基于OPLS-DA結合熵權TOPSIS的不同產(chǎn)地益智仁綜合質量評價△

崔婷，李焐儀，文珊，胡懿，彭杰寶，程鈺潔，徐杰

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

益智為姜科植物益智Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果實，主產(chǎn)于海南、廣東、廣西等地，為“四大南藥”之一，臨床常以除去雜質及外殼后的飲片益智仁入藥，其性溫，味辛，歸脾、腎經(jīng)，有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效，主要用于腎虛遺尿、小便頻數(shù)、遺精白濁、脾寒泄瀉、腹中冷痛、口多唾涎等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，益智仁有保護神經(jīng)、鎮(zhèn)靜抗炎、抗癌等作用[2]。中藥物質成分組成復雜多樣，以單一指標進行質量評價存在一定局限性。益智仁主要化學成分有揮發(fā)油類、黃酮類、甾醇類、萜類及二苯基庚烷類等[3-6]，而《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）益智仁含量測定項下僅規(guī)定了揮發(fā)油的限度，顯然不利于益智仁的質量控制。中藥指紋圖譜是中藥整體性化學成分的表征，可以較為全面地反映中藥化學成分信息。熵權逼近理想解排序法（TOPSIS）可將多指標轉化為一個綜合指標，降低分析過程中不同類型指標的干擾，也可避免人為賦權的主觀性，使分析結果更為客觀合理[7-8]。結合指紋圖譜與熵權TOPSIS對不同產(chǎn)地益智仁的質量進行綜合評價，結果更科學。同時，揮發(fā)油、浸出物、灰分、二氧化硫殘留量等也是影響益智仁質量的重要因素。因此，本研究建立益智仁超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜，并結合揮發(fā)油、浸出物、灰分、二氧化硫殘留量等指標，采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）和熵權TOPSIS 對不同產(chǎn)地益智仁的整體質量進行綜合評價，以期為益智仁質量控制及產(chǎn)地適應性研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-CLASS 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ME204E 型萬分之一天平、XP26 型百萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試藥

對照品原兒茶酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110809-201205，純度：99.9%）；圓柚酮對照品（深圳市麗景生物科技有限公司，批號：6-JTN-173-1，純度：100%）；色譜級甲醇、乙腈（默克股份有限公司）；色譜級磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

15 批益智仁均為自購飲片，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為姜科植物益智Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果實除去雜質及外殼后的飲片，樣品來源見表1。

表1 15批益智仁來源信息

2 方法與結果

2.1 UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，8%～16%A；8～18 min，16%A；18～32 min，16%～25%A；32～35 min，25%～35%A；35～44 min，35%A；44～60 min，35%～73%A；60～62 min，73%～8%A；62～65 min，8%A）；流速：0.35 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、圓柚酮對照品適量，加甲醇制成原兒茶酸、圓柚酮質量濃度分別為101.78、159.44 μg·mL-1的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取益智仁飲片粉末（過四號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 取2.1.3 項下供試品溶液（編號：HNS-S1），按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以13 號圓柚酮色譜峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間RSD＜0.15%，相對峰面積RSD＜0.43%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取2.1.3 項下供試品溶液（編號：HNS-S1），按2.1.1 項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，以13 號圓柚酮色譜峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間RSD＜0.12%，相對峰面積RSD＜0.60%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 分別精密稱取益智仁飲片粉末樣品（編號：HNS-S1）6 份，按2.1.3 項下方法制備供試品溶液，并按2.1.1 項下色譜條件進樣，以13 號圓柚酮色譜峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間RSD＜0.28%，相對峰面積RSD＜0.64%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立及色譜峰指認 取15 批益智仁飲片樣品，按2.1.3 項下方法制備供試品溶液，并按2.1.1 項下色譜條件進行測定，記錄各特征峰峰面積，并進行量化處理（峰面積/取樣量/60 000），結果見表2。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）對采集的色譜圖進行處理，以HNS-S1樣品的色譜圖為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正、全譜峰匹配生成共有指紋圖譜，同時采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜R，并建立益智仁飲片UPLC 指紋圖譜（圖1）。通過與混合對照品比對，指認出2個成分，分別為1號色譜峰（原兒茶酸）、13 號色譜峰（圓柚酮），對照圖譜見圖2。

圖1 15批不同產(chǎn)地益智仁飲片共有峰特征圖譜

圖2 益智仁飲片對照指紋圖譜及混合對照品UPLC圖

表2 15批益智仁飲片量化后各特征峰相對峰面積

2.1.8 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）分析軟件，以對照圖譜R為參照，進行整體相似度評價。結果顯示，益智仁不同批次間指紋圖譜基本相似，與對照圖譜一致性較好，15批益智仁飲片相似度依次為0.999、1.000、0.998、1.000、0.999、0.999、1.000、0.992、0.986、0.996、0.996、0.997、0.997、0.996、0.996，相似度均大于0.980，符合指紋圖譜的研究要求。

2.2 揮發(fā)油量的測定

按《中國藥典》2020 年版（通則2204 揮發(fā)油測定法）甲法[9]，對15 批益智仁中揮發(fā)油量進行測定，結果見表3。結果顯示，15 批益智仁揮發(fā)油質量分數(shù)為1.1%～1.6%，均大于1.0%，符合《中國藥典》2020年版益智仁項下?lián)]發(fā)油的限度要求。

2.3 浸出物測定

按《中國藥典》 2020 年版（通則2201 浸出物測定法）熱浸法[9]，對15 批益智仁醇溶性浸出物、水溶性浸出物進行測定，結果見表3。結果顯示，15 批益智仁醇溶性浸出物質量分數(shù)為4.19%～8.07%，均值為6.50%；水溶性浸出物質量分數(shù)為15.55%～18.17%，均值為17.01%。

表3 15批益智仁各項指標檢測結果

2.4 二氧化硫殘留量測定

按《中國藥典》2020 年版（通則2331 二氧化硫殘留量測定法）第二法[9]，對15 批益智仁二氧化硫殘留量進行測定，結果見表3。結果顯示，15 批益智仁二氧化硫殘留量為0～54 mg·kg-1，均小于150 mg·kg-1，符合《中國藥典》2020年版通則限度要求。

2.5 灰分測定

2.5.1 總灰分測定 按《中國藥典》2020 年版（通則2302灰分測定法）總灰分測定法[9]，對15批益智仁總灰分進行測定，結果見表3。結果顯示，15批益智仁總灰分質量分數(shù)為4.2%～8.5%，均小于8.5%，符合《中國藥典》2020年版益智項下總灰分的限度要求。

2.5.2 酸不溶性灰分測定 按《中國藥典》2020年版（通則2302 灰分測定法）酸不溶性灰分測定法[9]，對15 批益智仁酸不溶性灰分進行測定，結果見表3。結果顯示，15 批益智仁酸不溶性灰分質量分數(shù)為0.3%～1.5%，均小于1.5%，符合《中國藥典》2020年版益智項下酸不溶性灰分的限度要求。

2.6 OPLS-DA

以15 批益智仁飲片揮發(fā)油量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量及15 個特征峰峰面積量化值為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進行OPLS-DA，得分見圖3，不同產(chǎn)地益智仁飲片呈現(xiàn)一定分類聚集現(xiàn)象。OPLS-DA模型中變量重要性投影（VIP）值見圖4，VIP 值越大，即變量離X軸越遠，表明該指標對區(qū)分不同產(chǎn)地益智仁的貢獻越大，可能是區(qū)分不同產(chǎn)地益智仁的差異性成分。VIP 值＞1.0 的指標分別為峰13（原柚酮，2.670）、二氧化硫殘留量（1.808）、峰4（1.513）、峰14（1.485）、峰11（1.258），說明以上指標對不同產(chǎn)地益智仁的分類影響顯著。

圖3 15批益智仁飲片OPLS-DA得分

圖4 15批益智仁飲片各指標VIP分析（±s, n=15）

2.7 熵權TOPSIS分析

2.7.1 歸一化法處理 由于益智仁各指標成分存在量綱不一致的問題，因此需要根據(jù)公式（1）、（2）對數(shù)據(jù)進行同向歸一化處理，建立標準化決策矩陣[7-8]。峰1～15（峰1為原兒茶酸）、揮發(fā)油量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物為越大越優(yōu)型指標，采用公式（1）計算，總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量為越小越優(yōu)型指標；采用公式（2）計算，各指標歸一化處理結果見表4。

表4 益智仁飲片各指標同向歸一化處理結果

式中Rij代表不同指標類型，在公式（1）中為越大越優(yōu)型指標，在公式（2）中為越小越優(yōu)型指標，Xij代表樣本值i=（1，2，……，m）；指標值j=（1，2，……，n）所形成的多目標決策矩陣為Xij。

2.7.2 各指標成分權重的確定 熵權法是基于評價指標的信息熵大小與差異離散程度，指標數(shù)據(jù)離散程度越高熵值就越小，說明該指標提供的有效信息量就越大，對綜合評價的影響就越大。熵值法計算指標權重，可以決定各指標在樣品評價過程中的重要性，客觀地評價各個指標，排除主觀因素的影響[7-8]，按公式（3）、（4）計算各指標權重（wj），分別 為0.060、0.124、0.061、0.075、0.037、0.049、0.051、0.046、0.038、0.022、0.054、0.042、0.061、0.074、0.042、0.028、0.018、0.014、0.056、0.036、0.012。

式中Ej指第j項指標的熵值，wj指第j項指標的權重。

2.7.3 最優(yōu)與最劣方案的確定 將歸一化后數(shù)據(jù)與各指標的權重進行相乘，得加權決策矩陣Z[7-8]。根據(jù)加權矩陣結果得到最優(yōu)方案Z+=max（Z1，Z2，......Zm）；最劣方案Z-=min（Z1，Z2，......Zm）。

2.7.4 貼近度的計算及評價 根據(jù)最優(yōu)與最劣方案，按公式（5）計算15 批益智仁樣品與Z+和Z-的距離D+和D-，并根據(jù)距離D+和D-，按公式（6）計算評價對象與Z+的貼近度Ci[7-8]，并根據(jù)Ci的大小對評價對象進行排名。Ci在［0，1］內，越大表示該評價對象越好，反之，越差，見表5。

2.7.5 熵權TOPSIS 分析結果 本研究中的指標，以各特征峰峰面積、揮發(fā)油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量為高優(yōu)型指標，總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量為低優(yōu)型指標，由表5 可知，海南省瓊中縣（HNS-S1～S3）、海南省屯昌縣（HNS-S4～S6）、海南省萬寧市（HNS-S7～S9）、廣東省陽春市（GDS-S10～S12）、廣東省高州市（GDSS13～S15）平 均Ci分別為0.520、0.378、0.577、0.206、0.207，表明海南產(chǎn)益智仁綜合質量整體優(yōu)于廣東省，且以海南省萬寧市質量最優(yōu)，可作為優(yōu)良種質資源進一步研究與開發(fā)。

表5 15批益智仁飲片質量綜合評價結果

3 討論

本研究分別比較了不同柱溫（25、30、35 ℃）及流速（0.25、0.30、0.35 mL·min-1）條件下的指紋圖譜，結果表明柱溫為30 ℃，流速為0.35 mL·min-1時，樣品分離度較好，峰形較對稱，能夠滿足分析要求。同時以指紋圖譜峰峰形、分離度及共有峰總峰面積為評價指標，分別考察了不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇）及提取時間（15、30、45 min），結果表明，以70%甲醇為溶劑提取30 min時得到的峰形及分離度較好，共有峰總峰面積較大。

本研究建立了益智仁UPLC指紋圖譜，標定了15個共有峰，并對15批益智仁飲片的15個共有峰峰面積進行了測定，同時測定了15批飲片的揮發(fā)油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量、二氧化硫殘留量、總灰分和酸不溶性灰分。結果顯示，不同產(chǎn)地益智仁指紋圖譜共有峰總峰面積均值排序為海南省瓊中縣＞海南省萬寧市＞海南省屯昌縣＞廣東省陽春市＞廣東省高州市；揮發(fā)油量、水溶性浸出物量、醇溶性浸出物量、總灰分、酸不溶性灰分整體差異不大，海南省瓊中縣產(chǎn)益智仁二氧化硫殘留量明顯低于其他產(chǎn)區(qū)。

本研究采用OPLS-DA 分析各產(chǎn)地益智仁的質量差異，篩選影響益智仁質量的主要指標，峰13、峰4、峰14、峰11 的峰面積及二氧化硫殘留量可作為區(qū)分不同產(chǎn)地益智仁的主要指標；同時參照熵權TOPSIS 在中藥質量分析中的應用，建立益智仁飲片整體質量評價模型，對15 批益智仁進行質量評價。結果顯示，5 個不同產(chǎn)地益智仁樣品的Ci排序為海南省萬寧市＞海南省瓊中縣＞海南省屯昌縣＞廣東省高州市＞廣東省陽春市，與各指標評價結果基本一致。

本研究采用熵權TOPSIS對各指標進行客觀權重賦值，排除了主觀賦值對實驗結果的影響，提高分析結果的準確性與科學性，實現(xiàn)對益智仁整體質量的控制。該方法相對于傳統(tǒng)中藥材質量評價模式，結果更為科學、客觀，可應用于對不同產(chǎn)地益智藥材及其他中藥的質量評價及種質篩選。