鹽酸氯卡色林飽和溶解度、油水分配系數(shù)的測定及大鼠在體腸吸收

王重陽，蔣成君，王夢文，陶福林，朱文濤，汪電雷

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230011)

目前我國肥胖人口達(dá)3.25億，導(dǎo)致心腦血管疾病及腫瘤的發(fā)病率大大提高[1-2]。鹽酸氯卡色林是主要作用于腦中的5-HT2C受體，通過激動神經(jīng)元使機(jī)體產(chǎn)生飽腹感而促使體質(zhì)量減輕[3]的新型減肥藥物，適用于體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≥27 kg/m2，并患有高血壓、2型糖尿病或者高血脂的超重人群。5-HT2B受體激動劑通常會導(dǎo)致瓣膜性心臟病[4]，而鹽酸氯卡色林作用于5-HT2C受體效力是5-HT2B受體的60倍，這使心臟受損的風(fēng)險遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于先前藥物[5]，在臨床Ⅲ期試驗中發(fā)現(xiàn)鹽酸氯卡色林在促使體質(zhì)量減輕的同時不會發(fā)生心臟性疾病[6]，大大提升了藥物的安全性。

本研究通過測定鹽酸氯卡色林飽和溶解度及油水分配系數(shù)及其在體腸吸收考察，對鹽酸氯卡色林的吸收部位和吸收動力學(xué)進(jìn)行探討，為劑型設(shè)計提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥 LC-16型高效液相色譜儀(島津儀器有限公司)；Milli-Q GradientA10超純水機(jī)(Millipore Inc.USA)；JL-180超聲儀(南京科捷分析儀器有限公司)；AB135-S型分析天平(德國Mettler Toledo公司)；精密pH計(梅特勒-托利多公司，瑞士)；HJ-6B數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器(金壇區(qū)西城新瑞儀器廠)。鹽酸氯卡色林(含量99.8%，批號2018511)、鹽酸氯卡色林對照品(批號2016311)購于合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司；烏拉坦(廣州威佳科技有限公司，純度98%，批號1700063)；色譜級乙腈(瑞典Oceanpak公司)；三氟乙酸(江蘇強(qiáng)盛化工有限公司)；水為純化水；其余均為分析純。

1.2 動物 健康SD大鼠，雌雄各半，購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(皖)2019-001，體質(zhì)量(200±35)g。飼養(yǎng)條件：溫度20℃～25℃，相對濕度50%～60%，12 h通風(fēng)換氣一次。在進(jìn)行實驗前12 h，可飲水需禁食。

2 方法與結(jié)果

2.1 飽和溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定

2.1.1 溶液的制備 對照品貯備液的配制：精密稱取鹽酸氯卡色林對照品適量，以超純水溶解得濃度為100 μg/mL的對照品貯備液，備用。

對照品溶液的配制：精密移取對照品貯備液適量，加流動相配制成濃度為0.5、1、3、6、12、24、30 μg/mL系列對照品溶液，備用。

供試品溶液的配制：精密稱定鹽酸氯卡色林適量，加流動相配制成濃度為0.5、1、3、6、12、24、30 μg/mL系列供試品溶液，備用。

2.1.2 鹽酸氯卡色林含量測定方法的建立

2.1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×20 mm,5 μm)；流動相：水-乙腈-三氟乙酸(70∶30∶0.1 V/V/V)，檢測波長：222 nm，柱溫：35℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2.2 專屬性 精密吸取空白溶液、對照品和供試品溶液20 μL，按“2.1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)行專屬性考察，結(jié)果見圖1。

A.空白溶劑；B.鹽酸氯卡色林對照品；C.鹽酸氯卡色林供試品溶液。

2.1.2.4 準(zhǔn)確度、精密度及穩(wěn)定性測定 取濃度為1、6、24 μg/mL的供試液進(jìn)樣分析。于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次考察日內(nèi)精密度，于1 d內(nèi)進(jìn)樣1次，連續(xù)5 d進(jìn)樣測定日間精密度[7]并考察相應(yīng)的準(zhǔn)確度。結(jié)果表明儀器的精密度良好，見表1。

表1 鹽酸氯卡色林的精密度及準(zhǔn)確度

取濃度為6 μg/mL的供試液，置于(37±1)℃水浴中，在0、2、4、8、12、24 h時取樣，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示峰面積RSD<2%，表明鹽酸氯卡色林供試液在24 h內(nèi)可維持穩(wěn)定，見表2。

表2 鹽酸氯卡色林含量測定溶液穩(wěn)定性實驗(n=5)

2.1.3 鹽酸氯卡色林飽和溶解度的測定 參照文獻(xiàn)[8～9]方法進(jìn)行鹽酸氯卡色林飽和溶解度實驗。將離心后的上清液0.45 μm微孔濾膜濾過，用乙腈稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示鹽酸氯卡色林飽和溶解度均>400 mg/mL，見表3。

表3 不同pH下測得鹽酸氯卡色林的溶解度及油水分配系數(shù)

2.1.4 鹽酸氯卡色林表觀油水分配系數(shù)的測定 參照文獻(xiàn)[10～13]方法進(jìn)行鹽酸氯卡色林表觀油水分配系數(shù)實驗。取上層油相溶液稀釋后進(jìn)樣分析，根據(jù)Cw=(C-Co)×稀釋倍數(shù)，計算水相中鹽酸氯卡色林的濃度，并計算油水分配系數(shù)P=Co/Cw。其中C為加入藥物的初始濃度，Co為油相中藥物濃度，Cw為水相中藥物濃度，P為藥物的油水分配系數(shù)。

結(jié)果顯示鹽酸氯卡色林在正辛醇-水體系及正辛醇-PBS體系中的表觀分配系數(shù)lgP>2，見表3。

2.2 大鼠在體腸吸收考察

2.2.1 腸灌流溶液的配制 K-R液的配制：稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaH2PO40.32 g、NaHCO31.37 g、MgCl20.02 g、葡萄糖 1.40 g、CaCl20.37 g以蒸餾水定容至1 L。

空白腸灌流液的配制：在大鼠小腸段兩端插管，37℃生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈，用不含藥物的K-R液快速充滿腸段后，以0.28 mL/min的速度持續(xù)泵入各腸段，在出口處收集接收液，作為空白腸灌流液。

鹽酸氯卡色林腸灌流液的配制：精密稱取鹽酸氯卡色林對照品適量，以空白腸灌流液稀釋至12 μg/mL，備用。

2.2.2 大鼠小腸生物樣品中鹽酸氯卡色林含量測定方法的建立

2.2.2.1 專屬性 分別取空白腸灌流液、鹽酸氯卡色林腸灌流液和腸吸收樣品溶液，按“2.1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明空白腸灌流液在鹽酸氯卡色林保留時間處沒有吸收峰，其內(nèi)源性物質(zhì)對鹽酸氯卡色林的測定沒有干擾，該方法專屬性良好。見圖2。

A.空白腸液灌流液；B.空白腸灌流液+對照品(12 μg/mL)；C.腸吸收樣品溶液。

2.2.2.3 鹽酸氯卡色林在空白腸液中的穩(wěn)定性考察 精密稱取鹽酸氯卡色林適量，加空白腸灌流液稀釋至24 μg/mL的供試液，置于(37±1)℃水浴中。分別在0、1、2、4、8、12、24 h時取樣分析，記錄峰面積計算RSD值。結(jié)果顯示RSD<2%，表明鹽酸氯卡色林供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(n=5)。

2.2.3 單向灌流實驗 參考文獻(xiàn)[14～17]進(jìn)行大鼠單向灌流實驗。實驗持續(xù)105 min，待實驗結(jié)束后，將所灌流的腸段剪下，測量其長度(L)及周長，由3次周長求得平均內(nèi)徑(r)。將所取灌流樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣分析，測定鹽酸氯卡色林濃度。

本實驗采用重量法校正灌流液的體積變化，計算鹽酸氯卡色林吸收速率常數(shù)(Ka)和腸段表觀吸收系數(shù)(Papp)，公式如下：

①

②

式中：Vin、Vout分別為灌流液、接收液的體積；Cin、Cout分別為灌流液、接收液中鹽酸氯卡色林的質(zhì)量濃度；V為腸段體積(通過L及r求出)；Q為灌流速度(mL/min)。

2.2.4 不同腸段吸收系數(shù)的比較 取SD大鼠6只，打開腹腔分離出十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸，按“2.2.3”方法用鹽酸氯卡色林(6 μg/mL)供試液對4個腸段依次恒速灌流。計算并比較不同腸段中[18-19]鹽酸氯卡色林的Ka和Papp。結(jié)果顯示，鹽酸氯卡色林在全腸段均有吸收，與鹽酸氯卡色林在十二指腸的Ka相比，空腸、回腸和結(jié)腸均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與鹽酸氯卡色林在十二指腸的Papp相比，回腸和結(jié)腸均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 鹽酸氯卡色林在不同腸段吸收系數(shù)比較

2.2.5 不同濃度吸收系數(shù)的比較[20-21]取SD大鼠6只，以空腸為灌流腸段，配制鹽酸氯卡色林(1、6、24 μg/mL)供試液，按“2.2.3”方法操作，分別以不同濃度的鹽酸氯卡色林供試液恒速灌流空腸，計算并比較不同濃度的鹽酸氯卡色林在大鼠空腸的Ka和Papp。結(jié)果顯示，不同濃度的鹽酸氯卡色林在大鼠空腸吸收的Ka和Papp差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 不同濃度鹽酸氯卡色林在大鼠空腸吸收系數(shù)的比較

3 討論

本研究采用高效液相色譜法測定鹽酸氯卡色林的飽和溶解度及油水分配系數(shù)，對于預(yù)測其在體內(nèi)的吸收及滲透性具有重要意義。由于鹽酸氯卡色林具有特殊的分子結(jié)構(gòu)(酸堿兩性)，在不同的環(huán)境下顯現(xiàn)不同的酸堿性，因此在不同的pH環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)其溶解度并未發(fā)生較大的改變，并且在不同的pH環(huán)境下均具有很好的溶解性(超過400 mg/mL)，表明鹽酸氯卡色林是高溶解性藥物。同時，鹽酸氯卡色林在正辛醇-水體系及正辛醇-PBS體系中的表觀油水分配系數(shù)lgP均>2，說明了鹽酸氯卡色林易透膜吸收，并且口服易吸收[22-25]。

考慮到大鼠腸道灌流實驗在腸道吸收藥物的同時也會吸收水分，致使灌流液體積發(fā)生改變，因此本研究采用重量法對灌流體積進(jìn)行校正。結(jié)果表明鹽酸氯卡色林在全腸段均有較好的吸收，與其lgP>2口服易吸收預(yù)測結(jié)果相一致。且鹽酸氯卡色林在腸道吸收不受濃度影響，其吸收機(jī)制可能屬于被動擴(kuò)散[26-27]。本研究結(jié)果為鹽酸氯卡色林進(jìn)一步緩控釋制劑開發(fā)提供了一定參考依據(jù)。