蝎毒素BmK M2的分離鑒定及其電生理活性研究

桑 明，陳永根，周 謙，曹 鵬，2*，盧悟廣，2**

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023）

東亞鉗蝎（Buthus martensiiKarsch，BmK）作為傳統(tǒng)醫(yī)藥用于腦卒中、癲癇、抽搐等疾病的治療已經(jīng)有幾千年的歷史［1-2］。研究表明，蝎毒的活性物質(zhì)主要是作用于Na+、K+、Cl-、Ca2+離子通道的毒素多肽。其中短鏈毒素由29 ~ 39 個(gè)氨基酸殘基組成，含有3 對(duì)或4 對(duì)二硫鍵，主要作用于K+通道或者Cl-通道。作用于Na+離子通道的長鏈毒素主要由60~70 個(gè)氨基酸殘基組成，并含有4 對(duì)二硫鍵。這些靶向離子通道的毒素不僅可以作為藥物先導(dǎo)分子進(jìn)入深入研究，還可以作為新型離子通道探針用于離子通道結(jié)構(gòu)功能的研究。因此，分離純化這些毒素多肽，并解析其結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。

電壓門控Na+通道在傷害（疼痛）刺激的傳導(dǎo)和疼痛信息的傳遞中起著重要作用。傷害感受器是分布在周圍神經(jīng)中的感覺神經(jīng)元，其主要表達(dá)Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8 和Nav1.9 通道亞型［3-5］。其中每個(gè)通道亞型在疼痛信號(hào)傳導(dǎo)中的作用由其生理特性和表達(dá)模式?jīng)Q定［3］。有研究表明，在特異性敲除小鼠傷害性感受器Nav1.7 后，小鼠對(duì)機(jī)械痛和熱痛的敏感性均有不同程度的下降［6］。另有臨床研究表明，患有慢性神經(jīng)性疼痛患者的受損部位Nav1.8 表達(dá)過多［7］，說明Nav1.7 和Nav1.8 與痛覺感受及病理性疼痛有著密切關(guān)聯(lián)。因此開發(fā)針對(duì)Nav1.7 和Nav1.8 通道的探針或者抑制劑，對(duì)于研究其結(jié)構(gòu)與功能并開發(fā)靶向藥物具有重要的意義。但是，要鑒定出針對(duì)Nav1.7 或Nav1.8 具有強(qiáng)抑制作用而不影響其他Na+通道亞型的化合物一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

截至目前，東亞鉗蝎蝎毒中已報(bào)道有至少34條α毒素或者同源多肽［8］，但是僅有13條α毒素的結(jié)構(gòu)和功能得到了電生理和生化試驗(yàn)的確認(rèn)［9］。尚有許多毒素沒有被發(fā)現(xiàn)或沒有被進(jìn)行深入研究。例如α毒素作用的Na+通道亞型、選擇性、作用機(jī)制等等。在已鑒定的東亞鉗蝎毒素中，α 毒素BmK I 可通過激活Nav1.8 產(chǎn)生痛覺超敏［10］。BmK AGAP 可通過抑制Nav1.7 和Nav1.8 產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果［11］。這些研究表明，由于東亞鉗蝎毒素的鎮(zhèn)痛作用，其毒素成分以及結(jié)構(gòu)功能可能不同于其他種類蝎子來源的多肽毒素，因此值得進(jìn)一步挖掘。

最近的研究表明，東亞鉗蝎粗毒可以通過直接增強(qiáng)Nav1.7的活性產(chǎn)生致痛作用［12］。該研究表明東亞鉗蝎毒液可以作為Nav1.7的探針庫用于新型Nav1.7調(diào)節(jié)劑的篩選［12］。本研究從東亞鉗蝎蝎毒中分離鑒定了一種Na+通道毒素，其序列與基于晶體學(xué)分析鑒定的BmK M2序列一致［13］，并且與已報(bào)道的多條α 毒素具有較高的序列一致性。通過電生理測(cè)試和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BmK M2 可通過調(diào)控Nav1.7 產(chǎn)生致痛活性。同時(shí)BmK M2 也可作為一種新型Na+通道探針，用于Na+通道結(jié)構(gòu)與功能研究和靶向Na+通道的鎮(zhèn)痛藥物研究。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

SephadexG-50（美國GE Healthcare Life Sciences公司）；三氟乙酸（TFA，色譜級(jí)，上海羅恩試劑）；乙腈（CAN，德國Merck Drugs&Biotechnology 公司）；KCl、MgCl2、CaCl2（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑（L3000150，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；生物技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)試劑盒（TO-760R00）、激光生物實(shí)驗(yàn)室MALDI校準(zhǔn)套件（TO-724R00）、蛋白純化回收試劑盒（KLANG，KL121208-50）（日本島津公司）；GpTx-1（一種Nav1.7 特異性抑制劑）由北京大學(xué)深圳研究院陳超博士贈(zèng)送。其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

AKTA 蛋白純化系統(tǒng)、XK26-1000 色譜柱（美國GE Healthcare Life Sciences 公司）；Milli-Q Biocel超純水儀（美國Millipore 公司）；Nanodrop 1000 紫外可見光分光光度計(jì)（美國Thermo 公司）；C18反向色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司）；E2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；落地式高速離心機(jī)（德國BeckmanCoulter 公司）；pH 計(jì)（上海儀邁儀器科技有限公司）；Olympus 倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；MF-830 電極拋光儀（日本Narishige 公司）；火拋光電極（美國World Precision Instruments 公司）；水平電極拉制儀P97、右手自動(dòng)微操M(fèi)P-225（美國Sutter 公司）；數(shù)模轉(zhuǎn)換器Digidata 1550、單探頭超低噪聲膜片鉗放大器Axon 200B（美國Molecular Devices 公司）；ALA-VM8 全自動(dòng)灌流系統(tǒng)（美國ALA 公司）；Von frey 電子機(jī)械痛檢測(cè)儀（美國IITC公司）。

1.3 質(zhì)粒、細(xì)胞與動(dòng)物

大鼠Nav1.8 表達(dá)質(zhì)粒（rNav1.8）由上海生命科學(xué)研究所鮑嵐研究員贈(zèng)送；東亞鉗蝎（產(chǎn)地陜西，經(jīng)南京師范大學(xué)戴建華教授鑒定為東亞鉗蝎）；人Na+通道Nav1.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株hNav1.7-HEK293 Cell Line 及Nav1.8 基 因敲 除小 鼠（Nav1.8 KO mice）由美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Stephen G.Waxman教授贈(zèng)送；野生型C57BL/6J 小鼠，雄性，6 周齡，體重（20±2）g，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0013；鼠神經(jīng)母細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞ND7/23細(xì)胞購于寧波明舟生物科技有限公司；rNav1.8-ND7/23 細(xì)胞利用LipofectamineTM3000 將rNav1.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ND7/23 細(xì)胞獲得。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 BmK M2的分離純化

利用電刺激法提取東亞鉗蝎毒液，具體方法參考文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。然后稱取東亞鉗蝎粗毒干粉1 g 于10 mL的玻璃樣本瓶中，加入PBS 8 mL，4 ℃溶解過夜，使其充分溶解。低溫（4 ℃）12 000 r/min離心30 min，然后用0.22 μm 濾膜過濾。使用PBS平衡SephadexG-50 凝膠過濾色譜柱，然后取濾液上樣，同時(shí)打開HPLC 系統(tǒng)紫外檢測(cè)器，在215 和280 nm 處測(cè)定吸收度，流速為0.3 mL/min，上樣完成后用PBS 進(jìn)行洗脫，利用自動(dòng)收集裝置收集各峰。將SephadexG-50 收集到的蝎毒組分P12 加入終濃度為0.2%海藻糖，進(jìn)行凍干。凍干粉加入去離子水重新溶解至終濃度為5 g/L，低溫（4 ℃）12 000 r/min 離心30 min，上清液用0.22 μm 濾膜過濾。然后使用HPLC 系統(tǒng)及C18反相HPLC 柱對(duì)過濾后的樣品進(jìn)行分離。在215 nm 波長處測(cè)定吸收度。蛋白分離使用的流動(dòng)相是A（0.1%的三氟乙酸水溶液）和B（0.1%的三氟乙酸乙腈溶液），流速為1 mL/min。洗脫程序如下：0 ~ 5 min，95% ~90%，A；5~85 min，90% ~60%，A；85~85.1 min，60% ~ 95% A。分離得到的蛋白多肽峰凍干后存于-80 ℃?zhèn)溆?。SephadexG-50 分子篩圖譜參考本課題組前期的工作［14］。

2.2 多肽指紋圖譜和氨基酸測(cè)序分析

將經(jīng)HPLC 純化后凍干的P12 用去離子水溶解后進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，之后將目的蛋白條帶切割，然后利用蛋白回收試劑盒回收多肽。多肽樣品利用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量，然后采用島津生物技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行還原、烷基化、酶解，最后酶解肽段經(jīng)MonoTip C18脫鹽后濃縮上樣，并利用島津激光生物實(shí)驗(yàn)室MALDI校準(zhǔn)套件進(jìn)行校正。肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)（PMF）用蛋白組學(xué)質(zhì)譜分析軟件Mascot上傳至蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT 進(jìn)行肽段序列的分析，完成蛋白鑒定。N末端氨基酸測(cè)序參考本課題組前期工作進(jìn)行［15］。

2.3 BmK M2的同源模建

同源模建參考使用Accelrys Discovery Studio 4.1 軟件，并利用BmK M1 的。晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1SN1）作為模板對(duì)BmK M2 進(jìn)行模型構(gòu)建。然后對(duì)最佳同源模型進(jìn)行MD 模擬，在AMBER 12 軟件中優(yōu)化得到模擬最佳的3D 結(jié)構(gòu)，詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)［16］。

2.4 電生理活性檢測(cè)

BmK M2的電生理活性在hNav1.7-HEK293及rNav1.8-ND7/23 細(xì)胞上檢測(cè)。所使用的細(xì)胞浴液及電極內(nèi)液配方參考本課題組前期工作配制［12］。使用前加入河豚毒素（TTX，300 nmol/L）封閉ND7/23 細(xì)胞內(nèi)源性Na 電流。使用Axopatch 200B 放大器在全細(xì)胞電壓鉗模式設(shè)置中記錄電壓門控Na+通道電流。拉制電極入水電阻控制在0.8 ~ 1.5 MΩ。負(fù)壓形成高阻封接破膜后，串聯(lián)電阻補(bǔ)償85% ~90%消除電容瞬變后開始記錄。補(bǔ)償后的細(xì)胞穩(wěn)定5 min 后，使用Clampex 10.5 軟件，設(shè)置并運(yùn)行刺激方案。對(duì)于Nav1.7 電流-電壓實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞保持在-120 mV 并逐步通過一系列步階電壓刺激（-80 至+60 mV，以5 mV 為增量，每個(gè)增量持續(xù)100 ms）。以內(nèi)向電流峰值（I）和步階電壓（V）擬合I-V曲線。進(jìn)一步確定每個(gè)細(xì)胞的反轉(zhuǎn)電位（Vrev），并通過使用方程G=I/（V-Vrev）計(jì)算每個(gè)測(cè)試步階電位（V）對(duì)應(yīng)的電導(dǎo)（G）。激活曲線以每個(gè)脈沖電壓的電導(dǎo)和脈沖電壓為變量，通過玻爾茲曼方程擬合得到：

其中Gmax是最大Na 電導(dǎo)，V1/2，act是50% Na+通道被激活的電位，k是斜率因子。

對(duì)于穩(wěn)態(tài)失活實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞鉗制在-120 mV，通過一系列持續(xù)500 ms的脈沖電壓刺激（-100 至-10 mV，以10 mV 為增量）實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)快速失活，其余未失活的通道通過40 ms 步進(jìn)去極化激活至-10 mV?？焖偈Щ钋€以玻爾茲曼方程擬合得到。I/Imax=Rin+（1-Rin）/｛1+exp［（V-V1/2，inact）/k］｝，其中Imax是最大Na 電流V1/2，inact是50%Na+通道失活的電位，k是斜率因子，Rin為不發(fā)生失活的通道的比例，在統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 中用玻爾茲曼方程進(jìn)行擬合，A1設(shè)為1，A2即為Rin。

對(duì)于關(guān)閉狀態(tài)下的快速失活曲線，刺激方案參考Herzog 等［17］的工作進(jìn)行：細(xì)胞鉗制在-100 mV，前脈沖去極化至-70 mV，每次刺激逐漸增加前脈沖時(shí)間（時(shí)間從2 ms 增加至200 ms），然后給予去極化至0 mV，持續(xù)時(shí)間為20 ms的測(cè)試脈沖。以每個(gè)電流波的I/Imax和每次刺激的失活持續(xù)時(shí)間為變量作指數(shù)方程采用單指數(shù)擬合得到關(guān)閉狀態(tài)下的快速失活曲線，并以獲得的τ值進(jìn)行作圖。

2.5 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

選用野生型C57BL/6J 雄性小鼠（6 周，20 ± 2 g），共3組，每組5只，足底（左后肢注射體積10 μL）分別注射BmK M2（50 nmol/kg）7 μg 和BmK M2（50 nmol/kg）7 μg + GpTx-1（5 nmol/kg）。選 用Nav1.8 KO 雄性小鼠（6 周，20 ± 2 g）5 只，足底注射BmK M2（50 nmol/kg）7 μg。統(tǒng)計(jì)足底注射后30 min 內(nèi)小鼠舔足和抖足的次數(shù)。小鼠舔足實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，當(dāng)疼痛行為（舔足、抖腿、懸腿）明顯減少或消失，將待測(cè)小鼠置于金屬網(wǎng)格上適應(yīng)5 ~ 10 min，然后用Von frey 電子機(jī)械痛檢測(cè)儀對(duì)給藥足底機(jī)械閾值進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)小鼠受到機(jī)械針刺激后會(huì)產(chǎn)生自然縮足（邁步不計(jì)算在內(nèi)）時(shí)的力量閾值為其縮足閾值（以質(zhì)量單位克計(jì)算），每只小鼠共重復(fù)測(cè)試5次，并以平均值作為最終參考值。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用Origin 8.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行制圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的使用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；不符合正態(tài)分布則用M（P25，P75）描述。符合正態(tài)分布與方差齊性的兩組計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組資料則采用One-Way ANOVA 和Tukey test 分別做兩組間統(tǒng)計(jì)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 BmK M2的分離與鑒定

為了分離東亞鉗蝎蝎毒中的多肽，首先利用SephadexG-50 分子篩對(duì)提取的粗毒進(jìn)行了分離。然后進(jìn)一步對(duì)SephadexG-50分子篩的P7峰進(jìn)行了HPLC 分離。HPLC 圖譜中顯示有23 個(gè)峰，其中峰形完整且可能為高純度單體的有14個(gè)峰（圖1-A）。在這14個(gè)單峰中，P12（紅圈標(biāo)注）的豐度較高。飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)果提示P12相對(duì)分子質(zhì)量約為7 235（圖1-B）。進(jìn)一步通過N 末端氨基酸測(cè)序以及多肽指紋圖譜鑒定發(fā)現(xiàn)P12 與已鑒定序列的α 毒素BmK M2 氨基酸序列一致（Uniprot no.P58488），由64 個(gè)氨基酸組成，包含4 對(duì)二硫鍵（圖1-C）。這些結(jié)果提示，P12 是BmK M2，在蝎毒中的含量為0.5%~1%。

3.2 BmK M2的序列比對(duì)和同源建模

為進(jìn)一步明確BmK M2 的結(jié)構(gòu)并為其潛在生物學(xué)活性探索提供依據(jù)，將BmK M2 與多種已知Na+通道蝎毒素進(jìn)行了序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，BmK M2 的氨基酸序列與已發(fā)現(xiàn)的Na+通道毒素BmK M1、BmK M3、BmK M4、BmK M8、OD1、AaH2具有較高相似性，其中與BmK M1、BmK M3、BmK M4 的序列同源性分別高達(dá)96.88%、80.95%和81.25%，與BmK AGAP（Uniprot ID：Q95P69）的序列同源性為68.75%（圖2-A）。進(jìn)一步以已測(cè)定結(jié)構(gòu)的BmK M1 作為模板對(duì)BmK M2 進(jìn)行同源建模發(fā)現(xiàn)，BmK M2是一種典型的長鏈α毒素，具有α螺旋構(gòu)成的核心區(qū)域以及β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成的柔性C 端。與其他α 毒素類似，BmK M2 的結(jié)構(gòu)被4 對(duì)二硫鍵（C12-C63、C16-C36、C22-C46、C26-C48）所穩(wěn)定（圖2-B）。盡管BmK M2與另兩種已知的哺乳動(dòng)物Na+通道毒素AaH2 及OD1 的序列同源性分別為59.09%和75%，但BmK M2 與AaH2 的3D 結(jié)構(gòu)幾乎一致。這些結(jié)果提示BmK M2可能與AaH2的活性類似，是一種潛在的Na+通道調(diào)節(jié)劑［9］。

Figure 1 Purification and identification of BmK M2

3.3 BmK M2 對(duì)Nav1.7 的I-V 曲線以及峰電流的影響

Nav1.7 表達(dá)于外周神經(jīng)，是與疼痛信號(hào)傳遞最為密切的Na+通道亞型［18］。本研究利用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)了BmK M2 對(duì)Nav1.7 電壓-電流曲線的影響。結(jié)果顯示BmK M2 顯著增強(qiáng)電壓門控Na+通道Nav1.7 的激活（圖3-A）。如圖3-B 所示：1 μmol/L BmK M2 可顯著改變Nav1.7 初始激活電壓閾值，激活電壓和電流的反轉(zhuǎn)電位，使得Nav1.7的I-V曲線左移（ΔV= -7 mV，n= 14，P＜0.05）。但-10 mV 單電壓刺激顯示，BmK M2 對(duì)Nav1.7 的峰電流沒有顯著影響（圖3-C）。該結(jié)果表明，BmK M2與其他已報(bào)道的α 毒素如AaH2、OD1等活性類似，但與BmK AGAP不同。

3.4 BmK M2對(duì)Nav1.7激活及穩(wěn)態(tài)失活的影響

進(jìn)一步研究了BmK M2 對(duì)Nav1.7 的激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響。電生理結(jié)果顯示，BmK M2在-140 mV 至-70 mV 期間加速失活，在-70 mV 至0 mV 期間延遲失活（圖4-B）。加藥前后的ΔV1/2fastinact（半數(shù)穩(wěn)態(tài)快速失活電壓）為-7.3 mV（n= 15，P＜0.05）。同樣的，如圖4-C 所示，BmK M2 能夠顯著增強(qiáng)Nav1.7 的激活活性，使Nav1.7的激活曲線向超極化方向移動(dòng)（左移，ΔV1/2，act=-8.6 mV，n=12，P＜0.05）。

Figure 2 Homology modeling and molecular dynamics of BmK M2

Figure 3 Effect of BmK M2 on Nav1.7 expressed in HEK293 cells

Figure 4 Effect of BmK M2 on the activation and steady-state fast inactivation curves of Nav1.7 channels

3.5 BmK M2對(duì)Nav1.7關(guān)閉狀態(tài)下失活的影響

電壓門控離子通道的失活是內(nèi)在的自動(dòng)調(diào)節(jié)過程，是控制動(dòng)作電位的發(fā)生和形狀以及在可激發(fā)組織中建立發(fā)射模式所必需的［19］。在強(qiáng)去極化膜電勢(shì)下的打開狀態(tài)（開路狀態(tài)滅活，OSI），以及在超極化和中度去極化膜電勢(shì)下的開路前關(guān)閉狀態(tài)（閉路狀態(tài)滅活，CSI）都可能導(dǎo)致失活［19］。電壓門控Na+通道的CSI可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)元興奮性并調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度的變化［17］。但是關(guān)于蝎毒素對(duì)Na+通道亞型的CSI的影響的研究則甚少。電生理結(jié)果提示：給予1 μmol/L BmK M2 可顯著減少Nav1.7 CSI的時(shí)間常數(shù)，使得通道開放的時(shí)間延長，持續(xù)電流增加。如圖4-C 所示，給藥前Nav1.7的CSI 時(shí)間 常數(shù)τ 在46 ms 左 右；給予1 μmol/L BmK M2 后τ 減少到9 ms 左右（n= 13，P＜0.05）。這些結(jié)果提示，BmK M2 可能會(huì)增加DRG 神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻次和持續(xù)時(shí)間，產(chǎn)生致痛作用。

Figure 5 Effect of BmK M2 on the closed state fast inactivation of Nav1.7 channels

3.6 BmK M2對(duì)Nav1.8電生理活性的影響

Nav1.8 是表達(dá)在外周感覺神經(jīng)元上的另一種主要的TTX-R Na+通道亞型，該通道的激活對(duì)于維持動(dòng)作電位的重復(fù)發(fā)放至關(guān)重要［20］。之前有研究表明東亞鉗蝎蝎毒素BmK I 可通過激活Nav1.8 引起痛覺過敏［10］，而BmK I 與BmK M2 有較高的序列同源性，因此進(jìn)一步檢測(cè)了BmK M2 對(duì)Nav1.8 電生理活性的影響。結(jié)果圖6-A、6-B 和6-C 所示，BmK M2 不影響Nav1.8 的電壓依賴性激活和快速失活，也不能抑制其峰值電流（n= 13，P＞0.05）。該結(jié)果表明BmK M2具有一定的選擇性，為后續(xù)開展BmK M2 與Nav1.7 的相互作用研究提供了基礎(chǔ)。

Figure 6 Effect of BmK M2 on Nav1.8 expressed in ND7/23 cells

3.7 BmK M2誘導(dǎo)Nav1.7依賴的疼痛行為

BmK M2 抑制Nav1.7 的失活將會(huì)降低動(dòng)作電位發(fā)放閾值，從而誘發(fā)疼痛行為。因此，進(jìn)一步測(cè)試了BmK M2 的致痛活性。結(jié)果提示，在野生型C57BL/6J（WT）小鼠后爪注射BmK M2 后可引起劇烈的疼痛行為和機(jī)械痛敏感（圖7）。BmK M2引起的疼痛縮足行為在15 min時(shí)達(dá)到峰值，每5分鐘的縮足次數(shù)達(dá)到70±12 次（n=5，P＜0.001）。機(jī)械痛閾值低至1.22±0.34（n=5，P＜0.001）。共同注射GpTx-1 顯著降低了BmK M2 引起的疼痛縮足行為（圖7A-7B，n= 5，P＜0.001），每5 分鐘的縮足次數(shù)僅為15±3次（n=5，P＜0.001），并且逆轉(zhuǎn)了BmK M2引起的機(jī)械痛敏感（圖7-C）。機(jī)械痛閾升高至5.25±0.13（n=5，P＜0.001）。在Nav1.8 KO 小鼠中，BmK M2 依然可以誘導(dǎo)顯著的疼痛行為和機(jī)械痛敏感（圖7，n=5，P＜0.001）。這些結(jié)果表明BmK M2 的致痛行為可能是Nav1.7 依賴的，而與Nav1.8無關(guān)。

Figure 7 BmK M2 evoked pain response is abolished by Nav1.7 specific blocker(± s,n = 5)

4 討 論

本研究采用Sephadex G-50分子篩和高效液相色譜技術(shù)從陜西東亞鉗蝎蝎毒中純化出蝎毒組分P12。利用多肽指紋圖譜和氨基酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)蝎毒組分P12 的氨基酸序列與基于晶體學(xué)分析預(yù)測(cè)的BmK M2 序列一致［12］。該毒素相對(duì)分子質(zhì)量為7 235.59，含有4 對(duì)二硫鍵，然后利用同源建模技術(shù)構(gòu)建了BmK M2 的分子模型。序列比對(duì)結(jié)果顯示，BmK M2 的序列與已發(fā)現(xiàn)的Na+通道毒素BmK M1、BmK M3、BmK M4、BmK M8、OD1、AaH2具有較高的序列和結(jié)構(gòu)相似性，均在N端和C端含有一段保守區(qū)域。因此該毒素是一種潛在的新型Na+通道調(diào)節(jié)劑。

Nav1.7 和Nav1.8 是外周神經(jīng)中傳遞疼痛信號(hào)的兩個(gè)主要Na+通道亞型，均在疼痛機(jī)制中起著重要作用，其中Nav1.7 在動(dòng)作電位形成和傳遞中扮演關(guān)鍵角色。本研究結(jié)果顯示，BmK M2 對(duì)Nav1.7 的峰值電流無顯著影響，但可延遲Nav1.7的穩(wěn)態(tài)以及關(guān)閉狀態(tài)下失活，延長Nav1.7 的開放時(shí)間，增加其持續(xù)電流，增強(qiáng)DRG 神經(jīng)元的動(dòng)作電位（AP）的發(fā)放，從而導(dǎo)致痛覺超敏。而BmK M2不能抑制外周神經(jīng)中另一個(gè)主要通道Nav1.8的峰值電流，也不會(huì)影響Nav1.8 電壓依賴性激活和快速失活。進(jìn)一步的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BmK M2 可能通過Nav1.7而不是Nav1.8產(chǎn)生疼痛行為。

本研究結(jié)果表明，BmK M2 可作為一種新型的Na+通道探針用于Nav1.7結(jié)構(gòu)和功能研究，這為后續(xù)開展BmK M2 與Nav1.7 的相互作用研究提供了理論基礎(chǔ)。