ/PE 組顯著減少 (P<0.05,圖5C)。

在AngⅡ/PE作用2周時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色,進(jìn)一步證實(shí)WT 和μMT 心肌組織中巨噬細(xì)胞的變化,在AngⅡ/PE處理的WT 小鼠心肌組織中CD64+巨噬細(xì)胞聚集,而在μMT_AngⅡ/PE 組心肌組織的CD64+巨噬細(xì)胞較WT_AngⅡ/PE 組顯著減少(圖5D、圖5E)。這與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色結(jié)果顯示,與WT_SAL 心臟相比,WT_AngⅡ/PE 和μMT_AngⅡ/PE 小鼠心臟Ly6G+中性粒細(xì)胞顯著增加(P<0.05和P<0.05,圖5F～圖5 H);而與WT_AngⅡ/PE相比,流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光染色μMT_AngⅡ/PE 心臟中Ly6G+細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,圖5F、圖5H)。這提示B淋巴細(xì)胞缺乏可選擇性地減少μMT_AngⅡ/PE 中巨噬細(xì)胞的數(shù)量,而不影響Ly6G+中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AngⅡ/PE作用2周時(shí)心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞變化Fig.5 Changes of inflammatory cells in myocardial tissue at 2 weeks of AngⅡ/PE treatment detected by flow cytometry

3 討 論

既往研究顯示,AngⅡ刺激心臟和血管中促炎細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子的合成,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的招募和激活[9]。然而,B淋巴細(xì)胞在AngⅡ/PE 誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,B淋巴細(xì)胞缺乏顯著降低AngⅡ/PE 誘導(dǎo)的心臟肥厚。心肌肥厚的改善是與CD45+白細(xì)胞、Ly6C+CD64-單核細(xì)胞和CD64+Ly6C-巨噬細(xì)胞在心肌細(xì)胞內(nèi)的減少有關(guān)。這提示B淋巴細(xì)胞缺乏能夠降低AngⅡ/PE 誘導(dǎo)的心臟炎癥,抑制心肌肥厚,并且這種作用獨(dú)立于AngⅡ/PE誘導(dǎo)的血壓升高。

B淋巴細(xì)胞敲除小鼠在AngⅡ/PE 作用下同樣出現(xiàn)了高血壓,但與WT 處理的小鼠相比,其心臟肥厚減輕,說明在AngⅡ/PE 誘導(dǎo)的心肌損傷中,B 淋巴細(xì)胞在心肌損傷中發(fā)揮重要作用,高血壓作為唯一的血流動(dòng)力學(xué)損傷,可能不足以完全促進(jìn)心肌損傷,進(jìn)一步探索和干預(yù)炎癥反應(yīng)可能是治療心室肥厚的另一重要靶點(diǎn)。

研究顯示,在正常的成年小鼠心臟中存在著不同種類的免疫細(xì)胞群,CD19+B 淋巴細(xì)胞是成年小鼠心臟[3]中最多的免疫細(xì)胞之一。近期,ADAMO等[10]研究發(fā)現(xiàn),野生型小鼠心臟中有大量的CD19+CD11b-CD23-CD21-IgD+Ig Mlo淋巴細(xì)胞,以及兩種含量較少的CD19+CD11b+B1a和B1b細(xì)胞。心臟B淋巴細(xì)胞是循環(huán)B 淋巴細(xì)胞的一個(gè)重要亞群,與心臟的微血管內(nèi)皮密切接觸,并在通過心臟時(shí)短暫停留。絕大多數(shù)(>95%)心臟B細(xì)胞仍在血管內(nèi),而心臟細(xì)胞內(nèi)B淋巴細(xì)胞很少(<5%)[4]。并且,心臟B淋巴細(xì)胞的表型在發(fā)育過程中發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,新生兒心臟B淋巴細(xì)胞以CD11b+和CD11b-CD21-CD23-為主,成人B 淋巴細(xì)胞以CD11b-CD21+CD23+為主[10-12]。有研究顯示,B 淋巴細(xì)胞在心臟損傷后慢性左室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,但具體的B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性左心室重構(gòu)的機(jī)制尚不清楚。有研究人員認(rèn)為,免疫球蛋白參與了缺血再灌注后心肌的急性炎癥反應(yīng),在缺血后心衰模型中,B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Ig M 和IgG 抗體的表達(dá)在缺血后狀態(tài)下較對(duì)照組增加了3倍。采用特異性靶向Ig M 的N2或21G6 F(ab)2肽與心臟缺血抗原結(jié)合可預(yù)防及降低心臟I/R 后心臟損傷[13]。并且,ZOUGGARI等[4]發(fā)現(xiàn)CD19+B 淋巴細(xì)胞通過CCL7依賴途徑[6]從骨髓中招募Ly6C+單核細(xì)胞進(jìn)入心肌梗死區(qū)域,并促進(jìn)了心肌梗死后的心室重構(gòu)。

本研究的結(jié)果證實(shí)并擴(kuò)展了之前描述的心肌B淋巴細(xì)胞的研究,提示B 淋巴細(xì)胞在AngⅡ/PE 作用后的心肌肥厚調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,B淋巴細(xì)胞在AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心臟損傷中發(fā)揮著重要作用,B 淋巴細(xì)胞缺乏可以減輕心臟肥厚,改善心臟功能?？傊?本研究結(jié)果表明,B 淋巴細(xì)胞缺乏抑制AngⅡ/PE誘導(dǎo)的心臟炎癥反應(yīng),改善心肌肥厚,而這種作用不依賴于AngⅡ/PE誘導(dǎo)的高血壓。