海南銅鼓嶺熱帶季雨矮林樹干附生地衣及其內(nèi)生真菌多樣性的研究

李英英 鄭云柯 王祝年

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南海口 571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南?？?571101）

銅鼓嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于海南島東北部的 文 昌 市 內(nèi) ， 地 理 坐 標(biāo) 為 E 110°58′30″～111°03′00″，N 19°36′54″～19°41′21″，保護(hù)區(qū)總面積為44 km2，其中陸地面積為13.33 km2，海域面積為30.67 km2，核心區(qū)500 hm2。銅鼓嶺保護(hù)區(qū)屬于熱帶海洋性島嶼季風(fēng)氣候區(qū)，具有全年無霜、雨量充沛、干濕季節(jié)分明、日照充足等特點(diǎn)；年平均氣溫23.9℃，全年日照時(shí)數(shù)為2 137 h，年均降雨量為1 721.6 mm，年均蒸發(fā)量為1 872.7 mm。東北風(fēng)為該區(qū)常年的主導(dǎo)風(fēng)向，年平均風(fēng)速為2.8 m/s；東南向波浪為常波浪，海域風(fēng)浪常以 3級(jí)風(fēng)浪為主。銅鼓嶺保護(hù)區(qū)土壤以磚紅壤為主，其土層淺薄，土壤發(fā)育程度相對(duì)較低；迎海面土壤較為濕潤(rùn)，背海面巖石的裸露面積大，土壤含水量較低；水系不發(fā)達(dá)，由于山區(qū)面積較小、坡度大、土層薄，集水條件差，因此銅鼓嶺山地沖溝多為干涸或間歇溝，且東西向多呈平行并近似垂直于山體走向分布，地表經(jīng)流分別向東注入南海，向西流入堆積平原[1]。銅鼓嶺的水熱氣候因素為該區(qū)植被的生長(zhǎng)發(fā)育提供了有利條件，保護(hù)區(qū)內(nèi)植被茂密，植物資源豐富；由于受到海陸風(fēng)和海潮的影響，銅鼓嶺地區(qū)的植被呈明顯的垂直分布和水平分布規(guī)律，植被類型隨著海拔和階地、坡向的不同，有很大的區(qū)別。從濱海沼澤、沙灘、階地至山麓和丘陵依次分布有濱海沙生植被、山麓灌木林、紅樹林、熱帶常綠季雨矮林及局部人工栽培的人工林等植被類型，其中頂級(jí)植被類型為熱帶常綠季雨矮林[2-5]?；阢~鼓嶺自然保護(hù)區(qū)內(nèi)熱帶季雨矮林的特殊性，較多的學(xué)者對(duì)該森林生態(tài)系統(tǒng)開展研究，但截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)該保護(hù)區(qū)內(nèi)地衣多樣性的相關(guān)研究，本次調(diào)查彌補(bǔ)了該區(qū)地衣相關(guān)研究的空白。

地衣是一類由真菌和綠藻或藍(lán)細(xì)菌組成的可進(jìn)行無性或有性繁殖的共生生物體，而此類與特定的藻類或藍(lán)細(xì)菌處于穩(wěn)定共生聯(lián)合狀態(tài)的專化性真菌在形成的地衣共生體中占據(jù)重要優(yōu)勢(shì)地位；真菌是地衣體的主要成員，它決定了地衣體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，且地衣的有性生殖過程就是真菌的生殖過程，所以地衣又稱為地衣型真菌(lichenied fungi)[6]。構(gòu)成地衣的真菌稱為地衣型真菌，而生長(zhǎng)于地衣菌絲體內(nèi)的非地衣型真菌也是一個(gè)龐大的類群，此類真菌被稱為地衣內(nèi)生真菌（endolichenic fungi）[7]。內(nèi)生真菌是指在其自身生活史中的某一個(gè)階段存在于健康的植物組織內(nèi)部，但不會(huì)引起宿主明顯病癥或不會(huì)對(duì)宿主造成明顯傷害的真菌[8]。地衣是森林生態(tài)系統(tǒng)中附生生物的重要組成部分，不僅能維持森林生態(tài)系統(tǒng)中物種的多樣性和完整性，對(duì)于林中環(huán)境的變化也具有檢測(cè)能力；另外，由于地衣耐寒、耐旱，且對(duì)生境的營(yíng)養(yǎng)成分要求不高，所以分布十分廣泛。與此同時(shí)，作為先鋒植物的地衣，在森林群落原生演替過程中，對(duì)于土壤的形成和群落中環(huán)境條件的改善也起著至關(guān)重要的作用[9]。

本次考察對(duì)保護(hù)區(qū)內(nèi)森林群落中重要值排名前 20的相關(guān)樹種[10]樹干上附生地衣進(jìn)行采集，并通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)地衣及其內(nèi)生真菌進(jìn)行分類學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)銅鼓嶺自然保護(hù)區(qū)內(nèi)重要值前 20的樹種（表1）進(jìn)行樹干附生地衣的采樣，共采集地衣樣品252份。

表1 熱帶季雨矮林重要值前20的樹種名錄

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴(kuò)增利用改良的 CTAB法[11]提取地衣的總DNA，以通用引物ITS1F(5‘-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’)和 ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)對(duì)真菌的 rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。

PCR 反應(yīng)體系：10×Taq buffer緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L 的 d NTP 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、引物 ITS4(10 μmol/L)和 ITS4(10 μmol/L)各 0.5 μL，BSA 溶液 2 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 17.5 μL，總體積 25 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸55 s，循環(huán)30次；72℃延伸10min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像儀分析條帶。割膠回收條帶清晰的樣品，將純化后的樣品送北京諾賽基因測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析利用BioEdit 5.0.6對(duì)序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行手工校正，將獲得的正確序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)搜索，確定與本實(shí)驗(yàn)克隆親緣關(guān)系最近的種屬名稱；挑選親緣關(guān)系相近的參考序列，采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣型真菌種類

對(duì)地衣型真菌樣品的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，將所獲得的 rDNA-ITS片段在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果見表2，同時(shí)對(duì)具有較高同源性的參考序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）?？梢钥闯?，此次調(diào)查共發(fā)現(xiàn)8科13屬26種地衣型真菌，其中擔(dān)子菌門1種，子囊菌門25種。

圖1 地衣序列進(jìn)化樹

表2 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對(duì)結(jié)果

2.2 地衣內(nèi)生真菌種類

對(duì)地衣內(nèi)生真菌樣品進(jìn)行DNA提取克隆，測(cè)序陽性克隆，將目的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見表3。根據(jù)表3可將內(nèi)生真菌分為擔(dān)子菌門和子囊菌門兩大類，對(duì)具有較高同源性的參考序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2、3）。此次調(diào)查共發(fā)現(xiàn)31種內(nèi)生真菌，其中擔(dān)子菌門包含8種，子囊菌門包含23種。

圖2 擔(dān)子菌門內(nèi)生真菌進(jìn)化樹

表3 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對(duì)的結(jié)果

續(xù)表3 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對(duì)的結(jié)果

續(xù)表3 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對(duì)的結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 地衣型真菌多樣性

地衣中的共生菌多為子囊菌，少數(shù)為擔(dān)子菌，主要負(fù)責(zé)吸收水分和無機(jī)鹽；提供光合作用的共生體多為藍(lán)藻或綠藻，負(fù)責(zé)制造營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[13-17]。本研究根據(jù)序列測(cè)序結(jié)果共得到地衣型真菌 26種，其中25種地衣型真菌為子囊菌門，隸屬8科13屬，分別為點(diǎn)衣屬（Ocellularia）、茶漬衣屬（lecanora）、文字衣屬（Graphis）、樹花屬(Ramalina)、大葉梅屬(Parmotrema)、凸唇衣屬(Platygramme)、Thelotremateae、絮緣衣屬（Byssoloma）、Absconditella、Austroparmelina、類小核衣屬（Pyrenula）、Chaenothecopsis、Graphidoideae。文字衣科(Graphidaceae)的地衣占50%，其中擔(dān)子菌門只有一種，為云片衣屬。說明在銅鼓嶺熱帶季雨矮林內(nèi)，子囊菌門的地衣在地衣種類中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且文字衣科的地衣最多。

3.2 地衣內(nèi)生真菌多樣性

地衣內(nèi)生真菌與植物內(nèi)生真菌相似，不僅不引起宿主表現(xiàn)病癥，在分類學(xué)、多樣性和進(jìn)化歷史等方面也都有一定的相似性[18]。李銘[19]研究中國云南麗江老君山地區(qū)的地衣內(nèi)生真菌多樣性時(shí)，對(duì)68株具有代表性的真菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)的內(nèi)生真菌全部屬于子囊菌門，分屬于座囊菌綱、散囊菌綱、垂舌菌綱、茶漬綱、糞殼菌，共5綱17目，多樣性程度較高，并指出不同地衣類型是地衣內(nèi)生真菌多樣性的主導(dǎo)因素。

本研究根據(jù)結(jié)果將所調(diào)查的地衣內(nèi)生真菌分為31種，可以劃分擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)兩個(gè)大類，其中擔(dān)子菌門包含8種，分屬于柄銹菌綱(Pucciniomycetes)、擔(dān)子菌綱(Heterobasidiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)，共 4綱 5目；子囊菌門包含 23種，分屬于子囊菌綱（Ascomycetes）、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、核菌綱(Pyrenomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、圓盤菌綱(Orbiliomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)，共6綱10目。表明在地衣體內(nèi)除去構(gòu)成地衣的地衣型真菌，地衣內(nèi)生真菌也是種類和資源豐富的物種，此類真菌可能會(huì)對(duì)地衣自身的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，有待深入系統(tǒng)地開展研究。

圖3 子囊菌門內(nèi)生真菌進(jìn)化樹

目前，關(guān)于海南地衣的研究報(bào)道還相對(duì)較少，本研究嘗試對(duì)銅鼓嶺熱帶季雨矮林內(nèi)的地衣進(jìn)行調(diào)查，利用當(dāng)前流行的分子測(cè)序技術(shù)，鑒定地衣及其內(nèi)生真菌的種類。雖然本實(shí)驗(yàn)樣地內(nèi)的地衣型真菌和地衣內(nèi)生菌群落顯示出了一定的生物多樣性，但與 GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)地衣型真菌和地衣內(nèi)生菌為未知群落，導(dǎo)致無法明確大部分地衣型和地衣內(nèi)生菌的分類，然而這一結(jié)果也暗示，該區(qū)地衣型真菌和地衣內(nèi)生菌可能具有其獨(dú)特的新類群。因此，對(duì)該區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中的地衣開展研究具有重大價(jià)值和意義。