韁核損毀對(duì)2型糖尿病大鼠淚膜破裂時(shí)間及淚液分泌的影響

張淼 李子昂 嚴(yán)宗輝 楊娟 李坤珂 楊利敏

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種常見的慢性代謝性疾病，自2000年以來，我國(guó)T2DM的發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)[1]。糖尿病并發(fā)癥是給患者帶來身體及精神上傷害的主要因素，其中糖尿病眼病是最常見并發(fā)癥之一，它能引起患者視力減退，最終導(dǎo)致失明。干眼癥是一種受多因素影響的眼表疾病，以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征，并伴有眼部不適癥狀，其主要病理生理機(jī)制為淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表炎癥、損傷以及神經(jīng)感覺異常[2]。穩(wěn)定的淚膜是眼部健康的標(biāo)志，淚膜保護(hù)和濕潤(rùn)角膜，并形成了光線進(jìn)入視覺系統(tǒng)的第一個(gè)界面，干眼患者會(huì)有視力下降和視力波動(dòng)的主訴。有研究顯示，干眼癥與糖尿病眼病之間具有顯著相關(guān)性[3]。至今為止，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)干眼癥的調(diào)控作用尚無相關(guān)報(bào)道。韁核(habenular nucleus, Hb)是中腦內(nèi)與大腦和腦干多個(gè)腦區(qū)具有密切纖維聯(lián)系的重要中繼站，參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)[4]。有研究顯示，韁核損毀可改善T2DM大鼠的葡萄糖代謝紊亂[5]，但其對(duì)T2DM干眼癥是否有改善作用尚不清楚，本研究通過高脂高糖飲食結(jié)合低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，觀察電損毀韁核對(duì)T2DM大鼠淚膜破裂時(shí)間及淚液分泌的影響，探討韁核對(duì)T2DM干眼癥的調(diào)控作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)研究。SD雄性大鼠(清潔級(jí)，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)24只，體重(210±30)g；飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)[室溫(23±2)℃]，相對(duì)濕度45%～55%，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，所有動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水。1周后用電子天平秤稱取、記錄大鼠體重，并用苦味酸為大鼠標(biāo)記實(shí)驗(yàn)編號(hào)。標(biāo)記后將大鼠隨機(jī)分為正常組(Control)、模型組(T2DM)、T2DM假手術(shù)組和T2DM損毀組，每組大鼠6只。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.T2DM大鼠模型制備:按照大鼠體重稱取適量高脂高糖餅干喂養(yǎng)2周后，對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，按照體重計(jì)算每只大鼠需要注射的STZ劑量，按35 mg/kg劑量對(duì)大鼠進(jìn)行一次性尾靜脈注射。注射STZ后大鼠繼續(xù)進(jìn)行高脂高糖餅干喂養(yǎng)，整個(gè)過程自由飲水。在整個(gè)造模期間要對(duì)大鼠血糖進(jìn)行多次復(fù)測(cè)，密切觀察大鼠血糖變化。直到大鼠空腹血糖持續(xù)高于11.1 mmol/L，并出現(xiàn)多食、多飲、多尿及體重減輕的癥狀并持續(xù)2周則被視為模型穩(wěn)定。

2.Hb損毀:大鼠需禁食12 h，戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。應(yīng)用鼠腦立體定位儀，根據(jù)鼠腦圖譜定位Hb(前囟后3.4～3.8 mm，中線旁0.6～0.9 mm，硬腦膜下4.2～4.6 mm)所在的位置。應(yīng)用牙科鉆顱骨表面鉆孔，電極尖端置入Hb并通電損毀(電流：2 mA，時(shí)長(zhǎng)：1 min)，應(yīng)用相同方法損毀另一側(cè)Hb。損毀完成后縫合頭部皮膚，并消毒。假手術(shù)組大鼠經(jīng)歷相同的手術(shù)過程，但電極無電流通過。

3.淚膜破裂時(shí)間(breakup time，BUT)檢測(cè): 在常溫、濕度適宜、避光室內(nèi)環(huán)境下進(jìn)行。使用抗生素滴眼液濕潤(rùn)但無多余殘留藥液的熒光素試紙接觸下眼瞼瞼緣，使熒光素液體均勻涂布于眼表，在手持裂隙燈下觀察角膜情況,運(yùn)用秒表進(jìn)行計(jì)時(shí),記錄最后一次眨眼后角膜表面出現(xiàn)首個(gè)黑斑的時(shí)間,每只眼至少測(cè)量3次,記錄結(jié)果取平均值。

4.淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer Ⅰ test，S I t)：Schirmer試紙(5 mm × 35 mm)頭端在起始線處折起，置入下眼瞼外中1/3交界處的結(jié)膜囊內(nèi)，測(cè)量5 min內(nèi)淚液浸濕試紙的長(zhǎng)度。Schirmer Ⅰ試驗(yàn)是無麻醉測(cè)試，反映主淚腺的分泌功能。

5.眼壓檢測(cè):手持式回彈眼壓計(jì)(TonoLab，Icare，Espoo，F(xiàn)inland)測(cè)量眼內(nèi)壓(intraocular pressure,IOP)，打開眼壓計(jì)，安裝探針，將眼壓計(jì)靠近大鼠眼睛，無需眼部麻醉，調(diào)整好距離，輕按測(cè)量按鈕，依次完成6次測(cè)量，獲得平均值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間或同一組實(shí)驗(yàn)前后數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)及 組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

與正常對(duì)照組相比，T2DM大鼠體重減輕且精神狀態(tài)較差，制備模型中后期大鼠出現(xiàn)煩渴和多尿癥狀，而且由于喂食了高脂肪和高糖飼料，大鼠糞便呈黃色。注射STZ后個(gè)別大鼠會(huì)出現(xiàn)爛尾情況，且后期大鼠出現(xiàn)腹脹、消化不良、食欲下降，有個(gè)別大鼠造模過程中因血糖過高而死亡。T2DM韁核損毀組大鼠在對(duì)外界的刺激反應(yīng)方面較T2DM組大鼠有所緩解，多尿癥狀也有所改善，精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。

二、Hb損毀降低T2DM大鼠血糖水平

高脂高糖飲食結(jié)合低劑量單次STZ尾靜脈注射1個(gè)月后，與實(shí)驗(yàn)前/正常對(duì)照組相比大鼠血糖水平明顯升高(P<0.01)，Hb損毀后，大鼠血糖水平明顯降低(P<0.01)，但假手術(shù)組大鼠在手術(shù)前后血糖水平并無顯著性變化。見圖1。

圖1 四組大鼠血糖水平的變化

三、Hb損毀可延長(zhǎng)T2DM大鼠淚模破裂時(shí)間

與實(shí)驗(yàn)前/正常對(duì)照組相比，T2DM大鼠淚膜破裂時(shí)間明顯縮短(P<0.01)。Hb損毀后，大鼠淚膜破裂時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.001)，而假手術(shù)組大鼠并無明顯變化，且Hb損毀組大鼠的淚膜破裂時(shí)間較假手術(shù)組亦明顯延長(zhǎng)(P<0.001)。見圖2。

圖2 大鼠淚膜破裂時(shí)間

四、Hb損毀可增加T2DM大鼠淚液分泌量

與實(shí)驗(yàn)前/正常對(duì)照組相比，T2DM大鼠淚液分泌明顯減少(P<0.01)。Hb損毀后，大鼠淚液分泌明顯增加(P<0.001)，而假手術(shù)組大鼠淚液分泌量并無明顯變化。Hb損毀組大鼠的淚液分泌量較假手術(shù)組明顯增加(P<0.001)。見圖3。

圖3 大鼠淚液分泌的變化

五、Hb損毀可降低T2DM大鼠眼壓

與實(shí)驗(yàn)前/正常對(duì)照組相比，T2DM大鼠眼壓增高(P<0.01)。Hb損毀后，大鼠眼壓顯著降低(P<0.01)，而假手術(shù)組大鼠手術(shù)前后眼壓無明顯變化。Hb損毀組大鼠的眼壓較假手術(shù)組明顯降低(P<0.001)。見圖4。

圖4 大鼠實(shí)驗(yàn)前后眼壓的變化

討 論

糖尿病眼病是最常見的并發(fā)癥之一，也是糖尿病早期最易出現(xiàn)的并發(fā)癥，干眼癥與糖尿病眼病之間具有顯著相關(guān)性[3]。因此揭示糖尿病性干眼癥的病理機(jī)制及其調(diào)控機(jī)理將有利于臨床干眼癥的治療。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)再次證明T2DM中干眼癥的高發(fā)率，同時(shí)發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)T2DM干眼癥具有重要的調(diào)控作用，此發(fā)現(xiàn)為臨床T2DM干眼癥的治療和預(yù)防提供了新的思路。

T2DM是一種慢性代謝疾病，患者特征表現(xiàn)為高血糖、相對(duì)缺乏胰島素、有胰島素抗性等癥狀，本研究采用的高脂高糖飲食結(jié)合低劑量STZ誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型與人類T2DM最為相似的動(dòng)物模型[6]，在此模型基礎(chǔ)上的研究也是最可靠和有效的。本研究結(jié)果顯示，所有T2DM大鼠均存在淚膜破裂時(shí)間縮短和淚液分泌減少的癥狀，這與國(guó)內(nèi)外其他實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果完全一致[7]。糖尿病病程、血糖水平等是影響干眼發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，且隨著病程的進(jìn)展，患者多伴有外周神經(jīng)病變，角膜平均敏感度顯著降低，淚膜穩(wěn)定性降低發(fā)生干眼幾率和嚴(yán)重程度明顯增加[8，9]。長(zhǎng)期體內(nèi)高血糖水平會(huì)影響機(jī)體正常生理代謝，引起免疫炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞凋亡增加和性激素失衡，導(dǎo)致眼表結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和角膜周圍神經(jīng)病變，淚液分泌功能、淚液成分、角膜上皮表面絨毛結(jié)構(gòu)和滲透壓受到影響，導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)，誘使干眼發(fā)生。其中角膜神經(jīng)病變可影響淚液的反射性刺激分泌，淚液中的水、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、葡萄糖、尿素和酶，共同組成眼表的第一道防御屏障，當(dāng)淚液成分和量發(fā)生改變，淚液和眼表神經(jīng)肽的合成異常且通過缺陷受體發(fā)出錯(cuò)誤信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致眼表保護(hù)清除功能異常，影響對(duì)角膜的營(yíng)養(yǎng)功能，從而加重干眼癥[10]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠眼壓顯著升高，這與其他實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果[11]及人類糖尿病患者眼壓升高的臨床癥狀完全一致[12]，其發(fā)生機(jī)理可能與淚膜穩(wěn)定性下降及淚液分泌失調(diào)有關(guān)。Hb損毀在改善干眼癥狀的同時(shí)亦可降低T2DM大鼠眼壓水平，說明干眼癥狀與眼壓之間存在著某種聯(lián)系，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)方面起著不可忽視的作用，Hb已經(jīng)證明參與了機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)[4]。但關(guān)于Hb對(duì)T2DM眼功能的調(diào)控作用尚無報(bào)道。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)，Hb損毀可降低T2DM大鼠血糖水平[5]，但對(duì)T2DM并發(fā)癥是否有影響尚未可知。本研究通過電損毀的方式移除T2DM大鼠的Hb，發(fā)現(xiàn)消除Hb后不僅可降低T2DM大鼠血糖水平，而且可明顯改善T2DM大鼠的干眼癥狀，同時(shí)也降低了T2DM大鼠的眼壓。糖尿病眼部病變主要涉及視神經(jīng)細(xì)胞和血管變性、炎癥反應(yīng)以及淚腺中糖基化產(chǎn)物增加和結(jié)膜杯狀細(xì)胞顯著減少等機(jī)制，Hb損毀改善T2DM大鼠干眼癥狀很可能是通過對(duì)外周神經(jīng)興奮性及外周淋巴循環(huán)功能的調(diào)節(jié)而發(fā)產(chǎn)生作用，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以揭示。