PPP2R3A通過(guò)調(diào)控p53的表達(dá)促進(jìn)矽肺肺纖維化

史曉妮，楊少奇，成于思，巢 杰*

（1東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，南京 210009）

塵肺病是最常見(jiàn)的職業(yè)病之一［1-2］，而矽肺是塵肺病中發(fā)病率高、進(jìn)展快、病死率高的一種疾病，其特點(diǎn)是長(zhǎng)期吸入游離二氧化硅（SiO2）粉塵后肺纖維化進(jìn)行性加重［3］。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡釋清楚，且目前藥物治療效果不佳。蛋白磷酸酶2A（PP2A）因參與重要腫瘤信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程及細(xì)胞周期的調(diào)控而受到眾多學(xué)者的關(guān)注［4-5］。研究報(bào)道，在小鼠體內(nèi)特異性敲除ppp2r1a基因（編碼PP2A Aα亞基）會(huì)促進(jìn)炎癥的發(fā)生以及肝纖維化［6］。蛋白磷酸酶2A 調(diào)節(jié)亞基B″α（PPP2R3A）是PP2A 調(diào)節(jié)亞基B″中的一個(gè)亞基，不僅影響細(xì)胞周期，還參與不同生理和/或病理環(huán)境下的代謝和關(guān)鍵信號(hào)通路的調(diào)控，主要調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡，是細(xì)胞增殖的主要調(diào)節(jié)因子［7］。PP2A的A 和C 亞基普遍表達(dá)，但B 亞基的表達(dá)水平和細(xì)胞定位在不同細(xì)胞類(lèi)型和組織中存在顯著差異［8］，且PPP2R3A 在纖維化發(fā)生中的作用及其機(jī)制尚不明確，對(duì)于PPP2R3A 與纖維化關(guān)系的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究探討了PPP2R3A 在矽肺肺纖維化過(guò)程中的作用及機(jī)制，為防治矽肺提供新的思路。

1 材 料

1.1 試 劑

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 蛋白（TGF-β1，南京金斯瑞生物科技有限公司）；SiO2（美國(guó)Sigma 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；ACTB抗體（美國(guó)Santa 公司）；GAPDH、PPP2R3A、p53、Collagen1、ACTA2 抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；FN1 抗體（英國(guó)Affinity 公司）；RNA 提取液（日本Takara 公司）；Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Thermo 公司）；小干擾RNA（siRNA，上海吉瑪醫(yī)藥科技有限公司）；進(jìn)口封閉山羊血清（美國(guó)Life Technologies公司）；RIPA 裂解液（強(qiáng)）（上海碧云天生物科技有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海天能科技有限公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

激光共聚焦掃描顯微鏡FV 3000（日本Olympus 公司）；PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；高溫低速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；凝膠成像曝光儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 動(dòng) 物

清潔級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，體重20 ~ 25 g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，合格證編號(hào)SYXK（蘇）2016-0014。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞株

人成纖維細(xì)胞（HPF-a）株購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺的DMEM完全培養(yǎng)基中。

2 方 法

2.1 構(gòu)建小鼠矽肺肺纖維化模型

將小鼠置于恒溫和濕度適宜的條件下，自由飲食，光/暗循環(huán)12 h/12 h。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，手術(shù)暴露氣管，采用提前制備的SiO2懸浮液（250 mg/kg）氣管滴注，建立小鼠矽肺肺纖維化模型。對(duì)照組給予等量的無(wú)菌生理鹽水。造模56 d后取肺組織，用于做免疫熒光實(shí)驗(yàn)的肺組織首先灌注磷酸鹽緩沖液，用4%多聚甲醛固定、30%蔗糖溶液脫水，冰凍切片、染色。所有動(dòng)物手術(shù)均嚴(yán)格按照ARRIVE指南（動(dòng)物研究：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)告）進(jìn)行，動(dòng)物手術(shù)均經(jīng)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，符合有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

2.2 TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞構(gòu)建纖維化相關(guān)的體外模型

HPF-a 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，在含有5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ~ 4 d 進(jìn)行一次傳代擴(kuò)增。之后在含有細(xì)胞的培養(yǎng)板依次加入0，1，2.5，5，10 ng/mL的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 蛋白（TGF-β1），處理24 h后收集樣品，加裂解液提取蛋白，用Western blot 實(shí)驗(yàn)選取最適刺激濃度。之后用最適濃度處理細(xì)胞，按0，1，3，6，12，24 h 收集樣品，加細(xì)胞裂解液或RNA 提取液（Trizol）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平或mRNA表達(dá)變化。

2.3 天狼星紅染色

成功建立小鼠模型后，將肺組織取出，用4%多聚甲醛固定，將肺組織切片備用。用磷酸鹽緩沖液沖洗肺組織切片3次，加入天狼星紅染液在室溫孵育60 min，之后迅速用醋酸溶液沖洗2 次，用乙醇溶液漂洗，浸泡和脫水，中性樹(shù)膠封片，4 ℃保存，待顯微鏡觀察捕捉圖像。

2.4 RNA干擾

將細(xì)胞接種在24 孔板上，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%~80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，在一管無(wú)血清培養(yǎng)基中加入siRNA，另一管無(wú)血清培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染試劑，靜置5 min 后，將兩種溶液混合靜置15 min。將混合溶液加入孔板中，孵育至少12 h，然后更換完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)

使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)分析各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖，每組數(shù)據(jù)以±s表示，兩組獨(dú)立樣本之間采用t檢驗(yàn)，多組樣本間采用單因素方差分析，以P ＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；使用Image J 對(duì)Western blot條帶、劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié) 果

3.1 PPP2R3A在矽肺小鼠模型中表達(dá)增加

天狼星紅染色結(jié)果顯示，與生理鹽水（NS）組相比，矽肺模型（SiO2）組膠原明顯沉積，有典型的矽結(jié)節(jié)形成（圖1-A），Western blot 結(jié)果顯示，ACTA2 的蛋白水平在矽肺模型組顯著高于NS組（圖1-B，1-C），均可提示小鼠矽肺模型構(gòu)建成功。Western blot 結(jié)果顯示，PPP2R3A的蛋白水平在矽肺模型組顯著高于NS 組（圖1-D，1-E）。組織免疫熒光結(jié)果顯示，在矽肺模型組中，與纖維化相關(guān)的標(biāo)志物波形蛋白（vimentin）的水平增加，這提示肺中成纖維細(xì)胞增加，且PPP2R3A 與vimentin存在共定位，同時(shí)PPP2R3A的蛋白水平高于NS組，說(shuō)明在肺纖維化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，PPP2R3A 在成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加（圖1-F）。

3.2 PPP2R3A 在TGF-β1 處理的細(xì)胞模型中表達(dá)顯著上調(diào)

TGF-β1 可作為矽肺早期生物標(biāo)志物之一，在矽肺發(fā)生發(fā)展中有重要作用。采用TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞構(gòu)建體外模型，Western blot 結(jié)果顯示TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞，纖維化相關(guān)標(biāo)志物FN1和ACTA2 水平在5 ng/mL 時(shí)最高（圖2-A ~ 2-C）。在之后的體外實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1 的質(zhì)量濃度均采用5 ng/mL。TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞，Western blot 結(jié)果顯示纖維化相關(guān)標(biāo)志物FN1和ACTA2水平呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)（圖2-D ~ 2-F），纖維化相關(guān)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PPP2R3A 在矽肺模型組的蛋白水平高于NS 組。本研究進(jìn)一步探討在體外細(xì)胞模型中PPP2R3A的變化。TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞后，Western blot 結(jié)果顯示PPP2R3A的蛋白水平呈短暫性上升，6 h 達(dá)到峰值（圖3-A~3-B）。qRT-PCR 結(jié)果顯示Ppp2r3a表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性上升（圖3-C）。進(jìn)一步說(shuō)明了PPP2R3A的上升可能參與了矽肺纖維化的病理進(jìn)程。

3.3 PPP2R3A 介導(dǎo)了TGF-β1 誘導(dǎo)的HPF-a 細(xì)胞功能

TGF-β1 可以使HPF-a 細(xì)胞活力升高、遷移速度增加（圖4-A、4-E）。本研究進(jìn)一步探究敲減Ppp2r3a是否可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。首先采si-RNA敲 減Ppp2r3a，Western blot 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)siRNAPpp2r3a-1174敲減效率最高（圖4-B~4-C）；且敲減Ppp2r3a可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1 引起的細(xì)胞活力和遷移能力的增加（圖4-D~4-F）。

3.4 PPP2R3A介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)的FN1升高

FN1 和ACTA2 是纖維化發(fā)生的兩個(gè)標(biāo)志物，文獻(xiàn)報(bào)道FN1主要影響細(xì)胞遷移和增殖［9］，ACTA2是肌成纖維細(xì)胞最常用的分子標(biāo)志物，是細(xì)胞活化的標(biāo)志，同時(shí)影響細(xì)胞遷移和增殖［10-11］。敲減Ppp2r3a可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1 引起的FN1 的上升（圖5-A ~ 5-B），對(duì)ACTA2 的水平影響不顯著（圖5-A、5-C）。

3.5 PPP2R3A介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)的p53升高

通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，PPP2R3A 與p53信號(hào)通路的相關(guān)蛋白有聯(lián)系（圖6-A）。用5 ng/mL TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p53 的蛋白水平呈快速而短暫的上升（圖6-B ~ 6-C）。敲減Ppp2r3a可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1引起的p53的上升（圖6-D），并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)于p53/PUMA的表達(dá)介導(dǎo)矽肺的細(xì)胞活化和遷移的研究［12］，提示p53可能作為PPP2R3A的下游促進(jìn)矽肺纖維化進(jìn)程的重要分子，從而進(jìn)一步促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，加快矽肺纖維化進(jìn)程。

Figure 1 PPP2R3A expression was increased in silicosis mouse models

4 討 論

PPP2R3A 主要通過(guò)靶向細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和凋亡抑制因子調(diào)控細(xì)胞周期，是細(xì)胞增殖的主要調(diào)節(jié)因子［13］，這一蛋白與疾病的關(guān)系目前報(bào)道較少。結(jié)合本課題組前期環(huán)狀RNA 測(cè)序結(jié)果提示［14］，PPP2R3A 對(duì)應(yīng)的環(huán)狀RNA 發(fā)生變化，因此探究PPP2R3A 與肺纖維化的關(guān)系勢(shì)在必行。本研究采用課題組前期摸索的造模濃度和時(shí)間［15］，氣管滴注SiO2成功構(gòu)建小鼠矽肺肺纖維化模型，矽肺肺纖維化小鼠中PPP2R3A的水平顯著高于生理鹽水組，提示PPP2R3A 在肺纖維化發(fā)生中可能發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1 可致纖維化［16-17］，而在HPF-a 細(xì)胞中TGF-β1 是否也能致纖維化尚不明確。本研究采用TGF-β1 在HPF-a 細(xì)胞中成功構(gòu)建肺纖維化體外模型。TGF-β1 刺激HPF-a 細(xì)胞，PPP2R3A的蛋白水平呈短暫性的上升，F(xiàn)N1 和ACTA2 的蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性上升。本研究的結(jié)果提示PPP2R3A的蛋白變化在mRNA之前，可能由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯及翻譯后調(diào)控，分析可能是翻譯后調(diào)控或者是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的正向調(diào)節(jié)在此過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，后續(xù)將繼續(xù)對(duì)此進(jìn)行分析研究。本研究發(fā)現(xiàn)敲減Ppp2r3a之后，細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞活力降低，F(xiàn)N1 的蛋白水平下調(diào)，但是對(duì)ACTA2 的蛋白水平影響不顯著。FN1 主要影響細(xì)胞遷移和增殖［9］，研究結(jié)果與所報(bào)道的文獻(xiàn)一致。有趣的是，ACTA2 是細(xì)胞活化的標(biāo)志，敲減Ppp2r3a僅影響細(xì)胞活力而不影響ACTA2 的蛋白水平，說(shuō)明細(xì)胞活力可能不僅僅受ACTA2的影響，有待進(jìn)一步探究。

Figure 2 TGF-β1 stimulated HPF-a cells to construct in vitro model

Figure 3 Expression of PPP2R3A in cell models

新近的研究理念提出肺成纖維細(xì)胞的活化以及細(xì)胞凋亡的失衡是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［18］，p53信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖與活化在纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 刺激細(xì)胞后，p53 呈快速而短暫的上升，且敲減Ppp2r3a部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1引起的p53的蛋白水平上升，結(jié)合本課題組前期的研究，p53 可以促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖，使細(xì)胞活力增強(qiáng)［12］。因此，本研究證實(shí)了PPP2R3A 在肺纖維化中發(fā)揮作用與p53有關(guān)。

Figure 5 Effects of PPP2R3A on fibrosis markers FN1 and ACTA2

Figure 6 Effect of PPP2R3A on p53 protein level

綜上所述，在肺纖維化中，PPP2R3A 和p53 的水平均上調(diào)，這提示PPP2R3A 和p53 在纖維化的發(fā)生中發(fā)揮作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲減Ppp2r3a部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1 引起的細(xì)胞活力和遷移增加以及p53 的蛋白水平上升，提示PPP2R3A 可通過(guò)調(diào)控p53的表達(dá)促進(jìn)纖維化的發(fā)生，這為肺纖維化的防治提供了新的思路。

致謝：本研究得到東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院核心實(shí)驗(yàn)室的支持。