丹參酮生物合成途徑關鍵酶CYP76AH3的晶體結構與分子對接

陳張鑫， 賀 珂， 史 超， 黃力新， 肖城良， 常振戰(zhàn)*

(1)北京大學 基礎醫(yī)學院，北京 100191；2)中國科學院 生物物理所，北京 100191)

丹參作為我國最早記載于《神農本草經(jīng)》的傳統(tǒng)中藥，具有活血、通淤排膿、順脈寧神等功效[1]。丹參中活性成分主要為脂溶性的丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB和隱丹參酮等[2]。其活性成分具有廣泛的藥理作用，主要集中在治療心絞疼、冠心病以及抗炎和抗腫瘤等方面[3]。近期研究表明，在骨質疏松、骨關節(jié)炎和慢性阻塞肺炎等疾病中也具有療效，丹參酮ⅡA能通過抑制miR-155/FOXO3來改善軟骨破壞和滑膜炎癥[4]，丹參酮ⅡA磺酸鈉在小鼠模型中通過上調去乙?；窼IRT1(sirtuin-1, SIRT1)改善線粒體功能、降低氧化應激來改善吸煙誘導的慢性阻塞性肺疾病[5]。

丹參的活性成分獲取方式主要從丹參中直接提取，隨著丹參的應用范圍不斷擴大，運用合成生物學建立可大量、持續(xù)和廉價獲取丹參中有效成分的方法是目前的熱點[6]。目前，對丹參中活性成分的合成途徑解析和異源表達體系建立已取得一定成果。2012年，Zhou等通過在底盤微生物中模塊化融合丹參類貝殼杉烯合酶(salvia miltiorrhiza kaurene synthase-like，SmKSL)和丹參柯巴基焦磷酸合酶(salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS)，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)酵母得到365 mg/L中間代謝產(chǎn)物次丹參酮二烯[7]。Dai等發(fā)現(xiàn)激活法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)合成酶與牻牛兒苗牻牛兒苗基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)合成酶對次丹參酮二烯合成的提高作用，基于模塊改造進一步將次丹參酮二烯產(chǎn)量提到了488 mg/L[8]。在2013年，Guo等融合CYP76AH1基因釀酒酵母中異源表達鐵銹醇，產(chǎn)量達到了10.5 mg/mL[9]。2020年，Mao等通過基于預測結構改造CYP76AH1蛋白質，實現(xiàn)目標產(chǎn)物導向生成和催化效率的提升[10]。

在丹參酮生物合成途徑中，通用甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA)或2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)形成基本骨架后，后續(xù)CYP450類基因占有很大比重，該家族基因主要發(fā)揮對丹參酮中間產(chǎn)物骨架側鏈進行修飾或剪裁的作用[11]。CYP76AH3是丹參酮生物合成途徑中繼CYP76AH1之后一個重要的P450酶[12]，該酶處在丹參酮中間代謝產(chǎn)物流向分支處，中間產(chǎn)物次丹參酮二烯經(jīng)CYP76AH1催化生成鐵銹醇后，緊接著由CYP76AH3催化鐵銹醇生成柳杉酚，再催化柳杉酚生成11-羥基柳杉酚，也可催化鐵銹醇生成11-羥基鐵銹醇，再催化11-羥基鐵銹醇生成11-羥基柳杉酚[13]。復雜的代謝網(wǎng)絡和混合的中間產(chǎn)物表明CYP76AH3是一個關鍵的P450酶，因此，本研究針對CYP76AH3進行晶體結構研究和底物對接分析，并計算模擬預測關鍵氨基酸點突變對結構的影響，以期為丹參酮的生物合成奠定基礎，同時也可以豐富植物P450酶的晶體結構數(shù)據(jù)庫，為系統(tǒng)性研究植物中P450酶結構提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)細胞Trans1-Blue購自北京全式金生物公司，質粒pCW Ori(+)(Amp抗性)來自Dr.F.W.Dahlquist的饋贈，晶體試劑盒購自Hampton公司，顯微鏡購自Olympus公司，晶體培養(yǎng)箱購自Molecular Dimensions，Ni2+-NTA購自Thermo，AKTA purifier 10/100購自GE公司，超聲波細胞破碎儀購自BRANSON，高速離心機購自BECKMAN公司，恒溫培養(yǎng)箱購自上海智城，PierceTMBCA Protein Assay Kit購自Thermo。

1.2 CYP76AH3序列分析與重組質粒構建

在NCBI中檢索CYP76AH3的序列，將CYP76AH3序列N端的DSFSLLAALFFISAATWF ISSRRRRN替換為親水序列AKKTSSKGK，C端添加6個組氨酸作為親和純化標簽，并使用ProtParam、XtalPred-RF 和FoldIndex等網(wǎng)站對改造前后序列進行在線預測分析。改造后的序列經(jīng)原核表達密碼子優(yōu)化后，插入pCW Ori(+)質粒的5′NdeⅠ和3′XbaⅠ上下游酶切位點中，正向引物為Fw:5′-GATCAGCTTACTCCCCATCC-3′，反向引物為Rv:5′-AATAGGCGTATCACGAGGC-3′，質粒由北京睿博生物公司合成。

1.3 CYP76AH3的表達

將重組質粒轉化到Trans1-Blue感受態(tài)細胞中，均勻涂布于含 100 μg/mL 氨芐青霉素和四環(huán)素雙抗性LB固體平板上，放置37 ℃恒溫孵箱過夜培養(yǎng)，再挑取單克隆菌落于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中制作種子液，在搖床中培養(yǎng)，搖床轉速設置220 r/min，溫度設置37 ℃。待菌液渾濁后取5 mL加入1 L TB液體培養(yǎng)基中，在搖床中擴大培養(yǎng)，搖床溫度設置37 ℃，轉速設置為220 r/min，另取1 mL菌液送北京睿博生物公司測序以鑒定轉入感受態(tài)細胞質粒序列正確無誤。菌液培養(yǎng)至A600約0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)和終濃度為1 mmol/L 的5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽(5-aminolevulinic acid hydrochloride，ALA)，搖床溫度設置為32 ℃、轉速為190 r/min，誘導表達48 h。

1.4 CYP76AH3的純化

誘導結束后4 ℃，3 600 r/min離心收集菌體，用裂解緩沖液(500 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，0.25 % 膽酸鈉，15% 甘油，pH 7.4)重懸菌體，同時加入終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、β-巰基乙醇(2-Hydroxy-1-ethanethiol，β-ME)和0.5%的TritonX-100，置于冰水浴中超聲破碎，設置強度為30%，工作5 s，暫停5 s，時長40 min，超聲至無明顯懸浮固體，將菌液在4 ℃，12 000 r/min離心40 min，上清以0.3 mL/min的流速上樣到經(jīng)裂解緩沖液平衡后的Ni2+-NTA親和層析柱，用100 mL洗滌緩沖液1(500 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，15% 甘油，pH 7.4，5 mmol/L組氨酸)和100 mL洗滌緩沖液2(500 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，15% 甘油，pH 7.4，10 mmol/L組氨酸)清洗雜蛋白質，用20 mL洗滌緩沖液3(500 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，15% 甘油，pH 7.4，200 mmol/L組氨酸)洗脫目的蛋白質，用50 kD截留管離心濃縮；取適量濃縮的目的蛋白質，用經(jīng)過緩沖液(500 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，15% 甘油，pH 7.4)平衡的HiloadTM16/600 SuperdexTM200 pg制備柱進行純化，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，收集樣品，10% SDS-PAGE分析，將純度最高的目的蛋白質合并，離心濃縮后用BCA法測定濃度，加液氮速凍,-80 ℃冰箱備用。

1.5 CYP76AH3晶體篩選

將純化后的CYP76AH3蛋白質用坐滴法進行初篩，0.4 μL池液與0.4 μL蛋白質混勻加入坐滴孔，上下兩孔蛋白質濃度分別為40 mg/mL和20 mg/mL，池液為40 μL商用結晶試劑盒的試劑，晶體培養(yǎng)箱設置16 ℃。一周后用顯微鏡觀察坐滴孔，發(fā)現(xiàn)有晶體長出后進一步采用懸滴法進行濃度梯度優(yōu)化和添加劑優(yōu)化, 并根據(jù)需要加入相應配體。

1.6 CYP76AH3單晶衍射數(shù)據(jù)收集

用尼龍圓環(huán)將晶體撈出，置于防凍液(池液添加25%甘油)中，迅速轉入液氮凍存，轉運至上海同步輻射光源，在19U1線站進行衍射數(shù)據(jù)收集，波長為0.97853 ?，探測器距晶體距離400 mm，回擺角度1度，曝光時間為0.2 s，收集溫度為100 K，每顆晶體收集360張。

1.7 CYP76AH3晶體結構解析

原始衍射數(shù)據(jù)用HKL3000[14]處理，以CYP76AH1晶體結構(PDB號為5 ylw)作為模板分子置換，分子置換使用CCP4[15]的PHASER模塊，最后使用PHENIX[16]的REFINE模塊和COOT[17]進行精修，用PYMOL進行結構展示與作圖。

1.8 CYP76AH3的分子對接與點突變模擬計算

采用Discovery Studio軟件對CYP76AH3相應底物進行分子對接，底物根據(jù)文獻分析選用鐵銹醇(ferruginol)、柳杉酚(sugiol)和11-羥基鐵銹醇(11-hydroxyferruginol)，在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載相應底物分子SDF文件，導入到Discovery Studio軟件中，通過Prepare Ligands模塊預處理小分子文件生成立體構象。通過Prepare Protein模塊對CYP76AH3結構進行優(yōu)化，刪除水分子，添加氫原子。在對接前，使用CavityPlus在線網(wǎng)站[18]分析結構中的空腔。使用LibDock模塊進行對接，以CavityPlus分析結果定義分子對接區(qū)域，Site Sphere參數(shù)設置為-35.852，16.055，-17.14，12.00，能量最小化算法選擇Smart Minimize。

根據(jù)對接產(chǎn)生的結果，將與底物有氫鍵相互作用的GLY298與ASP294分別突變成ALA和PHE，將與底物有疏水相互作用的PHE479、LEU293、LEU367分別突變成ALA和THR，將突變結果提交到MAESTRO[19]和Missense3D[20]在線網(wǎng)站評估點突變對結構的影響。

2 結果

2.1 CYP76AH3重組質粒改造前后序列分析

CYP76AH3的Genbank編號為 KR140168.1，ProtParam分析顯示氨基酸序列全長494個氨基酸，不穩(wěn)定指數(shù)為42.43，親水性總平均為-0.191，改造后的CYP76AH3全長483個氨基酸，不穩(wěn)定指數(shù)為38.42，親水性總平均為-0.286，經(jīng)過改造后蛋白質親水性得到增強，并由不穩(wěn)定轉為穩(wěn)定，更有利于目的蛋白質在原核表達體系中純化。CYP76AH3序列FoldIndex分析顯示，除了105至145的氨基酸序列可折疊系數(shù)稍微低于0外，其余都在0以上，表示蛋白質總體具有極佳的可折疊性。改造前后XtalPred-RF的EP-class和RF-class預測結果均為1，表明結晶成功率極高，改造前后不影響結晶可能性。

2.2 CYP76AH3提取物電泳證實獲得純化蛋白質

蛋白質溶液經(jīng)凝膠過濾層析顯示出2個峰，根據(jù)HiloadTM16/600 SuperdexTM200 pg蛋白質標準曲線對比可知，分別為多聚和單體形式(Fig.1A)，出峰位置組分經(jīng)10% SDS-PAGE(Fig.1B)顯示，在54 kD位置可見目的蛋白質條帶，與重組蛋白質理論分子量大小相符，且純度在90%以上，可以滿足結晶試驗的需要。

Fig.1 Gel filtration chromatography and SDS-PAGE analysis (A)After purification by the nickel column, the target protein was eluted by 200 mmol/L histidine and purified by gel filtration chromatography, and the flow rate was set to 1 mL/min and the detection band was set to 280 nm.The CYP76AH3 protein has two peaks after gel filtration chromatography purification, Peak 1 and Peak 2 correspond to polymorphs and monomers, respectively.(B)The effluent solutions corresponding to Peak 1 and Peak 2 were collected in separate tubes and tested for purity using 10% SDS-PAGE.Lanes 1-6 correspond to Peak1, Lanes 7-11 correspond to Peak 2, Lanes marked with "M" are molecular weight markers.SDS-PAGE shows purified recombinant CYP76AH3 proteins at 54 kD and its purity meets the requirements of subsequent experiments

2.3 CYP76AH3晶體篩選與優(yōu)化

初篩得到的晶體大多為針刺狀或細桿狀，大約3個月后經(jīng)顯微鏡觀察到狀態(tài)較好的片狀晶體，衍射分辨率在10 ?左右。經(jīng)過大量的嘗試，晶體質量得到提升，為紅棕色塊狀(Fig.2A)。優(yōu)化后的結晶條件為：懸滴法，池液600 μL 1 600 mmol/L檸檬酸三鈉，蛋白質濃度20 mg/mL，2 μL蛋白質和2 μL池液1∶1混勻，添加劑(30%V/V(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇)0.4 μL。在上海同步輻射光源BL19U1線站收集衍射數(shù)據(jù)(Fig.2B)，分辨率在3.5 ?左右，晶體轉動到一定角度時衍射點變差，可能與晶體本身堆積方式有關。

Fig.2 Crystals of CYP76AH3 and X-ray diffraction image from a CYP76AH3 crystal (A)After protein purification, two concentrations(40 mg/mL and 20 mg/mL)were set for crystallization tests.Using the sitting-drop method for primary screening and the hanging-drop method for optimization, the final protein crystals were obtained under mixing conditions of 2 μL protein plus 2 μL pool solution and 0.4 μL additive(30% V/V(+/-)-2-methyl-2,4-pentanediol)in 600 μL pool solution hanging-drop well.(B)We select crystals in good conditions for diffraction at the synchrotron beamline BL19U1 at SSRF(Shanghai, China), diffraction data were collected at exposure time of 0.2 s and temperature of 100 K, and the distribution of diffraction points is shown in the figure

2.4 CYP76AH3晶體結構

采用HKL3000、CCP4、PHENIX、COOT等軟件解析了CYP76AH3的三維結構，空間群為P6322(Table 1),PDB號為7X2Q。蛋白質結構為二聚體，呈一定角度旋轉對稱(Fig.3B)。蛋白質單體呈三棱錐形，由大量α螺旋構成，每個蛋白質分子結構中包含13個α螺旋(標記為A-L)、4對反向平行β折疊(β1-β4)和無規(guī)卷曲，其中3對β折疊位于N端附近，1對位于C端。血紅素輔基被夾在螺旋I和螺旋L之間(Fig.3C)，一側有大量α螺旋(F、I、E、D、G螺旋)，另一側主要是無規(guī)卷曲，形成血紅素輔基與底物反應的活性空間。其中保守位點Cys437位于靠近血紅素輔基的L螺旋尾部，被認為與血紅素輔基中Fe原子配位，參與底物的電子傳遞。

Fig.3 Ramachandran plots and crystal structures of CYP76AH3 (A)Structure after refinement, the statistical parameters are shown in the Ramachandran plot.(B)The data were processed and scaled with HKL3000.The PDB entry 5ylw was used as a search model for phasing of the X-ray data.Iterative model building and refinement were performed using Coot and PHENIX respectively.Protein structure displayed by PyMOL.(C)CYP76AH3 monomer structures, the N-terminal and C-terminal are shown in figure, and the main α-helix are labeled with A-L, the β-sheet are labeled with β1-β4

2.5 CYP76AH3 與底物分子對接與點突變計算分析

CavityPlus空腔預測結果顯示，最佳空腔的DrugScore為5 322.00，Druggability為Strong，該空腔包裹住血紅素輔基所在位置。以該空腔為對接范圍，經(jīng)分子對接分析表明，不同構象的鐵銹醇、柳杉酚和11-羥基鐵銹醇與CYP76AH3形成氫鍵作用最多的氨基酸有Gly298和Asp294(序列從N端計數(shù))，形成疏水作用對多的氨基酸有Phe479、Leu367和Leu293(Fig.4D)。圖中顯示為各底物最佳LibDockScore的對接姿態(tài)(Fig.4)。

Fig.4 Molecular docking and key amino acid residue predictions After using CavityPlus to determine the range of docking space, the CYP76AH3 monomer structure was used as the docking acceptor and the small molecules(ferruginol, sugiol, 11-hydroxyferruginol)were used as the docking ligands.The LibDock module in Discovery Studio was used for the docking procedure, and Smart Minimize was chosen for the energy minimization algorithm.(A)Docking results of ferruginol, the interaction of major amino acid residues are shown in the figure.(B)Docking results of sugiol, the interaction of major amino acid residues are shown in the figure.(C)Docking results of 11-hydroxyferruginol, the interaction of major amino acid residues are shown in the figure.(D)Location of key amino acid residues in the structure of CYP76AH3.Red indicates amino acid residues with hydrogen bonds with the substrate.Yellow indicates amino acid residues with hydrophobic interactions with the substrate

點突變模擬計算中，MAESTRO顯示D294A、F479A、L293A、L367A、F479T、L293T和L367T的ΔΔG的預測值大于0(Table 2)說明該類突變會對蛋白質結構穩(wěn)定性造成影響。Missense3D顯示，D294F、G298F突變導致空腔體積收縮了157.24 ?3和227.44 ?3，通常大于70 ?3的改變認為會影響結構的功能。

Table 1 Data collection and refinement statistics

Table 2 Mutation analysis

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)植物天然次生代謝產(chǎn)物具有巨大的應用價值，屬于萜類的丹參酮類化合物有在抗炎、抗腫瘤和心血管疾病治療中發(fā)揮了顯著功效。然而，丹參酮類化合物產(chǎn)量較低、提取成本高，難以滿足大規(guī)模的臨床需求，因此需要利用合成生物學技術來解決這些困難。對天然產(chǎn)物代謝途徑中關鍵酶立體結構活性中心的闡釋是通過合成生物學技術改造其功能的關鍵，因此解析關鍵酶的立體結構具有重要意義。

本研究通過CYP76AH3序列改造，構建了有利于在原核體系表達目的蛋白質的重組質粒，成功純化了大量的可溶性CYP76AH3蛋白質；為了增加純化CYP76AH3蛋白質的收率，在裂解緩沖液中添加了膽酸鈉和TritonX-100；CYP76AH3蛋白的晶體培養(yǎng)及優(yōu)化都比較困難，采用坐滴法初篩時獲得的晶體大多為毛刺或針尖狀，經(jīng)過大量晶體優(yōu)化實驗先后得到薄片狀晶體和塊狀單晶，并成功解析出晶體結構。受限于晶體本身質量較差，CYP76AH3晶體結構分辨率不高，還有待提升。晶體結構分析表明，CYP76AH3為二聚體，呈一定角度旋轉對稱。我們把血紅素輔基附近空間定義為活性中心，以相關底物作為配體，采用分子對接技術分析與配體存在相互作用的氨基酸殘基，得到與底物不同構象出現(xiàn)高頻率氫鍵相互作用的氨基酸殘基Gly298和Asp294，以及與底物有疏水相互作用的氨基酸殘基Phe479、Leu367和Leu293。鑒于Ala具有最小空間占位，Phe帶有一個苯環(huán)而Thr屬于極性的氨基酸，我們采用點突變模擬程序計算出點突變對蛋白質結構的影響，結果顯示：將Asp294突變?yōu)锳la，將Phe479、Leu367和Leu293突變?yōu)锳la和Thr時，都會影響蛋白質結構的穩(wěn)定性；將Asp294和Gly298突變?yōu)镻he，會導致空腔體積收縮。

關鍵酶的晶體結構解析對闡釋酶的催化機制和底物特異性有重要幫助，本研究建立了CYP76AH3的純化平臺，通過蒸汽擴散法優(yōu)化出該酶的結晶條件，解析了蛋白質晶體結構，并通過分子對接篩選出與底物發(fā)生作用的關鍵氨基酸殘基，通過對關鍵氨基酸進行點突變模擬計算出對結構穩(wěn)定性的影響，有望為后續(xù)的突變設計和功能試驗提供借鑒、為丹參酮的合成生物學研究奠定基礎。