超高壓處理對(duì)扇貝界面閉殼肌結(jié)構(gòu)的影響

常 江，鞏 雪，孫智慧

（1 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 哈爾濱 150028 2 哈爾濱商業(yè)大學(xué)輕工學(xué)院 哈爾濱 150028 3 哈爾濱商業(yè)大學(xué)高教發(fā)展研究中心 哈爾濱 150028）

隨著人們健康意識(shí)的不斷增強(qiáng)，扇貝因高營養(yǎng)、低脂肪的特性而受到更多的青睞，在我國的沿海地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖。閉殼肌是扇貝主要的食用部分，又被稱為瑤柱，因富含琥珀酸和己氨酸等鮮味氨基酸而使其味道鮮美至極，又因其肉質(zhì)細(xì)嫩、色澤潔白、營養(yǎng)豐富，而被譽(yù)為“天下絕品”[1-3]。干制后的閉殼肌更被人們列為“八珍之一”。閉殼肌具有非常豐富的營養(yǎng)以及重要的食用價(jià)值，如何保證加工過程中閉殼肌的外觀完整、營養(yǎng)成分不丟失和不被破壞已成為生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵問題[4]。

超高壓技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品領(lǐng)域始于殺菌處理工序，研究人員發(fā)現(xiàn)在壓力升高的過程中，食品中像水分子一樣的小分子間距減小，而由蛋白質(zhì)等大分子構(gòu)成的成分結(jié)構(gòu)保持不變[5-7]。此時(shí)，在充填和滲透作用下，水分子會(huì)進(jìn)入大分子基團(tuán)內(nèi)部，并黏附在蛋白質(zhì)的氨基酸周邊，破壞蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中的非共價(jià)鍵[8-9]；而在卸壓過程中，壓力由高壓逐漸降為常壓，已變性的蛋白質(zhì)分子的分子鏈會(huì)伸展開來，使原有的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肌肉纖維和黏連組織松懈[10-11]，然而，超高壓處理只會(huì)改變大分子中的非共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，極大限度地保持了小分子的共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，也保護(hù)食品的天然品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值[12-13]。

扇貝以閉殼肌為主要肌肉組織，并直接與貝殼緊密連接，要實(shí)現(xiàn)扇貝的脫殼，就必須破壞扇貝貝殼與閉殼肌之間的連接關(guān)系，探究閉殼肌在超高壓作用下的結(jié)構(gòu)和特性的變化對(duì)扇貝脫殼有著十分重要的影響。閉殼肌的主要成分為肌原纖維蛋白和少量的膠原蛋白，在超高壓作用下，蛋白質(zhì)是否會(huì)發(fā)生變性，對(duì)扇貝閉殼肌與界面的連接強(qiáng)度有較大影響。利用拉曼光譜對(duì)經(jīng)過超高壓處理的扇貝閉殼肌中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以為閉殼肌在超高壓作用下的力學(xué)性能和深入分析扇貝超高壓脫殼機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料 以購于錦州渤海大學(xué)海鮮市場(chǎng)的扇貝為研究對(duì)象，受超高壓設(shè)備入口限制，扇貝的最長軸直徑約（95±5）mm。

1.1.2 試樣預(yù)處理 將扇貝表面清洗干凈，將扇貝放入注入淡鹽水的PE 包裝袋并封口后置入超高壓處理設(shè)備，施加300 MPa 的試驗(yàn)壓力分別保持1，2 min 和3 min 后取出，將扇貝貝殼與閉殼肌分離，取與貝殼連接界面位置的閉殼肌作為試樣進(jìn)行研究。

1.1.3 試劑及設(shè)備 2.5%戊二醛固定溶液，南京森貝伽生物科技有限公司；0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液，上海躍騰生物技術(shù)有限公司；乙醇，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

HPP.L2-600 型超高壓處理設(shè)備，天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；S-4800 型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；LabRAM HR Evolution拉曼光譜分析儀，法國HORIBA Jobin Yvon 公司；ALPHA1-2LD plus 冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拉曼光譜分析 將經(jīng)過超高壓處理并與貝殼分離后的界面閉殼肌縱切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的小塊，設(shè)置拉曼光譜分析儀的狹縫為200 μm，功率129 mW，激發(fā)波長為515.4 nm，曝光時(shí)間60 s，檢測(cè)的波長范圍為400～4 000 cm-1，根據(jù)測(cè)得數(shù)值繪制拉曼光譜，利用Labspec5.0 軟件進(jìn)行處理后再經(jīng)Alix 軟件進(jìn)行分峰擬合，計(jì)算得到蛋白質(zhì)中各二級(jí)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 掃描電鏡分析 將處理好的試樣用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液固定24 h，取出后用0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次10 min，然后分別用50%～100%的乙醇梯度洗脫，每次10 min，置入冷凍干燥機(jī)干燥后進(jìn)行離子漸射鍍金，在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下進(jìn)行觀察、取像[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)的變化

由圖1可見，共有11 個(gè)特征峰出現(xiàn)在扇貝界面閉殼肌的拉曼光譜圖上，這些特征峰主要集中500～1 800 cm-1的指紋圖譜區(qū)和2 800～3 050 cm-1的C-H 伸縮振動(dòng)區(qū)，通過分析扇貝界面閉殼肌在這兩段拉曼譜帶特征峰的峰形、峰強(qiáng)等參數(shù)的變化，可以得到不同超高壓處理?xiàng)l件對(duì)扇貝界面閉殼肌結(jié)構(gòu)的影響[15-17]。扇貝閉殼肌拉曼光譜特征譜帶的歸屬[18-20]如表1所示。

圖1 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of adductor muscle at scallop interface under different holding time

表1 扇貝閉殼肌拉曼光譜特征譜帶歸屬明細(xì)表Table 1 Detailed list of characteristic bands of Raman spectra of adductor muscle of scallop

根據(jù)圖1可以看出，不同保壓時(shí)間處理后的扇貝界面閉殼肌的拉曼光譜圖特征峰的形狀在2 min 時(shí)發(fā)生了非常明顯的變化，其它試驗(yàn)條件產(chǎn)生的拉曼光譜圖的形狀基本未發(fā)生變化，各特征峰的出峰位置也未發(fā)生大范圍偏移，然而峰強(qiáng)有了比較明顯的差別。在保壓時(shí)間為2 min 時(shí)，扇貝界面閉殼肌蛋的拉曼光譜比較陡峭，主要原因可能是在這個(gè)處理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)多肽鏈間的分子作用變化比較明顯，蛋白質(zhì)發(fā)生了較大程度的變性。然而，當(dāng)保壓時(shí)間延長至3 min 時(shí)，扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)的拉曼光譜圖和初始狀態(tài)比較接近，持續(xù)的超高壓力并沒有加劇蛋白質(zhì)的變性和結(jié)構(gòu)的松散程度，反而促進(jìn)了多肽鏈間氫鍵的形成，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重新變成了有序結(jié)構(gòu)[21-23]。

在圖1中，1 335 cm-1處酰胺Ⅲ帶和1 657 cm-1處酰胺Ⅰ帶的特征峰強(qiáng)度隨著壓力的升高而增大，這2 個(gè)位置集中體現(xiàn)著蛋白質(zhì)多肽鏈中的各種振動(dòng)伸縮狀態(tài)，說明在壓力作用下，蛋白質(zhì)分子間的化學(xué)鍵振動(dòng)作用比較明顯，形成了較多新的氫鍵；942 cm-1處的α-螺旋結(jié)構(gòu)特征峰在壓力作用下，峰強(qiáng)度明顯增大，這說明較長的保壓時(shí)間可以促進(jìn)氫鍵的產(chǎn)生，這可能是由于在卸壓過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生了可逆反應(yīng)，造成了氫鍵的重新形成，提高了α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量，使得這一位置的特征峰強(qiáng)度增大。

2.2 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

將得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)利用Labspec5.0 軟件進(jìn)行處理后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，利用Alix 計(jì)算軟件對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分峰處理，根據(jù)所得的峰面積計(jì)算出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[24]，分析得到了不同超高壓處理?xiàng)l件下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，如圖2所示。

圖2 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ區(qū)分峰擬合曲線Fig.2 Peak fitting curve of protein amide I region in the adductor muscle of scallop under different pressure holding time

根據(jù)圖2所示的各處理扇貝界面閉殼肌在酰胺Ⅰ區(qū)的分峰和迭代擬合曲線，通過對(duì)比蛋白質(zhì)中的α-螺旋（α-Helix）、β-折疊（β-Sheet）、β-轉(zhuǎn)角（β-Turn）和無規(guī)則卷曲（Random coil）所對(duì)應(yīng)的峰面積，得到了扇貝界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)所包含的各二級(jí)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在不同保壓時(shí)間的條件下，蛋白質(zhì)的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖3所示。

由圖3可以看出，當(dāng)試驗(yàn)壓力為300 MPa 時(shí)，保壓時(shí)間的延長使得蛋白質(zhì)的變性程度急劇增強(qiáng)，各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分發(fā)生了非常明顯的規(guī)律性變化。在保壓時(shí)間延長的過程中，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量大幅度減少、β-折疊結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量有所增加，這說明蛋白質(zhì)發(fā)生了比較明顯的變性，生物活性和水溶性也會(huì)隨之發(fā)生變化。對(duì)于α-螺旋結(jié)構(gòu)而言，在300 MPa 的試驗(yàn)壓力作用于扇貝閉殼肌的瞬間，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)就發(fā)生了變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量由初始的74.69%逐漸減小，當(dāng)試驗(yàn)壓力分別保持1，2 min 和3 min 時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量分別為69.22%，57.92%和52.81%，對(duì)應(yīng)初始數(shù)值分別減小了5.47%，16.77%和21.88%。由此可以看出，當(dāng)保壓時(shí)間為2 min 和3 min 時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)大幅度減少，說明在這個(gè)試驗(yàn)條件下，多肽鏈間的氫鍵穩(wěn)定性減弱，一部分螺旋結(jié)構(gòu)被伸長，轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)。當(dāng)保壓時(shí)間為1 min 時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增幅并不是很大，由初始的4.54%增大到了8.72%，提高了92.07%；然而當(dāng)保壓時(shí)間延長至3 min 時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量為21.30%，此試驗(yàn)條件將蛋白質(zhì)中的β-折疊結(jié)構(gòu)的含量提高了369.16%，也就是提高了近4 倍，說明蛋白質(zhì)被伸展的程度是比較大的，扇貝界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)由卷曲結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槠瑢咏Y(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性逐漸減弱，分子極性增大，水溶性增加。隨著保壓時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量雖有所增大，但增加的幅度較小，由初始的12.15%增加到了保壓時(shí)間為3 min 時(shí)的15.57%，增幅為28.15%，說明在300 MPa 的試驗(yàn)壓力下，一部分肽鏈骨架以180°回折從而改變了肽鏈的方向和空間構(gòu)象，使蛋白質(zhì)的生物性能產(chǎn)生了變化。蛋白質(zhì)中的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量也隨著保壓時(shí)間的延長而增多，未經(jīng)過處理的扇貝界面閉殼肌中的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量為8.62%，當(dāng)保壓時(shí)間為1 min 時(shí)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量增加到了9.05%，提高了4.99%；當(dāng)保壓時(shí)間延長至3 min 時(shí)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量比未處理扇貝蛋白質(zhì)中的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加了19.72%，說明在超高壓力的作用下，蛋白質(zhì)中越來越多的有序結(jié)構(gòu)被破壞而變成了松散的無序結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的變性程度加劇，喪失了部分生物性的功能。

圖3 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Changes of protein secondary structure in adductor muscle of scallop at different holding time

綜上所述，在300 MPa 的試驗(yàn)壓力下，保壓時(shí)間的延長會(huì)加劇蛋白質(zhì)的變性，使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低、β-折疊結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量均有增大，且保壓時(shí)間越長，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)越明顯。

2.3 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)側(cè)鏈構(gòu)象變化

2.3.1 不同保壓時(shí)間下酪氨酸殘基變化 蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的變化通常通過在830 cm-1和850 cm-1附近的吸收峰響度比值進(jìn)行衡量，圖4位不同保壓時(shí)間下扇貝閉殼肌蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的拉曼特征圖譜。

根據(jù)圖4所示的扇貝界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的拉曼光譜圖，在不同的試驗(yàn)條件下，830 cm-1和850 cm-1附近均出現(xiàn)特征峰。隨著保壓時(shí)間地延長，830 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度變化幅度較小，然而850 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度變化比較大，通過計(jì)算峰面積得到了這兩處位置所對(duì)應(yīng)的吸收峰強(qiáng)度，并通過吸收峰強(qiáng)度得到了I850/I830的比值，未處理扇貝界面位置閉殼肌蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基在850 cm-1和830 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度的比值為1.037，當(dāng)對(duì)試樣施加超高壓處理時(shí)，在保壓時(shí)間分別為1，2 min 和3 min 的條件下，I850/I830的比值分別為1.044，1.035，1.092，說明300 MPa 的試驗(yàn)壓力保持3 min 可使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有比較大的變化，原本包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的酪氨酸殘基在多肽鏈表面暴露，與氫鍵之間產(chǎn)生了相互作用。

圖4 不同保壓時(shí)間下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的變化Fig.4 Changes of tyrosine residues in adductor muscle protein at scallop interface under different holding time

2.3.2 不同保壓時(shí)間下色氨酸殘基變化 在拉曼特征圖譜中，755 cm-1附近的吸收峰表示的是蛋白質(zhì)色氨酸殘基的微環(huán)境狀態(tài)，吸收峰強(qiáng)度反映了色氨酸殘基的暴露狀態(tài)，根據(jù)不同保壓時(shí)間條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)的拉曼特征圖譜就可以得到色氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的吸收峰強(qiáng)度的變化，進(jìn)而了解色氨酸殘基的狀態(tài)。

在圖4中呈現(xiàn)了不同試驗(yàn)條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的吸收峰特性。隨著保壓時(shí)間的延長，拉曼光譜吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱，特別是在保壓時(shí)間1 min 時(shí)，減弱的程度最大，在保壓時(shí)間為2 min 和3 min 時(shí)又有所反彈，基本與未處理扇貝的色氨酸殘基特征圖譜形狀比較接近，這說明300 MPa 的超高壓力能夠引起色氨酸殘基的暴露，然而長時(shí)間保持這種較高的試驗(yàn)壓力會(huì)使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生微小的可逆變化，使色氨酸殘基的暴露狀態(tài)發(fā)生改變，這主要與蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和氫鍵間的作用力有關(guān)。在不同試驗(yàn)條件下，扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基暴露狀態(tài)改變并不是非常明顯，說明在超高壓力的作用下，色氨酸殘基暴露的程度比較低，并且受試驗(yàn)條件的影響不是很大。

2.3.3 不同保壓時(shí)間下蛋白質(zhì)C-H 鍵振動(dòng)作用變化 根據(jù)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)的拉曼光譜圖可以看到，在2 900 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)非常強(qiáng)烈且尖銳的吸收峰，這處吸收峰表征的是蛋白質(zhì)中C-H 鍵的伸縮振動(dòng)作用，包括了CH2的非對(duì)稱伸縮或者CH3的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，即蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸結(jié)構(gòu)及特性的直觀反映。另外在拉曼光譜圖的2 876 cm-1附近還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)比較微弱的次峰，這個(gè)次峰表征的是CH2的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)。扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)芳香族氨基酸反映在拉曼光譜圖中的吸收峰強(qiáng)度的變化與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)被拉伸引起的芳香氨基酸C-H 間疏水作用的變化有關(guān)，如果在拉曼光譜中表征C-H伸縮振動(dòng)所對(duì)應(yīng)的拉曼特征峰強(qiáng)度增大，說明羥基在極性微環(huán)境中的暴露程度變大。不同保壓時(shí)間下，蛋白質(zhì)芳香族氨基酸的拉曼光譜如圖5所示。

圖5 不同保壓時(shí)間條件下扇貝界面閉殼肌芳香族氨基酸的拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of aromatic amino acids in adductor muscle of scallop at different holding time

由圖5可以看出，在拉曼光譜的2 940 cm-1和2 880 cm-1處存在著2 個(gè)比較明顯的吸收峰，特別是2 940 cm-1處的吸收峰非常強(qiáng)烈且尖銳，隨著保壓時(shí)間的延長，這兩處的吸收峰強(qiáng)度均有一定程度的增強(qiáng)，特別是當(dāng)保壓時(shí)間延長到2 min 以上時(shí)，吸收峰強(qiáng)度增加的幅度非常明顯，說明較長時(shí)間保持300 MPa 的試驗(yàn)壓力可以引起蛋白質(zhì)分子間氫鍵的變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變得更加舒展，使得更多數(shù)量的芳香族氨基酸側(cè)鏈暴露在極性環(huán)境中，蛋白質(zhì)的疏水作用增強(qiáng)。當(dāng)保壓時(shí)間延長至3 min 時(shí)，2 940 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度有較小程度的減弱，這可能是由于蛋白質(zhì)長時(shí)間處于較高試驗(yàn)壓力環(huán)境中，當(dāng)壓力解除時(shí)出現(xiàn)了一定的還原作用，即原本被破壞了的氫鍵被修復(fù)，使得少量芳香族氨基酸側(cè)鏈重新埋藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，吸收峰強(qiáng)度減弱。

綜上所述，保壓時(shí)間的變化會(huì)引起芳香族氨基酸側(cè)鏈暴露狀態(tài)的改變。當(dāng)保壓時(shí)間為3 min時(shí)，會(huì)引起蛋白質(zhì)氫鍵的還原，使少量暴露狀態(tài)的芳香族氨基酸側(cè)鏈重新變?yōu)榘駹顟B(tài)。經(jīng)過分析，超高壓力保持2 min 時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞程度最大，芳香族氨基酸側(cè)鏈的暴露程度增加的也最明顯，拉曼光譜所對(duì)應(yīng)的吸收峰增強(qiáng)的幅度最大。

2.3.4 保壓時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)二硫鍵的影響 二硫鍵（S-S） 是連接不同肽鏈或同一肽鏈不同部分的化學(xué)鍵。它由含硫氨基酸形成，半胱氨酸被氧化成胱氨酸時(shí)即形成二硫鍵。蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用，蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性也隨著二硫鍵數(shù)目的增多而增大。當(dāng)超高壓處理?xiàng)l件變化時(shí)，二硫鍵的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化對(duì)明確蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有著比較重要的意義。

二硫鍵在拉曼光譜中對(duì)應(yīng)的特征吸收譜在500～550 cm-1區(qū)域內(nèi)，將這一波數(shù)區(qū)域的拉曼光譜圖進(jìn)行放大就可以得到不同試驗(yàn)條件下蛋白質(zhì)中二硫鍵的拉曼特征圖譜（見圖6）。

由圖6可知，未經(jīng)過處理的扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二硫鍵的特征峰出現(xiàn)在516 cm-1附近，當(dāng)保壓時(shí)間為1 min 時(shí)，特征峰位置基本未發(fā)生變化；當(dāng)保壓時(shí)間為2 min 時(shí)，特征峰位置向高頻方向移動(dòng)了9 cm，出現(xiàn)在了525 cm-1附近；當(dāng)保壓時(shí)間為3 min 時(shí)，吸收峰又向低頻方向發(fā)生了移動(dòng)，出現(xiàn)在了520 cm-1附近位置。二硫鍵特征峰位置的變化說明了其構(gòu)象的變化，當(dāng)保壓時(shí)間為2 min 時(shí)，特征峰移動(dòng)位移最大，已經(jīng)接近了二硫鍵扭式-扭式-反式（g-g-t）構(gòu)象的臨界區(qū)域，有向反式-扭式-反式（t-g-t）構(gòu)象轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)；然而當(dāng)保壓時(shí)間延長至3 min 時(shí)，這種趨勢(shì)即刻消失，吸收峰又重新出現(xiàn)在了扭式-扭式-反式（g-g-t）構(gòu)象的區(qū)域范圍內(nèi)，這說明長時(shí)間的保持較高的試驗(yàn)壓力會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生復(fù)原現(xiàn)象，原本被破壞了的結(jié)構(gòu)重新得到修復(fù)，也使得蛋白質(zhì)的生物特性得以保持。

圖6 不同保壓時(shí)間條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)二硫鍵的拉曼光譜圖Fig.6 Raman spectra of protein disulfide bond in adductor muscle of scallop at different holding time

2.4 超高壓處理對(duì)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)影響的掃描電鏡分析

為了研究不同超高壓處理?xiàng)l件對(duì)扇貝界面位置閉殼肌的影響，首先對(duì)未經(jīng)過處理的扇貝界面位置閉殼肌的形貌進(jìn)行了掃描，以便進(jìn)行對(duì)比分析，得到的扇貝界面位置閉殼肌的形貌如圖7所示。

圖7 不同保壓時(shí)間條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 Microstructure of the protein in the interface adductor muscle of scallop under different holding time

由圖7可知，未經(jīng)過處理的扇貝界面位置閉殼肌呈現(xiàn)出比較連續(xù)完整的纖維狀均勻分散，且纖維之間基本保持互相平行分布，形態(tài)具有一定的規(guī)律性。隨著保壓時(shí)間的延長，扇貝界面閉殼肌的蛋白質(zhì)纖維變得短而粗且分布越發(fā)不均勻。當(dāng)保壓時(shí)間延長至3 min 時(shí)，閉殼肌纖維原有的柱狀截面纖維變成了扁平的片狀截面，這可能是由于在試驗(yàn)壓力的作用下，閉殼肌蛋白質(zhì)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，氫鍵被打開，螺旋伸展轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu)。綜上，在不同保壓時(shí)間下蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生比較明顯的變性，彈性消失，空間構(gòu)象發(fā)生變化，增大了貝殼間的作用力，使得閉殼基與貝殼接觸面的拉力增大，引起了閉殼肌-貝殼界面的失效。

3 結(jié)論

通過分析300 MPa 的試驗(yàn)壓力下，不同保壓時(shí)間對(duì)扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸側(cè)鏈狀態(tài)及二硫鍵的構(gòu)象的影響，發(fā)現(xiàn)保壓時(shí)間比較長的超高壓處理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量均有增大，酪氨酸在極性環(huán)境中產(chǎn)生了由暴露狀態(tài)向包埋狀態(tài)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，色氨酸殘基的暴露狀態(tài)無明顯改變。當(dāng)保壓時(shí)間延長時(shí)，二硫鍵已經(jīng)到達(dá)構(gòu)象轉(zhuǎn)變邊界的趨勢(shì)得到了還原，使二硫鍵的結(jié)構(gòu)得到了修復(fù)；隨著保壓時(shí)間的延長，扇貝界面閉殼肌蛋白質(zhì)中扁平片層狀結(jié)構(gòu)逐漸增多，部分氫鍵被超高壓力破壞后形成了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；另外有部分氫鍵被打開后在相鄰肽鏈主鏈的N-H 和C=O 之間形成了新的有規(guī)則的氫鍵，蛋白質(zhì)中的β-折疊結(jié)構(gòu)增多，同時(shí)由于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的暴露程度也有所增強(qiáng)。在超高壓力的作用下，蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象都有了比較明顯的變化，這些結(jié)構(gòu)的變化和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變對(duì)閉殼肌的彈性、力學(xué)特性、與貝殼之間的結(jié)合強(qiáng)度及蛋白質(zhì)的水溶性都有著非常顯著的影響，這些力學(xué)及生物特性的變化也會(huì)影響扇貝超高壓脫殼效果，對(duì)深入研究扇貝脫殼起到了非常重要的作用。