TPD52在HER-2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)及其臨床病理意義

左志博 鄔萬(wàn)新 李 鑫 張 琳 楊宏杰 汪靜宇 郭志琴 胡少青

乳腺癌中人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)過(guò)度表達(dá)或HER-2基因擴(kuò)增，被稱為HER-2陽(yáng)性乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%。它是一種高度侵襲性腫瘤，以HER-2介導(dǎo)的致癌途徑激活為特征，這些致癌途徑驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成、高侵襲和代謝重編程，由于腫瘤生長(zhǎng)速度快，對(duì)細(xì)胞毒性化療缺乏反應(yīng)，因此預(yù)后較差[1]。在過(guò)去20年中，針對(duì)HER-2的靶向藥物的引入顯著改善了患者的預(yù)后，但并非所有患者都能治愈，抗HER-2治療出現(xiàn)了耐藥性是大多數(shù)治療失敗的原因。越來(lái)越多的研究顯示，在多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了腫瘤蛋白D52(tumor proteins d52，TPD52)的表達(dá)過(guò)度，它影響著細(xì)胞的增殖、凋亡及腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究主要探討TPD52在HER-2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)狀況并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，探討TPD52與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

對(duì)象與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：石蠟組織選擇2020年1～12月嘉興市第一醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本的120例患者，分為正常乳腺組織組30例、HER-2陰性乳腺癌組30例及HER-2陽(yáng)性乳腺癌組60例，上述標(biāo)本由兩名病理醫(yī)生在石蠟切片及免疫組化染色后獨(dú)立評(píng)估。所有納入對(duì)象術(shù)前未接受過(guò)放化療等新輔助治療，未合并其他惡性腫瘤，有完整的臨床病理資料。本研究通過(guò)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批。

2.主要設(shè)備及試劑：選用LECIA輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)、Roche Benchmark XT全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀及DAKO全自動(dòng)染色封片機(jī)等。小鼠抗人單克隆抗體TPD52抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Cyclin D1抗體和EDTA抗原修復(fù)液等購(gòu)自北京中杉金橋公司。

3.方法：所有組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為4μm。免疫組化使用Roche Benchmark XT全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀進(jìn)行染色，隨后進(jìn)行顯微鏡鏡下閱片。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，使用已知TPD52及Cyclin D1表達(dá)陽(yáng)性的前列腺組織為陽(yáng)性對(duì)照。

4.結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分比和染色強(qiáng)度計(jì)算TPD52免疫組化染色評(píng)分[2]。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽(yáng)性百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：<5%為0分；5%～25%(不含)為1分；25%～50%(不含)為2分；≥50%為3分。由同兩名病理醫(yī)生采用盲法單獨(dú)閱片評(píng)分。將上述兩個(gè)分值的乘積作為最終分值，定義TPD52表達(dá)水平如下：-(0～1分)、+(2～3分)、++(4～6分)及+++(>6分)。將-或+定義為無(wú)表達(dá)或低表達(dá)，++或+++定義為高表達(dá)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同乳腺組織中TPD52的表達(dá)水平：免疫組織化學(xué)法顯示TPD52蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。TPD52在乳腺癌中的高表達(dá)率為44.4%(40/90)，高于正常乳腺組織(0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.000，P<0.001)。TPD52在HER-2陽(yáng)性乳腺癌中的高表達(dá)率為53.3%，高于HER-2陰性乳腺癌的26.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.760，P=0.024，表1)。

圖1 TPD52在乳腺組織中的表達(dá)(Envison, ×400)A.正常乳腺組織；B.HER-2陽(yáng)性乳腺癌低表達(dá);C.HER-2陽(yáng)性乳腺癌高表達(dá)

表1 TPD52在不同乳腺組織中的表達(dá)率[n(%)]

2.TPD52與HER-2陽(yáng)性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系：TPD52的表達(dá)與HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者的年齡、腫塊直徑、組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ki-67表達(dá)及Cyclin D1表達(dá)有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的TPD52高表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；TNM分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的TPD52高表達(dá)率逐步上升，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；高ki-67表達(dá)者的TPD52高表達(dá)率高于低ki-67表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)；高Cyclin D1表達(dá)者的TPD52高表達(dá)率高于低Cyclin D1表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019，表2)。

表2 HER-2陽(yáng)性乳腺癌中的TPD52表達(dá)與臨床病理特征[n(%)]

討 論

乳腺癌是全球第2大癌癥，發(fā)生率達(dá)到11.9%，它也是女性中發(fā)生率最高的癌癥，占所有女性新發(fā)癌癥的25.2%[3]。盡管醫(yī)學(xué)研究取得了重要進(jìn)展，乳腺癌患者的病死率已經(jīng)得到了顯著的改善，但是在伴有轉(zhuǎn)移的情況下，其中位生存率依然很低。根據(jù)乳腺癌的臨床病理和分子分型，目前將雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2 3種基因的表達(dá)作為乳腺癌個(gè)體化治療的關(guān)鍵。人表皮生長(zhǎng)因子受體2是表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的一種跨膜酪氨酸激酶受體，在20%的乳腺癌中出現(xiàn)了基因擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，并且在缺乏系統(tǒng)性治療的情況下與預(yù)后不良密切相關(guān)[4]。HER-2陽(yáng)性乳腺癌有著更具侵襲性的組織病理學(xué)和臨床特征，例如高組織學(xué)分級(jí)以及轉(zhuǎn)移潛能增高，同時(shí)還激活各種細(xì)胞信號(hào)通路加速細(xì)胞增殖和凋亡抑制[5]。

近年來(lái)HER-2陽(yáng)性乳腺癌也取得了很大進(jìn)展，臨床試驗(yàn)確立了單克隆抗體曲妥珠單抗作為HER-2陽(yáng)性乳腺癌的治療標(biāo)準(zhǔn)，除此之外還有低分子拉帕替尼和來(lái)那替尼也提供了額外的治療選擇[6]。曲妥珠單抗雖然可以顯著改善乳腺癌患者的預(yù)后，也是HER-2靶向治療的關(guān)鍵。然而，HER-2的表達(dá)并不保證對(duì)曲妥珠單抗或其他HER-2靶向治療有臨床療效，在最初階段或許有療效，但很多最后出現(xiàn)了耐藥與復(fù)發(fā)[7]。這種耐藥的出現(xiàn)使得抗HER-2治療成為臨床治療HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌的難題。因此，針對(duì)HER-2及其藥物治療抵抗進(jìn)行研究，尋找一些HER-2治療相關(guān)線索，對(duì)改善HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者治療效果會(huì)有巨大的幫助。

TPD52是一種含有螺旋序列的承載蛋白，在細(xì)胞增殖、凋亡、囊泡運(yùn)輸、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[8]。TPD52位于染色體8q21，編碼蛋白約為200個(gè)氨基酸，在多種腫瘤中存在著過(guò)度表達(dá)，并且與腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TPD52在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織，并且在HER-2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于HER-2陰性乳腺癌，提示TPD52可能參與了乳腺組織的癌變過(guò)程。Roslan等[9]研究表明，乳腺癌中TPD52存在表達(dá)上調(diào)，并且TPD52在HER-2陽(yáng)性亞型中出現(xiàn)顯著過(guò)度表達(dá)，TPD52的高水平與乳腺癌患者的無(wú)病生存率差密切相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HER-2擴(kuò)增的乳腺癌細(xì)胞系依賴TPD52進(jìn)行存活，這提示TPD52的過(guò)度表達(dá)可能促進(jìn)HER-2靶向治療的抵抗。除此之外，與正常前列腺組織比較，TPD52在前列腺癌中的表達(dá)水平顯著增高，并且其表達(dá)水平與Gleason分級(jí)和疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，具有對(duì)疾病預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在價(jià)值[10]。與正常卵巢上皮比較，在卵巢癌所有組織學(xué)亞型中均發(fā)現(xiàn)存在著TPD52過(guò)度表達(dá)[11]。

TPD52在肺鱗狀細(xì)胞癌中也存在表達(dá)增高，并且通過(guò)敲除TPD52基因能夠使腫瘤細(xì)胞的侵襲性得到了顯著抑制[12]。與正常睪丸比較，TPD52在原發(fā)性睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中過(guò)度表達(dá)。正常睪丸中未檢測(cè)到TPD52的表達(dá)，只有少部分癌前病變樣本中檢測(cè)到TPD52的表達(dá)，提示TPD52參與了細(xì)胞的惡變進(jìn)展[13]。TPD52在結(jié)直腸癌中也出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)，在轉(zhuǎn)移性癌灶中檢測(cè)出的TPD52水平比原發(fā)灶要顯著增加，并且其高表達(dá)水平與高分期及差預(yù)后密切相關(guān)[14]。在膽管癌中也檢測(cè)到了TPD52的表達(dá)增高，其高表達(dá)水平與癌組織的病理學(xué)分化程度、腫瘤分期和預(yù)后較差呈正相關(guān)[15]。國(guó)外研究者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)TPD52在膽囊癌中出現(xiàn)了表達(dá)的上調(diào)[16]。除此之外，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也出現(xiàn)了TPD52的過(guò)度表達(dá)[17]。在急性髓系白血病患者中發(fā)現(xiàn)存在TPD52的表達(dá)升高，并且Kaplan-Meier曲線顯示TPD52過(guò)度表達(dá)與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[18]。同時(shí)本組結(jié)果也顯示了HER-2陽(yáng)性乳腺癌中TPD52的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示著TPD52可能增強(qiáng)了腫瘤的惡性程度。

此外，本研究結(jié)果顯示在HER-2陽(yáng)性乳腺癌中TPD52高表達(dá)組的的乳腺癌組織ki-67及Cyclin D1表達(dá)水平也顯著增高。ki-67是一種腫瘤增殖蛋白，只在分裂期的細(xì)胞核中表達(dá)，Cyclin D1是一種細(xì)胞周期蛋白，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，本研究結(jié)果提示，TPD52可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Ren等[19]研究了乳腺癌中TPD52的作用，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TPD52基因敲除后的腫瘤出現(xiàn)了ki-67表達(dá)水平的降低，并且上調(diào)TPD52的表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞系的增殖，這些提示TPD52有著促進(jìn)腫瘤增殖的作用。Dasari等[20]在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，TPD52的基因擴(kuò)增能夠上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)并且下調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，從而促進(jìn)著細(xì)胞的增殖能力，并且TPD52的過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1來(lái)保護(hù)前列腺癌細(xì)胞系免受細(xì)胞凋亡。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，TPD52的敲除不僅顯著抑制細(xì)胞增殖和集落形成，而且在體外誘導(dǎo)了G0/G1細(xì)胞周期停滯。有研究者通過(guò)下調(diào)TPD52的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)能夠抑制子宮平滑肌瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且在G1期停滯[22]。國(guó)外研究顯示，通過(guò)下調(diào)乳腺癌中TPD52的表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡，從而提升乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感度[23]。Abe等[24]在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了TPD52的過(guò)表達(dá)，并且可促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞死亡抵抗。此外，在胰腺癌、宮頸癌和鼻咽癌中，沉默TPD52基因的表達(dá)也能夠降低癌細(xì)胞的增殖活性并且誘導(dǎo)其凋亡[25～27]。

綜上所述，本研究證實(shí)了TPD52在HER陽(yáng)性乳腺癌組織中存在顯著表達(dá)上調(diào)，同時(shí)與腫瘤惡性程度升高及細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)密切相關(guān)。因此，今后TPD52可能會(huì)為HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者的靶點(diǎn)治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。