LINC00511調(diào)控NF-κB通路對(duì)多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響

衛(wèi)玲 張燕 陳曉娟

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡女性最常見的內(nèi)分泌疾病，主要表現(xiàn)為雄激素分泌過多、竇卵泡生長(zhǎng)停滯和慢性炎癥，其嚴(yán)重影響患者的生理和心理健康[1]。PCOS進(jìn)展可能涉及遺傳、內(nèi)分泌、代謝等多種因素，但其確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚[2]。卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡中最重要的體細(xì)胞，可合成多種激素及生長(zhǎng)因子，參與調(diào)控卵泡發(fā)育，而顆粒細(xì)胞異常凋亡、炎性反應(yīng)可誘導(dǎo)PCOS病理進(jìn)程[3,4]。因此，研究卵巢顆粒細(xì)凋亡機(jī)制、抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)對(duì)指導(dǎo)PCOS的臨床治療至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是長(zhǎng)度>200 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，特定lncRNA的表達(dá)增加或缺失均可引起細(xì)胞基本活動(dòng)異常，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。LINC00511是近年發(fā)現(xiàn)的致癌lncRNA，有研究報(bào)道其表達(dá)上調(diào)與宮頸癌的惡性狀態(tài)有關(guān)，并可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。LINC00511還能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞干性和腫瘤形成，其高表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后不良[6]。然而，筆者查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)LINC00511在PCOS中的功能尚不清楚。本研究分析LINC00511對(duì)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞凋亡以及炎性因子表達(dá)的影響，以期為PCOS治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80購自上海賽百慷生物公司；人卵巢顆粒細(xì)胞KGN購自深圳華拓生物科公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒、TRIzol試劑購自大連takara公司；si-LINC00511、si-NC、pcDNA-LINC00511、pcDNA購自上海漢恒生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京碧波生物科技公司；人白細(xì)胞介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒、人IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒、兔源剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體(AC033)、兔源β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(AF5003)購自上海碧云天生物公司；磷酸化核因子κB(p-NF-κBp65，p-p65)單克隆抗體購自上海鈺博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：IOSE-80細(xì)胞、KGN細(xì)胞分別采用RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗，置于含95%空氣、5%二氧化碳、37℃、80%濕度的溫箱孵育。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶>90%時(shí)1∶3傳代。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)LINC00511表達(dá)：TRIzol法提取KGN細(xì)胞和IOSE-80細(xì)胞的總RNA，用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。LINC00511表達(dá)歸一化為β-actin，用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00511表達(dá)量。引物序列為L(zhǎng)INC00511上游5’-CTAACAAGAGGGTAAGTGTCAG-3’，LINC00511下游5’-AAGTCGACAACCCCATCGTTAC-3’；β-actin上游5’-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3’，β-actin下游5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：將對(duì)數(shù)期KGN細(xì)胞按2×104個(gè)/孔的密度接種24孔板，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)板底部的50%，用lipofectamine 2000將50 nmol/L si-LINC00511、50 nmol/L si-NC、2 μg pcDNA-LINC00511、2 μg pcDNA轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)LINC00511表達(dá)以驗(yàn)證抑制或過表達(dá)效果。轉(zhuǎn)染si-LINC00511、si-NC、pcDNA-LINC00511、pcDNA的KGN細(xì)胞分別記為si-LINC00511組、si-NC組、pcDNA-LINC00511組、pcDNA組；用20 ng/ml的TNF-α[7]孵育轉(zhuǎn)染si-LINC00511細(xì)胞24 h記為si-LINC00511+TNF-α組。每次檢測(cè)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：PBS洗滌各組KGN細(xì)胞2次，加入適量1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。吸取500 μl細(xì)胞懸液，依次加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl碘化丙啶，室溫避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀分析各組KGN細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-1β水平：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，3 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，參照商品試劑盒說明書步驟檢測(cè)IL-6和IL-1β表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3和p-p65蛋白表達(dá)：RIPA法提取各組KGN細(xì)胞總蛋白，每組取30 μg變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓100 V，時(shí)間100 min)，然后電轉(zhuǎn)(20 mA，時(shí)間12 h)至硝酸纖維素膜。加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再與Cleaved-caspase-3(1∶2 000稀釋)、β-actin(1∶3 000稀釋)、p-p65(1∶1 000稀釋)的一抗4℃搖床孵育10 h。隨后加入1∶2 500稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白。Image J軟件分析各條帶相對(duì)于β-actin條帶灰度值以表示其蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 DCOS卵巢顆粒細(xì)胞中LINC00511表達(dá)情況 與IOSE-802組細(xì)胞表達(dá)(1.00±0.10)比較，KGN細(xì)胞中LINC00511表達(dá)水平(2.41±0.04)顯著升高(P<0.05)。

2.2 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響 si-LINC00511組KGN細(xì)胞LINC00511表達(dá)水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染si-LINC00511可抑制LINC00511表達(dá)。pcDNA-LINC00511組KGN細(xì)胞LINC00511表達(dá)水平顯著高于pcDNA組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00511可促進(jìn)LINC00511表達(dá)。與si-NC組比較，si-LINC00511組KGN細(xì)胞Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、凋亡率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00511組KGN細(xì)胞Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響;A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表1 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響

2.3 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-LINC00511組KGN細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00511組KGN細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

2.4 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-LINC00511組KGN細(xì)胞p-p65蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00511組KGN細(xì)胞p-p65蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 Western Blot檢測(cè)p-p65蛋白的表達(dá)

表3 LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

2.5 TNF-α可以逆轉(zhuǎn)干擾LINC00511表達(dá)對(duì)KGN細(xì)胞凋亡以及炎性反應(yīng)的影響 與si-LINC00511組比較，si-LINC00511+TNF-α組KGN細(xì)胞LINC00511表達(dá)水平、p-p65蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、凋亡率顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 TNF-α可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B Western Blot檢測(cè)p-p65、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表4 TNF-α可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

3 討論

lncRNA是重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)異常與雄激素分泌、胰島素抵抗、卵泡發(fā)育、排卵等PCOS進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，可能是PCOS治療的潛在靶標(biāo)[8]。此外，研究證實(shí)lncRNA還可通過影響顆粒細(xì)胞增殖和凋亡在PCOS中發(fā)揮作用[9,10]。LINC00511已被報(bào)道在多種癌癥中發(fā)揮功能，研究顯示LINC00511表達(dá)水平與肝癌患者TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，LINC00511高表達(dá)提示肝癌患者預(yù)后不良[11]。胃癌中LINC00511表達(dá)增加，敲減LINC00511可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。LINC00511過表達(dá)可增強(qiáng)食管癌細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制細(xì)胞凋亡[13]。此外，敲減LINC00511通過調(diào)控細(xì)胞惡性行為對(duì)宮頸癌、腎透明細(xì)胞癌、肺腺癌進(jìn)展均有抑制作用[14，15]。本研究檢測(cè)到PCOS卵巢顆粒細(xì)胞KGN中LINC00511表達(dá)增加，提示LINC00511可能在PCOS進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)因子作用。為探討LINC00511對(duì)KGN細(xì)胞功能的影響，本研究分別轉(zhuǎn)染si-LINC00511、pcDNA-LINC00511至KGN細(xì)胞，結(jié)果顯示干擾LINC00511表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并上調(diào)促凋亡Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，而過表達(dá)則具有相反作用，這與之前研究報(bào)道[12]相似。

PCOS的發(fā)展通常伴隨著慢性炎癥，主要表現(xiàn)為IL-6、IL-1β等促炎因子產(chǎn)生增加，這些促炎因子的失調(diào)可能損害卵泡發(fā)育和成熟[16]。本研究顯示干擾LINC00511表達(dá)降低IL-6和IL-1β水平，而過表達(dá)LINC00511則增加IL-6和IL-1β水平，這表明干擾LINC00511表達(dá)可抑制KGN細(xì)胞炎性反應(yīng)。NF-κB是炎癥過程的關(guān)鍵介質(zhì)，正常情況下NF-κB可與細(xì)胞質(zhì)中的IκB形成無活性復(fù)合物，當(dāng)受到刺激后NF-κB易位到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)炎性因子基因表達(dá)。研究表明，加味芍藥甘草湯可抑制NF-κB通路活化來調(diào)節(jié)局PCOS大鼠卵巢部炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善卵巢功能[17]。此外，lncRNA類固醇受體RNA激活劑(SRA)對(duì)NF-κB通路亦具有調(diào)控功能，沉默lncRNA SRA能夠抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞促炎細(xì)胞因子分泌，減輕卵巢損傷[18]。本研究顯示，干擾LINC00511表達(dá)可抑制p65的磷酸化，過表達(dá)可促進(jìn)p65的磷酸化，表明干擾LINC00511表達(dá)可抑制NF-κB通路活化。有報(bào)道稱NF-κB可能通過激活Caspase-3表達(dá)來誘導(dǎo)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用TNF-α激活NF-κB通路可拮抗干擾LINC00511表達(dá)對(duì)KGN細(xì)胞凋亡、IL-6和IL-1β水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響，這進(jìn)一步表明干擾LINC00511通過抑制NF-κB通路參與調(diào)控PCOS卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。

綜上所述，干擾LINC00511通過抑制NF-κB通路從而誘導(dǎo)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，抑制炎性反應(yīng)，這些發(fā)現(xiàn)可能為PCOS提供潛在治療靶點(diǎn)。