耳聾左慈丸在大鼠體內的藥代動力學

顧云雙，王 瑞，蘇 娜，彭 英，阿基業(yè)，王廣基，鄭亦文，孫建國*

（1江蘇省藥代動力學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院“中藥復雜組分PK-PD結合研究”創(chuàng)新單元，中國藥科大學，南京 210009；2新西蘭奧塔哥大學生物醫(yī)學學院藥理毒理學系，達尼丁 9054）

耳鳴是一種常見的耳部聽覺異常癥狀，其病因較多，機制復雜，目前臨床主要采用糖皮質激素類藥物［1］、擴血管藥物［2］、中藥［3］、局部麻醉藥［4］、針刺［5］、聲治療［6-7］和認知行為療法［8］等進行干預治療。耳聾左慈丸是治療腎虛型耳鳴耳聾的經典名方，由熟地黃、山茱萸（制）、山藥、茯苓、牡丹皮、竹葉柴胡、澤瀉、磁石（煅）八味藥材制成［9］。有研究表明，耳聾左慈丸對老年性耳鳴［10］、神經性耳鳴［11］、藥物所致耳鳴［12］等多種耳鳴均具有治療作用。但目前還沒有關于耳聾左慈丸的定量研究。毛蕊花糖苷和松果菊苷是耳聾左慈丸的君藥熟地黃中的主要成分，氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷來源于牡丹皮，為研究其在體內的代謝行為，建立了耳聾左慈丸中毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷的HPLC-MS/MS共檢測定量分析方法并進行方法學驗證。并以此方法評價大鼠血漿中4種物質的體內藥代動力學行為，為后續(xù)耳聾左慈丸的體內研究提供參考。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

毛蕊花糖苷對照品（批號：RH260383，分析對照品）購自羅恩化學試劑；苯甲酰芍藥苷對照品（批號：DST210410-053，HPLC≥98%）、氧化芍藥苷對照品（批號：DST201113-074，HPLC≥98%）、松果菊苷對照品（批號：DSTDS003801，HPLC≥98%）購自成都德思特生物技術有限公司；耳聾左慈丸原料藥粉末（批號：20210309）受贈于杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司；甲酸（色譜純）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲醇（梯度級）購自Merck 公司；水為超純水。

1.2 儀 器

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（含日本島津高效液相色譜系統(tǒng)LC-30AD；美國AB Sciex質譜系統(tǒng)API5000、電噴霧離子源及Analyst 1.5.1工作站）；Thermo Sorvall Biofuge Stratos 臺式低溫高速離心機（美國賽默飛世爾公司）；Eppendorf Mix-Mate 混勻小精靈、Eppendorf Minispin AG22331 臺式離心機（德國艾本德公司）；Vortex Mixer XW-80A渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Milli-Q Gradient A1 超純水機（美國密理博公司）。

1.3 動 物

健康SD 大鼠18 只，雌雄兼用，日齡42~62 d，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001。

2 方 法

2.1 標準溶液的配制

分別精密稱取毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、松果菊苷的標準品于1.5 mL 離心管中，用甲醇溶解得到質量濃度為10 mg/mL的4 份母液，將4 份母液分別用甲醇稀釋到1 mg/mL。分別從質量濃度為1 mg/mL的母液中取苯甲酰芍藥苷100 μL、松果菊苷100 μL、毛蕊花糖苷50 μL、氧化芍藥苷50 μL于同一離心管中，用甲醇補足至體積為1 mL，得到苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質量濃度為100 μg/mL、毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質量濃度為50 μg/mL的混合儲備液，取此混合儲備液100 μL，加入甲醇900 μL，混勻后得到苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質量濃度為10 μg/mL、毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質量濃度為5 μg/mL的工作液母液，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；水相（A）：超純水（含0.1%甲酸）；有機相（B）：甲醇；流速：0.4 mL/min；分析時間：7 min；梯度洗脫：0~0.5 min 5%B，0.5~1 min 5% ~ 85%B；1 ~ 4.5 min 85%B；4.5 ~ 5 min 85%~5%B；5~7 min 5%B。

2.3 質譜條件

選用電噴霧離子源，源參數(shù)如下：噴霧電壓（IS）-4 500 V，輔助氣1（GS1）55 Arb，輔助氣2（GS2）55 Arb，輔助氣加熱溫度（TEM）550 ℃，氣簾氣（CUR）40 Arb，碰撞氣（CAD）6 Pa。

在負離子、MRM 模式下檢測，設定Q0 入口電壓（EP）為-10 V，Q2出口電壓（CXP）為-15 V，用于定量的離子對及相關質譜信息見表1。

Table 1 Related parameters in MS analysis

2.4 血漿樣品處理方法

取大鼠血漿50 μL，加入含華法林內標（1 ng/mL）的甲醇溶液150 μL，振蕩5 min，在4 ℃條件下于18 000 r/min轉速離心5 min，轉移上清液130 μL至1.5 mL 離心管中，再次在4 ℃條件下以18 000 r/min轉速離心5 min，取上清液100 μL進樣分析。

2.5 方法學考證

2.5.1 專屬性和選擇性 取空白SD 大鼠，按12 mL/kg的劑量（相當于原藥6 g/kg劑量）灌胃給予耳聾左慈丸原藥粉末的生理鹽水懸濁液，采集給藥后5 min的眼眶血，置于含肝素的離心管中。在8 000 r/min的轉速下離心5 min，收集上清血漿。取血漿50 μL 按“2.4”項處理后進樣分析，得專屬性色譜圖（圖1）。

取6份來源不同的SD大鼠空白血漿50 μL，按照“2.4”項處理后進樣分析；取同樣6 份來源不同的SD 大鼠空白血漿45 μL，分別加入標曲定量下限處的工作液，得到含毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質量濃度0.5 ng/mL、苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質量濃度為1 ng/mL的加藥血漿，同樣按照“2.4”項處理后進樣分析。

2.5.2 定量下限 取若干份45 μL 大鼠空白血漿，加入工作液5 μL，配制毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質量濃度為0.5 ng/mL，苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質量濃度為1 ng/mL的含藥大鼠血漿，按“2.4”項下方法處理后進樣分析（n=5）。根據(jù)當日隨行標準曲線回算各樣品中物質濃度，并求算RSD 和RE。

2.5.3 標準曲線 取“2.1”項下的工作液母液，用甲醇逐級稀釋配制系列工作液。以空白SD 大鼠的血漿作為基質，按如下方法配制標準曲線（n=3）：取空白基質45 μL 若干份，依次分別加入工作液5 μL，渦旋30 s 混勻，可得到毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷質量濃度為50，20，10，5，2.5，1，0.5 ng/mL，松果菊苷和苯甲酰芍藥苷質量濃度為100，40，20，10，5，2，1 ng/mL的系列含藥血漿樣本，而后按照“2.4”項的方法處理樣品，進樣分析。以所測生物樣品中的待測物質和內標峰面積的比值為因變量（y），待測物質的血漿終濃度為自變量（x），用最小二乘法（權重系數(shù)為1/x2）進行回歸運算，得到各物質的回歸方程。

2.5.4 精密度和準確度 取若干份45 μL 大鼠空白血漿，加入工作液5 μL，配制毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質量濃度為0.5，0.8，8，40 ng/mL，松果菊苷、苯甲酰芍藥苷質量濃度為1，1.6，16，80 ng/mL的含藥血漿，平行5份，按“2.4”項下方法處理后進樣分析，連續(xù)測定3 個分析批，每個分析批間隔大于12 h，根據(jù)每批隨行血漿樣品標準曲線計算樣本中的物質濃度，求算批間、批內準確度和批間、批內精密度。

2.5.5 基質效應和提取回收率 取6份來源不同的空白SD 大鼠血漿，按如下3種方式進行處置：第1種處置方式，取若干份45 μL空白大鼠血漿，依次分別加入工作液5 μL，振蕩30 s，配制成毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷血漿終濃度分別為0.5 ng/mL、40.0 ng/mL，松果菊苷和苯甲酰芍藥苷血漿終濃度為1 ng/mL、80.0 ng/mL的含藥血漿樣本，加入3 倍體積的含內標的甲醇沉淀劑，按“2.4”項下處理進樣分析。第2 種處置方式，預先以3 倍體積甲醇沉淀劑對45 μL的空白大鼠血漿沉淀蛋白處理后，再加入工作液5 μL，振蕩混勻，隨后按“2.4”項下方法兩次離心處理后進樣分析；第3 種，用等量超純水代替大鼠空白血漿，依前述第2 種處置方式，平行操作并進樣分析。

進樣后第1 種處置方式的樣品平均峰面積與第2種處置方式的樣品平均峰面積相比，結果即為大鼠血漿中4 種物質的提取回收率；將第2 種處置方式的樣品平均峰面積與第3 種處置方法進樣后的樣品平均峰面積相比，得到大鼠血漿中4種物質的基質效應因子。同時還考察了基質因子的變異系數(shù)：用第2 種處置方式的4 種樣品和內標物質峰面積與第3種處置方式的樣品和內標峰面積做比，計算4 種樣品和內標物質的基質因子，然后用4 種樣品的基質因子與各自的內標基質因子相比，得到經內標歸一化后的基質因子。

2.5.6 穩(wěn)定性 取若干份空白SD大鼠血漿45 μL，加入工作液5 μL，振蕩30 s 混勻，配制成濃度Ⅰ（毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷終濃度為0.5 ng/mL、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷終濃度為1 ng/mL）和濃度Ⅱ（毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷終濃度為40 ng/mL、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷終濃度為80 ng/mL）的含藥血漿，平行5 份，將制備樣品分別按照不同處置方法進行處置：包括在室溫下放置8 h、超低溫（-60 ℃~-80 ℃）凍存30 d、超低溫冷凍（-60 ℃~-80 ℃）-解凍（37 ℃）3 次循環(huán)，每種考察條件下濃度Ⅰ和Ⅱ平行五份，按“2.4”項下處理進樣分析，根據(jù)當日隨行標準曲線對毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的含量進行回算。另外同樣制備濃度Ⅰ和濃度Ⅱ的含藥血漿，平行5 份，按照“2.4”項下處理，然后置于進樣盤中（4 ℃）放置，24 h 后進樣，并根據(jù)當日隨行標準曲線回算各物質含量。

2.6 耳聾左慈丸單次給藥后的藥代動力學研究

2.6.1 制備給藥提取液 稱取耳聾左慈丸粉末80 g，加入超純水150 mL 及無水乙醇10 mL，超聲提取2 h，提取后在3 000 r/min 下離心10 min，取上清液于18 000 r/min 再次離心5 min，轉移出上清液用于給藥。另取上清液1 mL 使用0.22 μm 濾膜過濾，用超純水稀釋100倍，取出稀釋后的樣品50 μL于1.5 mL離心管中，加入含華法林內標（1 ng/mL）的甲醇沉淀劑150 μL，振蕩5 min后，于18 000 r/min離心5 min，取出上清液130 μL，再次在18 000 r/min下離心5 min，取上清液100 μL 進樣分析，根據(jù)隨行標準曲線計算各物質濃度。

2.6.2 實驗方案 取空白雄性SD 大鼠4 只，按20 mL/kg（相當于原藥10 g/kg 劑量）灌胃給予上述提取液。實驗前12 h 禁食不禁水，采集給藥后0、5、10、20、40 min，及1、2、4、6、8 h的大鼠眼眶靜脈血，置于含肝素的離心管中。在8 000 r/min的轉速下離心5 min，收集上清血漿，按“2.4”項方法處理后進樣分析，根據(jù)隨行標曲進行濃度計算。將濃度結果導入Phoenix WinNonlin8.3 軟件進行非房室模型擬合，求算藥代動力學參數(shù)。

3 結 果

3.1 專屬性和選擇性

在空白基質中各物質的響應均低于空白血漿中各物質定量下限的20%，并低于內標響應的5%，表明4 種物質在該方法下的保留情況不受血漿中內源物質的影響。毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷和內標華法林的保留時間分別是1.93、1.87、1.86、2.08、2.27 min。幾種物質的特征性色譜圖如圖1所示。

Figure 1 Characteristic chromatograms of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside,benzoylpaeoniflorin and warfarin(IS)

3.2 定量下限

根據(jù)隨行標曲計算濃度，計算RSD 和RE（相對偏差），毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷在定量下限處的RSD 依次為3.8%、5.5%、4.3%、7.0%；RE 依 次 為5.8%、5.7%、-1.5%、6.9%。符合生物樣本分析的相關標準。

3.3 標準曲線

毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷的標準曲線如表2所示，結果表明各物質在線性范圍內的線性良好（r＞0.99），可滿足于后續(xù)在此范圍內的物質含量測定要求。

Table 2 Standard curves and linear ranges of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma

3.4 精密度和準確度

在定量下限和高、中、低濃度質控濃度下，毛蕊花糖苷的批內精密度RSD 在2.0% ~ 5.7%之間，批間精密度為6.3% ~ 7.2%；氧化芍藥苷的批內精密度為3.3% ~ 7.0%，批間精密度為6.2% ~9.0%；松果菊苷的批內精密度為3.9%~6.6%，批間精密度為6.1%~8.0%；苯甲酰芍藥苷的批內精密度為2.2%~5.7%，批間精密度為5.0%~8.5%間。4 種物質的批內、批間準確度也都在標示值的±15%之內，表明該方法具有良好的重復性和準確性，符合生物樣本測定相關原則。

Table 3 Accuracies and precisions of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma

3.5 基質效應與提取回收率

在高、低兩個濃度下，毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的平均提取回收率內標歸一化后的基質因子列于表4。結果表明這4 種物質的基質效應的RSD 均小于15%，基質效應和提取回收率均符合要求。

Table 4 Matrix effects and extraction recoveries of verbascoside, oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma

3.6 穩(wěn)定性

在考察的幾種條件下，毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的低、高兩種濃度的RE 均小于15%，說明在室溫放置8 h、進樣盤放置24 h、以及超低溫-80 ℃凍存30 d 和3 次凍存凍融（-80 ℃~37 ℃）的條件下，4 種物質都能夠保持足夠的儲存穩(wěn)定性，可以滿足生物樣本測定的要求，數(shù)據(jù)結果如表5所示。

3.7 單次給藥后的藥代動力學

將用于給藥的提取液進樣測定了濃度，其中毛蕊花糖苷質量濃度為32 μg/mL，氧化芍藥苷質量濃度為46.3 μg/mL，松果菊苷質量濃度為23.3 μg/mL，苯甲酰芍藥苷質量濃度為23.8 μg/mL。按照20 mL/kg的給藥劑量換算后毛蕊花糖苷的實際給藥濃度為640 μg/kg，氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的實際給藥濃度分別為926、466 和476 μg/kg。

Table 5 Stabilities of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma(± s,n = 5)

Table 5 Stabilities of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma(± s,n = 5)

Compd.Verbascoside Oxypaeoniflorin Echinacoside Benzoylpaeonifl-orin c/（ng/mL）0.8 40 0.8 40 1.6 80 1.6 80 Room temperature 8 h RSD/%5.2 3.2 5.8 3.4 4.6 2.8 2.3 2.6 RE/%-3.0-6.0 5.3-2.4-1.0-6.1 0.6-2.0 Automatic(24 h)RSD/%4.1 2.8 6.3 3.0 4.3 4.9 9.2 2.3 RE/%-3.1-0.8 2.6-1.4-2.3-0.4 1.9 5.8 Freeze(-70°C for 30 d)RSD/%5.1 3.4 4.9 2.4 7.3 4.3 8.0 1.8 RE/%0.3 1.7 7.6-2.6 4.4 4.5 0.5 0.2 Freeze-thaw(three times)RSD/%2.0 3.2 3.1 1.4 5.5 4.5 5.2 2.5 RE/%1.0 1.3 10.1-0.9 0.4 1.9 5.0 0.6

通過軟件計算得到4 種物質在大鼠體內的藥代動力學參數(shù)，結果如表6所示。在給予耳聾左慈丸提取液后，氧化芍藥苷在大鼠體內濃度較高，cmax1為（24.40 ± 4.78）ng/mL，cmax2為（22.50 ±2.70）ng/mL；毛蕊花糖苷和松果菊苷在大鼠體內消除較快，半衰期在1.8 h 左右，苯甲酰芍藥苷的半衰期在3 h 左右。并且繪制了4 種物質的血藥濃度-時間曲線，如圖2 所示，毛蕊花糖苷在給藥后6 min 左右時達峰，而氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷均在給藥后出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。

Table 6 Pharmacokinetic parameters of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rats after single-dose i.g administration(± s,n = 4)

Table 6 Pharmacokinetic parameters of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rats after single-dose i.g administration(± s,n = 4)

Parameter AUC(0-t)/(ng/mL·h)AUC(0-∞)/(ng/mL·h)cmax1/(ng/mL)cmax2/(ng/mL)tmax1/h tmax2/h t1/2z/h CLz/F(L/h/kg)Vz/F(L/kg)14.06±2.24 15.55±3.46 6.14±1.92/0.104±0.036/1.88±0.52 42.91±7.91 111.36±17.87 88.32±19.30 111.66±14.19 24.40±4.78 22.50±2.70 0.083 0.667 2.63±0.69 8.42±0.99 31.55±8.06 18.53±2.53 21.48±2.81 4.71±1.88 3.92±1.00 0.083 0.667 1.82±0.15 22.07±2.87 74.26±26.31 11.88±3.11 15.32±1.89 4.15±1.84 3.51±2.91 0.083 0.667 3.04±1.37 31.54±3.79 142.63±78.63 Verbascoside Oxypaeoniflorin Echinacoside Benzoylpaeoniflorin

4 討 論

4.1 耳聾左慈丸的提取方法

中藥具有服用量大的特點，在動物給藥時，直接研磨灌胃困難難以在合適的給藥體積內保證給藥劑量，需要進行提取，目前耳聾左慈丸常用的的提取方式是高溫煎煮［13］，但是高溫會影響物質穩(wěn)定性，導致提取后成分的組成和含量與原藥出現(xiàn)差異。在本實驗中，采用水醇混合超聲提取，溶解范圍更廣泛，并且能保證某些熱不穩(wěn)定組分的含量不發(fā)生明顯變化，使提取液的成分組成更接近原藥的成分組成。

4.2 藥代動力學行為分析

體內實驗結果表明，大鼠在耳聾左慈丸提取液灌胃給藥后，毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷均能夠在體內迅速分布并進行快速消除，與文獻報道相符［14-17］。與其他3 種物質相比，氧化芍藥苷在大鼠血中的濃度較高。此外，氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷在給藥后都出現(xiàn)了雙峰，3 種物質在給藥后5 min 就出現(xiàn)了1次吸收峰，隨后在40 min左右出現(xiàn)第2次吸收峰，腸肝循環(huán)導致雙峰需要更長時間，所以腸肝循環(huán)引起雙峰的可能性不大。提取液在給藥時為濁液，所以存在部分藥物溶解在溶液中的現(xiàn)象，而這部分溶解形式的藥物更易通過胃快速吸收，產生1 次快速吸收相。因此推測與其在體內的吸收過程有關，由于吸收不均勻出現(xiàn)雙峰。相關研究表明［18-19］在灌胃給予氧化芍藥苷和松果菊苷的溶液時，均未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，而Zhou等［20］在進行苯甲酰芍藥苷的藥代動力學研究時灌胃給予了苯甲酰芍藥苷的混懸液，其中部分藥物溶解，部分未溶解，給藥后也出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，并且第1 個吸收峰也是在給藥5 min 后出現(xiàn)的，與本實驗結果相似，所以推測這種雙峰現(xiàn)象是由于部分溶解的分子形式在灌胃后首先被胃迅速吸收，造成了5 min 處的第1 個吸收峰，而第2 個吸收峰則是由未溶解部分的吸收產生的。

Figure 2 Plasma concentration-time curves of verbascoside(A),oxypaeoniflorin(B),echinacoside(C)and benzoylpaeoniflorin(D)(± s,n = 4 )

5 結 論

耳聾左慈丸是治療耳聾耳鳴的經典方，目前還未有耳聾左慈丸在體內的定量研究結果報道。本實驗中對耳聾左慈丸進行了提取，并且首次建立了毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷這4種物質在大鼠血漿中的LC-MS/MS共檢測方法并用于評價耳聾左慈丸提取液在大鼠體內的藥代動力學行為。此次實驗結果可用于指導在相同的給藥劑量下灌胃給予耳聾左慈丸提取液后毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷在大鼠體內的藥代動力學行為，但實驗中毛蕊花糖苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的濃度較低，可考慮在保證物質穩(wěn)定性的前提下進一步優(yōu)化提取方法，提高提取效率。