基于生物脫腥的扇貝揮發(fā)性風味成分解析

林曉姿，梁璋成，韋 航，何志剛*，林曉婕，蘇 昊

（1 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福州 350003 2 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室 福州 350003 3 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所 福州 350003）

扇貝又名海扇，是我國沿海主要養(yǎng)殖貝類之一，屬于典型的高蛋白質(zhì)生物資源[1]。其較為明顯的腥味影響大部分消費者的接受度，也不利于精深加工。扇貝采用濾食性捕食方式，能富集生長環(huán)境中大量復雜的微生物菌群，其中超過50%豐度的細菌未被鑒定出來[1]，這是扇貝養(yǎng)殖、貯藏、加工等環(huán)節(jié)潛在的生物性安全隱患。臭氧被證實是一種高效的經(jīng)濟型滅菌方式，可在較短時間內(nèi)明顯減少菌量或抑制貯藏期間的微生物增殖[2]。水產(chǎn)品的腥味物質(zhì)主要由內(nèi)源酶降解、脂質(zhì)氧化、微生物生長、飲食或環(huán)境污染等產(chǎn)生[3]，如堿性氨基酸在酶催化和轉(zhuǎn)化作用下生成具有異味的δ-2 氨基戊酸、δ-2 氨基戊醛和六氫吡啶等成分[4]。脂肪氧合酶降解多不飽和脂肪酸產(chǎn)生2，4-癸二烯醛、2，4，7-癸三烯醛等不良氣味[5]，而不同水產(chǎn)品的嗅覺腥味與其揮發(fā)性物質(zhì)組成及其含量密切相關(guān)。脫腥處理可分為物理法、化學法及生物法等，物理和化學方法成本較高，對風味等品質(zhì)損害較大或存在安全隱患；生物脫腥是利用微生物代謝或微生物酶作用，對小分子異味物質(zhì)進行分子結(jié)構(gòu)修飾或轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)，實現(xiàn)有效脫除異味[6]。乳酸菌及酵母菌都有良好的生物脫腥作用，是常用的生物脫腥菌種。適宜的乳酸菌應具有良好的產(chǎn)酸性，且具有脫羧酶陰性、明膠液化陰性、胺氧化酶陽性、產(chǎn)H2S 及H2O2陰性、能產(chǎn)生良好風味等基本特征[7]。不同微生物的代謝路徑及機制不同，其發(fā)酵脫腥效果及風味也存在差異?，F(xiàn)有研究大多應用在魚類及其制品上，如用安琪酵母[8-9]和植物乳桿菌[10-11]對魚類產(chǎn)品進行發(fā)酵脫腥，主要是脫除辛醛、庚醛、苯甲醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇等醛類物質(zhì)，尤其是去除烯醛類、二烯醛類物質(zhì)作用，而具有奶香氣味的己酸、2，3-丁二酮、乙偶姻、3-甲基-1-丁醇、十二酸乙酯、十四酸乙酯等物質(zhì)含量增加，從而實現(xiàn)生物脫腥效果。目前鮮有針對扇貝進行脫腥處理及揮發(fā)性風味成分的報道。本課題組前期采用混菌發(fā)酵技術(shù)對海帶進行脫腥處理，取得良好效果[12]。本文利用臭氧進行減菌預處理，聯(lián)合乳桿菌和釀酒酵母對扇貝進行復合發(fā)酵生物脫腥，研究微生物發(fā)酵脫腥對扇貝原料揮發(fā)性風味的影響，為扇貝精深加工提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

1.1.1.1 菌種 副干酪乳桿菌副干酪亞種RP38（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）和釀酒酵母JJ4（Saccharomyces cerevisia），福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室分離并保藏。

1.1.1.2 扇貝 養(yǎng)殖于漳州海域，收獲后速凍至-18 ℃，由福建樂隆隆食品科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 MRS 液體培養(yǎng)基 用于乳酸菌活化、擴培。

1.1.2.2 糖蜜培養(yǎng)基 將糖蜜稀釋至可溶性固形物至5%，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值至5.0±0.2，115 ℃高壓滅菌30 min。用于酵母菌活化、擴培。

1.2 儀器與設備

GC-2010 氣相色譜、GCMS-TQ 8040 質(zhì)譜，日本島津公司；KMSY-5G 臭氧發(fā)生器 （臭氧產(chǎn)量5 g/h，出氣量10 L/min），青島科美力創(chuàng)凈化設備有限公司；SPME 裝置手柄、固定搭載裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國Supelco 公司；SYG-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備[12]乳酸菌RP38 和釀酒酵母JJ4 經(jīng)兩次活化，分別擴培至菌量達1.0×109CFU/mL 和5.0×108CFU/mL 以上，以4 800 r/min、4 ℃離心5 min，取菌坭洗脫2 次，備用。將菌種RP38 用等體積無菌水振蕩懸浮，成為乳酸菌種子液。將菌種RP38 和JJ4 按3 ∶1 比例用等體積無菌水振蕩懸浮，成為混菌種子液。

1.3.2 脫腥處理 配制1%糖水，用檸檬酸調(diào)節(jié)至pH 4.5，115 ℃高壓滅菌20 min，制備成發(fā)酵基液，備用。扇貝原料解凍，清洗后瀝干，加水浸沒，通臭氧預處理20 min，撈出瀝干10 min，取100 g 加入發(fā)酵基液50 g，按總質(zhì)量的1%分別接入乳酸菌種子液和混菌種子液，充CO2密封，于30 ℃下隔氧發(fā)酵6 h，分別進行感官評價并取樣檢測臭氧預處理后（C 組）及發(fā)酵后（乳酸菌單菌為R 組，混菌組為RJ 組）的扇貝揮發(fā)性風味物質(zhì)成分。試驗重復3 次。

1.4 檢測方法

1.4.1 菌落總數(shù) 采用GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中的方法。

1.4.2 揮發(fā)性鹽基氮 采用GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的方法。

1.4.3 硫代巴比妥酸（TBA） 采用GB/T 35252-2017 《動植物油脂2-硫代巴比妥酸值的測定 直接法》中的方法。

1.4.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

1.4.4.1 固相微萃?。⊿PME）條件 樣品瀝干后打漿。將萃取頭250 ℃老化60 min，備用。取5.0 g 粉碎均勻的待測樣品于20 mL 萃取瓶中，封口，置60 ℃水浴加熱10 min 達到平衡，插入老化的萃取頭，萃取30 min 后，轉(zhuǎn)移至250 ℃進樣口中熱解析3 min，插入GC-MS 進樣口。

1.4.4.2 GC-MS 分析條件

1） GC 條件 毛細管柱Rtx-5Sil MS （30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。程序升溫方式：起始溫度35 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 速率升至90 ℃，保持1 min；以5 ℃/min 速率升至140 ℃，保持1 min；以8 ℃/min 速率上升至250 ℃，保持5 min。載氣為He，純度99.999%，流速1.0 mL/min，不分流進樣。

2） MS 條件 EI 模式，電壓為70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描速率2.88 scan/s，質(zhì)譜檢測范圍35～550 m/z，發(fā)射電流100 μA。

1.4.4.3 化合物定性和半定量分析[8，12]

1） 定性分析 將氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀所得數(shù)據(jù)通過NIST2014 譜庫檢索，選擇RTE 積分器積分，選擇質(zhì)量數(shù)大于80 的化合物，結(jié)合保留指數(shù)（Retention index，RI）做定性分析。

2） 半定量分析 扣除色譜圖中的硅氧烷類雜峰及其它非嗅感物質(zhì)雜峰，計算揮發(fā)性風味物質(zhì)的總峰面積，采用面積歸一化法計算各化合物的相對含量。以C7～C30正構(gòu)烷烴（質(zhì)量濃度為20 μg/mL，溶于二氯甲烷溶劑）為標準品，采用保留指數(shù)的線性升溫公式：RI=100n+100（tx-tn）/ （tn+1-tn），計算各揮發(fā)性組分的RI 值，其中 tx、tn、tn+1分別為被分析組分和碳原子處于n 和n+1 之間的正構(gòu)烷烴混標標準品流出峰的保留時間。

1.4.5 感官評價 根據(jù)GB/T 10220-2012 《感官分析 方法學 總論》及GB/T 16861-1997《感官分析 通過多元分析方法鑒定和選擇用于建立感官剖面的描述詞》進行剖面描述。評價小組由10 位經(jīng)過培訓的感官評定員組成，選定海腥味、泥土味、鮮甜味、醇香味、花草味和奶酪味為氣味感官描述詞，要求評價員采用標度“0～5”定量描述感受到的風味強度，采用雷達圖法對原料組（CK 組）、臭氧處理組（C 組）、乳酸菌RP38 發(fā)酵組（R 組）、混菌RP38+JJ4 發(fā)酵組（RJ 組）進行分析與評價。

1.4.6 關(guān)鍵風味活性成分的評價方法[13]采用相對氣味活度值（ROAV）評價各化合物對樣品風味的貢獻。對樣品總體風味貢獻最大的組分定義為：ROAVstan=100，其它揮發(fā)性風味活性成分的ROAV 計算公式：ROAVi≈100×Cri/Crstan×Tstan/Ti。式中，Cri 和Ti 分別是各揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量（%）和感覺閾值（μg/kg）；Crstan、Tstan 分別是對樣品總體風味貢獻最大（OAV 值最高）組分的含量（%）和感覺閾值（μg/kg），ROAV 值越大的組分對樣品總體風味的貢獻越大。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 19.0 軟件進行ANOVA 方差分析，采用Origin 2019 繪圖并計算均值標準誤SEM，數(shù)據(jù)用（±s）表示。采用SIMCA 14.1 軟件進行主成分PCA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理對扇貝鮮度的影響

臭氧是水產(chǎn)品減菌處理常見的方式[14]。揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨和胺類堿性物質(zhì)，是食品安全和評價水產(chǎn)品鮮度的重要標準[15]。硫代巴比妥酸（TBA）是與脂肪氧化密切相關(guān)[16]，可用菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮和硫代巴比妥酸代表原料的新鮮度。扇貝臭氧水處理前、后的結(jié)果見圖1。臭氧處理能降低菌落總數(shù)約1 個數(shù)量級，并減少48.4%的TVB-N，差異均達極顯著水平（P<0.01）。TBA 略有上升，差異不顯著。TVB-N 是蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶和微生物作用下分解產(chǎn)生的氨和胺類堿性物質(zhì)，臭氧處理能快速減少雜菌并破壞相關(guān)內(nèi)源酶活性，因此有利于降低TVB-N 含量。

圖1 臭氧處理對菌落總數(shù)、TVB-N 和TBA 的影響Fig.1 Effects of ozone treatment on the total number of colonies，TVB-N and TBA

2.2 扇貝生物脫腥處理前、后的風味

原料組（CK 組）、臭氧處理組（C 組）、乳酸菌RP38 發(fā)酵組（R 組）和混菌RP38+JJ4 發(fā)酵組（RJ組）的感官評價結(jié)果見圖2。CK 組和C 組的扇貝風味接近，帶有典型的海腥味和泥土味，R 組和RJ組的生物發(fā)酵都脫除了大部分腥味和土味，R 組具有典型的乳酸發(fā)酵特點和花果香，RJ 組則增加了酵母發(fā)酵的醇香味和鮮甜味。綜上，臭氧處理沒有顯著改變對扇貝的風味，即脫腥效果不明顯，而生物發(fā)酵改變了扇貝風味特征且脫腥效果顯著。

圖2 扇貝生物脫腥感官剖面圖Fig.2 The sensory section of biological deodorization of the kelp

2.3 生物脫腥前、后的揮發(fā)性成分

分別將C 組、R 組和RJ 組進行HS-SPMEGC-MS 解析，GC-MS 總離子流圖見圖3。3 個處理組圖譜各不相同，說明生物發(fā)酵對扇貝揮發(fā)性成分組成影響較大。從韋恩圖（圖4）也可看出，各處理組的共有成分占58%，單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵分別新增成分20 個和22 個。

圖3 不同處理組揮發(fā)性成分的GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion flow diagram of volatile flavor components in different treatment groups

圖4 各處理組的韋恩圖Fig.4 Venn diagram in different samples

共檢測出112 種成分（表1），3 個處理組的主要揮發(fā)性成分分別是醛類 （26.67%～34.64%）、醇類（19.09%～33.10%）、酮類（9.79%～11.59%）和烯炔類（6.41%～11.41%）。各處理組揮發(fā)性共有成分以醇類、醛類和酮類為主，占比較大的是：壬醛、2-乙基-己醇、正辛醛、庚醛、（+）-檸檬烯、正辛醇、3-癸烯-2-酮、2-十一酮、3-十二炔、1-壬醇、2-壬酮、癸醛等。各處理組中的酸類成分少且含量低，也未檢出乙醇等酵母代謝產(chǎn)物，這可能與本試驗采用的弱極性毛細管柱有關(guān)。也有報道認為HPSPME 技術(shù)對于強極性成分的萃取效果較差[17]。

/%RJ 組/%R 組1.24±0.12-0.64±0.01 0.57±0.07 0.17±0.02 0.21±0.01 1.71±0.37 0.71±0.07 0.23±0.07-1.01±0.02 1.09±0.10---6.42±0.38 6.26±0.26-1.41±0.04 1.44±0.06 4.86±0.17 7.27±0.17 6.51±0.20 7.22±0.08 0.22±0.03 0.30±0.04 4.82±0.33 6.64±0.12 0.56±0.01-0.05±0.02 0.08±0.01 0.40±0.03 0.59±0.05 1.23±0.05 1.72±0.07 0.13±0.02 0.15±0.00--0.09±0.01 0.1±0.01-0.09±0.00 27.74±0.81 33.10±0.38 0.04±0.01-1.71±0.02 2.08±0.04 1.09±0.01 1.19±0.02 0.29±0.01 0.28±0.01--0.18±0.03 0.18±0.01）（n=3果結(jié)析解GC-MS的分成性發(fā)揮組理處各1表）（n=3 Volatile flavor components in different samples by GC-MS analysis Table 1 /%C 組式子分RI CAS稱名文英0.25±0.12 NO2 H9 C8 945 2941-78-8 2-Amino-5-methylbenzoic acid 0.63±0.08 O2 H12 C6 1 265 88-09-5 2-Ethylbutanoic acid-O2 H22 C11 1 294 33933-81-2 7-Methyl-4-octanyl acetate 1.54±0.72-O H12 C5 786 71-41-0 1-Pentanol 0.54±0.09 O H14 C6 884 111-27-3 Hexanol 0.71±0.09 O H14 C7 996 591-23-1 3-Methylcyclohexanol 0.45±0.12 O H16 C7 1 001 111-70-6 1-Heptanol-O H12 C5 1 002 137-32-6 2-Methyl-1-butanol 1.80±0.43 O H16 C8 1 010 3391-86-4 1-Octen-3-ol 7.68±0.53 O H18 C8 1 064 104-76-7 2-Ethyl hexanol 3.71±0.50 O H18 C8 1 109 111-87-5 1-Octanol 0.23±0.01 O H32 C18 1 149 506-44-5（9Z，12Z，15Z）-Octadecatrien-1-ol-1-烯三2.12±0.35 O H20 C9 1 217 143-08-8 1-Nonanol-O H16 C9 1 241 53544-48-2 2-Methylene-cyclopentanepropanol 0.07±0.04 O H22 C10 1 261 10042-59-8 2-Propylheptanol 0.20±0.02 O H22 C10 1 321 112-30-1 1-Decanol 1.60±0.02 O H20 C10 1 331 51100-54-0 1-Decen-3-ol 0.18±0.01 O H26 C12 1 443 112-53-8 1-Dodecanol 0.05±0.02 O H42 C20 1 489 629-96-9 1-Eicosanol-O H28 C13 1 535 112-70-9 1-Tridecanol-O H26 C15 1 688 515-69-5 α-Bisabolol 19.09±1.39 0.09±0.04 O H16 C8 978 928-68-7，6-methyl-2-Heptanone 2.11±0.09 O H18 C9 1 127 821-55-6 2-Nonanone 1.04±0.11 O H12 C8 1 129 38284-27-4，5-Octadien-2-one 3酮-2--O H14 C9 1 155 78-59-1 Isophorone 0.38±0.04 O H36 C18 1 236 502-69-2 Hexahydrofarnesyl acetone-O H18 C10 1 328 56606-79-2 1-Decen-3-one稱名質(zhì)物酸甲苯基甲-5-基氨2-酸丁基乙2-酸乙-醇辛-4-基甲7-醇戊1-醇己正醇己環(huán)基甲3-醇庚正醇丁基2-甲醇-3-烯辛1-醇己基乙2-醇辛正碳八（9Z，12Z，15Z）-十醇醇壬1-醇丙烷戊環(huán)基-甲亞2-醇庚-1-基丙2-醇癸1--3-醇烯1-癸醇二十醇十二1-醇三十1-醇藥沒紅酮庚-2基甲6-酮壬2-烯二，5--3辛）-，5E（3E酮爾佛異酮植酮-3-癸1-號序1 2 3類酸1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18類醇1 2 3 4 5 6

/%組RJ/%組R/%組C 0.16±0.01 0.16±0.02-2.48±0.25 2.74±0.19 2.77±0.03 0.23±0.01 0.29±0.03-2.09±0.17 2.59±0.20 2.51±0.14 1.01±0.01 1.30±0.05 1.31±0.04 0.30±0.02 0.37±0.01 0.39±0.03 0.20±0.02 0.31±0.01 0.30±0.02 0.03±0.02--0.06±0.01 0.10±0.01 0.09±0.01 9.79±0.46 11.59±0.38 10.86±0.23 0.46±0.13 0.29±0.03 0.62±0.15 0.53±0.09 0.17±0.01 0.26±0.00 2.42±0.02 2.58±0.12 4.43±0.31 0.32±0.06 0.24±0.02-0.98±0.06 0.88±0.08 0.55±0.00 3.75±0.18 4.52±0.27 7.37±0.66 0.88±0.14 0.73±0.04 0.18±0.04 0.46±0.10 0.26±0.04 0.24±0.07 9.22±0.11 12.51±1.15 15.45±1.37 0.76±0.07 0.84±0.01 0.63±0.04 0.40±0.03 0.46±0.02 0.35±0.06 0.31±0.05 0.33±0.01 0.27±0.04 0.57±0.04 0.99±0.11 1.85±0.38-0.12±0.00-0.61±0.06 0.59±0.01 0.44±0.04 0.32±0.07--0.16±0.03--0.91±0.16--0.36±0.02 0.49±0.04 0.71±0.09 0.28±0.02 0.27±0.01 0.30±0.02 0.08±0.01-0.10±0.01 0.27±0.01 0.27±0.02 0.28±0.02-0.04±0.01 0.06±0.01式子分RI CAS O H22 C11 1 336 2216-87-7 O H22 C11 1 341 112-12-9 O2 H12 C9 1 366 16473-11-3 O H18 C10 1 391 10519-33-2 O H20 C11 1 437 16587-71-6 O H20 C13 1 474 127-41-3 O H20 C13 1 539 79-77-6 O2 H28 C16 1 546 7779-50-2 O H26 C13 1 555 593-08-8 O H12 C6 809 66-25-1 O H10 C6 864 6728-26-3 O H14 C7 917 111-71-7 O H12 C7 981 57266-86-1 O H6 C7 985 100-52-7 O H16 C8 1 033 124-13-0 O H10 C7 1 042 4313-03-5 O H14 C8 1 096 2548-87-0 O H18 C9 1 141 124-19-6 O H14 C9 1 191 557-48-2 O H16 C9 1 199 18829-56-6 O H24 C12 1 204 110-41-8 O H18 C10 1 499 65405-70-1 O H20 C10 1 251 112-31-2 O H18 C10 1 307 3913-81-3 O H16 C10 1 368 25152-84-5 O H22 C12 1 420 4826-62-4 O2 H22 C13 1 445 31906-04-4 O H24 C12 1 461 112-54-9 O H30 C15 1 571 75853-51-9 O H28 C14 1 639 124-25-4 O H30 C15 1 678 2765-11-9 O H26 C13 1 755 10486-19-8）1稱名文英稱名質(zhì)物3-Undecanone酮一十3-Undecan-2-one酮一十2-，6-dione）nonane-2（3.3.1 Bicyclo酮二，6--2烷壬[3.3.1]環(huán)二3-Decen-2-one酮-2-烯癸3-4-Tert-pentylcyclohexanone酮己）環(huán)基丙基甲4-（1，1-二α-Ionone酮羅紫α-β-Ionone酮羅紫β-酮 Oxacycloheptadec-7-en-2-one-2-烯-7-碳七十環(huán)代氧）-（Z 2-Tridecanone酮烷三十2-Hexanal醛己（2E）-2-Hexenal醛烯2-已Heptanal醛庚）-2-Heptenal（2Z醛烯庚）-2-（2Z Benzaldehyde醛甲苯Octanal醛辛正，4-Heptadienal）-2，E（E醛烯二庚，4-）-2，E（E）-2-Octenal（2E醛烯辛-2-反Nonanal醛壬（2E，6Z）-2，6-Nonadienal醛烯二（2E，6Z）-2，6-壬）-2-Nonenal（2E醛壬）-2-（2E 2-Methylundecanal醛一十基甲2-）-4-Decenal（4E醛癸-4-反Capraldehyde醛癸）-2-Decenal（2E醛烯癸）-2-（2E，4-Decadienal）-2，4E（2E醛烯二癸，4-）-2，4E（2E 2-Dodecenal醛烯二2-十Lyral醛蘭鈴新Dodecanal醛二十13-Methyltetradecanal醛蔻豆肉基甲13-1-Tetradecanal醛蔻豆肉pentadecanal醛五十Tridecanal醛三十表（續(xù)號序7 8 9 1 0 11 12 13 14 15類酮1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

/%組RJ/%組R/%組C 1.23±0.14 0.49±0.04 0.58±0.05 0.61±0.06 0.61±0.02 0.32±0.03 0.39±0.05 0.2±0.02-0.86±0.05 0.5±0.03-26.67±1.00 27.97±1.33 34.64±2.94 0.26±0.02 0.23±0.04 0.34±0.07-0.89±0.03-0.22±0.05--/0.55±0.12 0.60±0.16 0.91±0.10 0.60±0.04 0.51±0.12 0.19±0.02 0.19±0.00 0.20±0.00 0.07±0.01 0.08±0.04 0.09±0.01-0.24±0.02 0.30±0.05 0.06±0.01----0.05±0.00 1.61±0.07 2.49±0.35 1.97±0.25--4.10±0.81 1.77±0.09 2.79±0.21 3.86±0.45 0.48±0.01 0.49±0.01 0.32±0.11 2.64±0.06 2.70±0.01 2.30±0.08 0.28±0.07 0.28±0.01 0.24±0.02 0.36±0.01 0.34±0.03-0.05±0.02 0.12±0.00 0.10±0.01 0.20±0.01 0.30±0.01 0.28±0.02 0.13±0.02 0.13±0.00 0.20±0.03 0.10±0.01 0.11±0.02 0.12±0.01 0.14±0.02 0.14±0.04 0.18±0.03 0.27±0.02 0.27±0.01 0.25±0.00--0.41±0.05式子分RI CAS O H32 C16 1 785 629-80-1 O H36 C18 1 893 638-66-4 O H34 C17 1 955 629-90-3 O H40 C20 2 001 2400-66-0 O2 H12 C6 785 638-49-3 O3 H10 C6 1 112 599-04-2 FO4 H5 C6 1 137 32486-23-0 O2 H20 C10 1 242 106-32-1 O2 H14 C8 1 285 3050-69-9 O4 H20 C12 1 324 10412-78-9 O2 H24 C12 1 370 25415-84-3 O4 H30 C16 1 651 6846-50-0 O2 H32 C16 1 867 124-06-1 O4 H22 C16 2 042 84-74-2 H18 C9 1 002 4316-65-8 H16 C10 1 058 5989-27-5 H16 C9 1 105 19447-29-1 H22 C12 1 315 6790-27-8 H16 C11 1 416 33156-93-3 H26 C15 1 453 74744-49-3 H44 C22 1 496 1599-67-3 H24 C15 1 549 17066-67-0 H34 C17 1 552 6765-39-5 H24 C15 1 569 495-61-4 H24 C15 1 599 6753-98-6 H28 C17 1 621 71046-96-3 H38 C20 2 002 504-96-1稱名文英1-Hexadecanal Octadecanal Heptadecanal Icosanal Pentyl formate DL-Pantolactone）（5H）-2-oxoethyl]-2（Fluorooxy 5-[2--furanone Ethyl caprylate Vinyl caproate，4-Cyclohexylenedimethylene trans-1 diacetate 2-Ethylhexyl butanoate，3-pentanediol di-，4-Trimethyl-1，2 2 i sobutyrate Ethyl tetradecanoate Dibutyl phthalate，5-Trimethyl-1-hexene，5 3）-limonene（R）-（+2-Nonyne 3-Dodecyne）-But-1-Enyl]Cyclohep-（E）-6-[（6R，4-Diene ta-1）-7-Pentadecen-5-yne（Z 1-Docosene β-Selinene 1-Heptadecene）-β-Bisabolene（S α-Caryophyllene，14-Heptadecatetraene，11，8 1 N eophytadiene 1）表稱名質(zhì)物醛六十醛八十）醛（碳七十醛烷十二酯戊酸甲酯內(nèi)酰泛）-（-D-）基-2-喃呋-2H-代氧（5-2-氟酯酸乙酯乙酸辛酯烯乙酸己正酸乙二醇甲二，4--1烷己環(huán)-反酯酯酸丁基辛酯丁異醇二戊基甲三，4-，2 2酯乙酸四十酯丁二酸甲二苯鄰烯己-1-基甲三，5-，5 3烯檬檸）-（+炔壬2-炔二十3-庚環(huán)]基烯-1-丁）-（E）-6-[（6R烯二，4--1并炔烯五十）-7-（Z烯二十二1-烯林瑟β-烯七十亞-1-基甲（5--4-基甲）-1-（S烯己）環(huán)基烯己-4-基甲烯草律α-烯四烷七十，14-，11，8 1烯二植新（續(xù)號序2 4 25 26 27類醛1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0類酯1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13

/%組RJ/%組R 6.41±0.24 7.25±0.09---2.17±0.24 1.13±0.16 0.86±0.25 0.32±0.07-0.31±0.05 0.42±0.02 0.17±0.03 0.2±0.01 0.52±0.09 0.73±0.07--0.18±0.03 0.36±0.04 0.10±0.02 0.17±0.00 0.09±0.02--0.78±0.01 0.45±0.12 0.66±0.02---0.10±0.01 0.33±0.02 0.44±0.01 0.16±0.02 0.19±0.00-0.20±0.01 0.23±0.02 0.27±0.01 3.98±0.54 6.83±0.51 0.27±0.01 0.51±0.03 0.25±0.05 0.30±0.03 0.40±0.03 0.52±0.02 0.15±0.01 0.16±0.00-0.17±0.01 0.18±0.03 0.24±0.02 0.30±0.03 0.14±0.02 1.44±0.16 2.04±0.04/%組C 11.41±1.09 0.98±0.21--0.52±0.28 0.36±0.17 0.19±0.06 0.74±0.15 0.23±0.02 0.17±0.02 0.07±0.03 0.54±0.23 0.67±0.02 0.25±0.10--0.16±0.01-0.29±0.04 5.19±0.99 0.33±0.01 0.22±0.12 0.63±0.05 0.13±0.01-0.25±0.02 0.11±0.01 1.67±0.10式子分RI CAS H22 C10 1 029 124-18-5 H22 C10 1 014 2051-30-1 H24 C11 1 028 1120-21-4 H26 C12 1 083 17302-37-3 H26 C12 1 211 1002-43-3 H24 C12 1 228 71138-64-2 H26 C12 1 245 112-40-3 NO2 H13 C6 1 294 646-14-0 H20 C11 1 346 74663-93-7 H28 C13 1 349 629-50-5 H38 C18 1 384 20959-33-5 Br H25 C12 1 420 13187-99-0 H30 C14 1 451 629-59-4 H20 C12 1 454 27723-50-8 H32 C15 1 513 25117-24-2 H32 C15 1 560 629-62-9 H52 C25 1 617 1560-78-7 H38 C18 1 664 593-45-3 H40 C19 1 773 1921-70-6 O N2 H10 C7 1 054 79352-72-0 H8 C10 1 223 91-20-3 NO H9 C6 1 291 10412-98-3 O3 H22 C12 1 304 63169-61-9 H22 C14 1 337 1014-60-4 O H24 C15 1 564 128-37-0 N Cl2 H5 C9 1 960 21617-18-5稱名文英Decane，6-dimethyloctane 2 U ndecane，2-Dimethyldecane 2 3-Methyl-Undecane 3-Methyleneundecane Dodecane 1-Nitrohexane）bicyclo[2.2.1]hep-（1-Methylpropyl 2-tane Tridecane 7-Methylheptadecane 2-Bromododecane Tetradecane 1-Methylenespiro[5.5]undecane 4-Methyltetradecane Pentadecane 2-Methyltetracosane Octadecane Pristane 4-Amino-2-aminomethylphenol Naphthalene 5-Ketohexanenitrile 2-Methylpentanoic anhydride）-Ben-，1-Dimethylethyl（1，3-Bis 1 z ene Butylated Hydroxytoluene 4，5-Dichloroquinoline 1）表稱名質(zhì)物烷癸烷辛基甲二，6-2烷一十烷癸基甲二，2-2烷一十基甲3-烷一十基甲亞3-烷二十烷己基硝1-烷庚）-[2.2.1]基丙甲（1-2-烷三十烷七十基7-甲烷二十溴2-烷四十烷一十-基甲亞1-烷四十基甲4-烷五十正）烷（碳四十二基甲2-烷八十正烷鮫姥酚苯基氨-4-基甲基氨2-萘腈已基酮5-酐酸戊基甲2-苯-基丁叔二，3-1酚甲對基丁叔二，6-2啉喹氯4，5-二（續(xù)號序類炔烯1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19類烴烷1 2 3 4 5 6 7它其

C 組揮發(fā)性成分含量最高的類型依次是醛類、醇類和烯烴類，兩個生物發(fā)酵組則是醇類、醛類和酮類，說明生物發(fā)酵主要降解了醛類和烯炔類，增強了醇類和酮類物質(zhì)。扇貝脫腥前揮發(fā)性成分含量較高的依次是：壬醛、2-乙基-己醇、正辛醛、庚醛、3，5，5-三甲基-1-己烯、（+）-檸檬烯、正辛醇、2-十一酮、3-癸烯-2-酮、3-十二炔、1-壬醇、2-壬酮、癸醛、1-辛烯-3-醇、1-癸烯-3-醇等。單菌發(fā)酵的R 組則是：壬醛、2-乙基-己醇、正辛醇、1-壬醇、正庚醇、正辛醛、（+）-檸檬烯、2-十一酮、3-十二炔、3-癸烯-2-酮、庚醛、2，6-二甲基辛烷、2-壬酮、1-癸烯-3-醇、1-辛烯-3-醇等?；炀l(fā)酵的RJ 組是：壬醛、正辛醇、2-甲基丁醇、2-乙基-己醇、1-壬醇、正辛醛、3-十二炔、2-十一酮、庚醛、3-癸烯-2-酮、（+）-檸檬烯、2-壬酮、1-辛烯-3-醇、十六醛、1-癸烯-3-醇等。

2.4 生物脫腥對揮發(fā)性成分類型的影響

8 類成分的方差分析及其含量對比見圖5。方差齊性分析顯示，除烯炔類，其它7 類成分均為方差齊性。對齊性成分做方差分析，醇類和醛類的差異達極顯著水平，是構(gòu)成生物脫腥前、后揮發(fā)性風味的差異主體。醛類對揮發(fā)性風味貢獻較大，在生物發(fā)酵前、后都是最重要的主體成分；醇類產(chǎn)生品質(zhì)柔和的氣味，是魚肉等水產(chǎn)品的重要貢獻因素；飽和酮類物質(zhì)是不飽和脂肪酸氧化形成的穩(wěn)定羥過氧化物，氣味閾值較高，對嗅覺影響不大；烷烴類通常閾值較高，對揮發(fā)性風味影響較小[18]。

圖5 各類物質(zhì)的相對含量Fig.5 Relative content of various substances

C 組含量顯著高于其它兩個發(fā)酵組的主要有：3-甲基環(huán)己醇、2-乙基-己醇、十二醇、2-壬酮、植酮、己醛、庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、十三醛、肉豆蔻醛、3，5，5-三甲基-1-己烯、新植二烯、癸烷、1-硝基己烷、1-亞甲基-十一烷，這些成分可以認為是被生物發(fā)酵降解的成分，以醇類和低級醛為主。低級碳醛往往是扇貝中脂質(zhì)降解或氧化的產(chǎn)物[19]。短鏈飽和脂肪醛大多具有刺鼻氣味，如壬醛、正辛醛、庚醛和癸醛，不飽和酮與醛類往往有加和作用，對腥味物質(zhì)起增強作用[20]。

R 組新增或增加較多的成分可認為是乳桿菌RP38 的特征代謝產(chǎn)物，有7-甲基-4-辛醇-乙酸、正庚醇、正辛醇、1-壬醇、異佛爾酮、1-癸-3-酮、3-十一酮、二環(huán)[3.3.1]壬烷-2，6-二酮、（2Z）-2-庚烯醛、十七（碳）醛、二十烷醛、（Z）-7-十五烯炔、2，6-二甲基辛烷、十一烷、正十五烷。與C 組和R 組相比，RJ 組新增或增加較多的可能是釀酒酵母JJ4 的特征代謝產(chǎn)物：2-氨基-5-甲基苯甲酸、1-戊醇、2-甲基丁醇、2-亞甲基-環(huán)戊烷丙醇、反式-2，4-癸二烯醛、2-十二烯醛、新鈴蘭醛、氟2-（5-氧代-2H-呋喃-2-基）乙酸酯。兩個生物發(fā)酵組含量較高的是醇類、不飽和醛類和酮類，說明生物發(fā)酵主要降解飽和脂肪醛類和烯炔類，增加不飽和醛、醇類和酮類物質(zhì)。短鏈不飽和醛多有愉快的較濃郁的果香，醇類大多產(chǎn)生品質(zhì)柔和的氣味，酮類是不飽和脂肪酸受熱氧化和降解的產(chǎn)物，常帶有花香和果香，并隨碳鏈增加而呈現(xiàn)出更加明顯的花香芬芳[21]。

2.5 4 類揮發(fā)性骨架風味的主成分分析

將占比最高的醛類、醇類、酮類及烯炔類進行主成分分析，以明確影響各處理組風味的重要揮發(fā)性成分。采用散點載荷雙標圖解釋樣品間組分不同維度的顯著差異，3 個處理組載荷分析結(jié)果見圖6。3 個樣品分別處于不同象限，說明樣品間差異較明顯，C 組與兩個生物發(fā)酵組分別處于Y軸兩側(cè)，這說明生物發(fā)酵對扇貝揮發(fā)性風味影響較大，各成分與樣品間的距離可視為影響樣品風味特性的重要程度。結(jié)合表1進行綜合分析，可以找到各組樣品的特征風味成分。

圖6 生物脫腥前、后揮發(fā)性風味的散點載荷雙標圖Fig.6 Scatter load double plot of the volatile flavor compounds in microbiological deodorization

C 組特征風味成分有3-甲基環(huán)己醇、十二醇、6-甲基-2 庚酮、植酮、己醛、庚醛、正辛醛、癸醛、十二醛、3，5，5-三甲基-1-己烯等，其中飽和醛類相對含量高，己醛、正辛醛、庚醛和癸醛被證實大量存在于貝類[22-23]、魚類[11]和海帶[12]等水產(chǎn)品中，高濃度時有酸敗和令人作嘔的氣味，是腥味重要來源，而在低濃度時則呈現(xiàn)青草香味、果香味[24]。

R 組特征成分較為簡單，有正庚醇、（9Z，12Z，15Z）-9，12，15-十八碳三烯-1-醇、紅沒藥醇、反-4-癸醛、（2E）-2-壬醛等，紅沒藥醇具有花草清香[24]，正庚醇具有淡奶油香氣[25]，反-4-癸醛則具有香草青辛味。RJ 組特征是以支鏈不飽和醛類成分為主，如1-戊醇、苯甲醛、反-2-辛烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、2-十二烯醛、新鈴蘭醛、十六醛、2-甲基丁醇、2-亞甲基-環(huán)戊烷丙醇、2-已烯醛等，除了2-已烯醛和反-2-辛烯醛，其它成分均為RJ 組新增成分，說明這些成分是釀酒酵母JJ4 的代謝產(chǎn)物。其中，1-戊醇具有鮮糯果香[26]，2-甲基丁醇是酵母菌的主要代謝副產(chǎn)物[27]，2-十二烯醛和新鈴蘭醛具有清淡而甜潤的花香氣息[28]。混菌發(fā)酵能賦予扇貝更豐富多樣的良好風味組成。

2.6 關(guān)鍵風味活性成分的貢獻評價

為進一步評價影響嗅覺的特征風味活性成分，基于可查閱到的感官閾值，綜合表1和圖5、圖6的分析，選取含量占比高、變化幅度大及主成分分析特征顯著的成分進行ROAV 計算，結(jié)果見表2。根據(jù)ROAV 法獲得3 種樣品中均以正辛醛的OAV 值最高，定義正辛醛的ROAV 值為100，所有成分均滿足0

表2 主要特征成分的ROAV 值Table 2 ROAV values of the main characteristic components

3 結(jié)論與討論

臭氧水被證實具有高效殺菌功效，扇貝解凍后經(jīng)臭氧處理可降低菌落總數(shù)約1 個數(shù)量級，減少48.4%的TVB-N，達到顯著減菌與保持原料鮮度的目的，然而，無脫除腥味的效果。扇貝揮發(fā)性風味成分以醇類、醛類和酮類為主，脫腥前、后的醛類和醇類物質(zhì)差異達極顯著水平，壬醛、正辛醛、庚醛、癸醛等低級飽和醛占比大且閾值低，是扇貝的主要腥味來源[30]，生物脫腥主要路徑是減少具有典型腥臭味的低分子碳鏈醛類腥味物質(zhì)，增加支鏈脂肪醛物質(zhì)和醇類。單菌發(fā)酵及復合發(fā)酵均有顯著的生物脫腥效果，分別新增成分20 個和22 個，R 組中正庚醇和1-壬醇、2，6-二甲基辛烷等優(yōu)勢成分在RJ 組中大幅減少甚至消失，這可能是因為這些成分是釀酒酵母JJ4 的代謝底物，或者某些代謝路徑受到不同菌屬間的互作效應。

主成分分析顯示，乳桿菌RP38 代謝產(chǎn)生的特征風味產(chǎn)物是正庚醇、紅沒藥醇、（2E）-2-壬醛、反-4-癸醛等，釀酒酵母JJ4 的代謝特征風味產(chǎn)物包括1-戊醇、2-甲基丁醇、2-亞甲基-環(huán)戊烷丙醇、2-已烯醛、苯甲醛、反-2-辛烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、2-十二烯醛、新鈴蘭醛、十六醛等，如采用混菌發(fā)酵能產(chǎn)生更復雜豐富的良好風味，實現(xiàn)脫腥增效。ROVA 分析顯示：正辛醛、（2E）-2-壬醛、壬醛、1-壬醇、庚醛、癸醛是扇貝脫腥前、后的主體風味活性成分，正庚醇、2-壬酮、（2Z）-2-庚烯醛和反-2-辛烯醛是生物脫腥后的重要修飾性風味成分，生物脫腥通過改變影響嗅覺的主體風味及修飾風味成分的含量和比例，實現(xiàn)減少腥味和掩蓋腥味的目的。

GC-MS 分析方法是現(xiàn)在最常見的揮發(fā)性風味物質(zhì)解析手段，然而，不同化合物在同一時間洗脫出來，無法有效分離揮發(fā)性物質(zhì)[31]。后續(xù)可借助現(xiàn)在興起的氣相色譜-嗅覺測量法（GC-O）和全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（GC×GC-TOFMS），前者能從大量揮發(fā)性物質(zhì)中挑選出氣味活性成分并衡量其貢獻，后者具有分辨率高、靈敏度高、峰容量大、分離速度快、定性定量準確性好等特點。