環(huán)氧化物水解酶2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與功能作用

張文桃， 胡艷芬， 吳 昊， 劉 銘， 李 莉， 杜根來(lái)， 朱劍軍

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，太原 030001)

肝癌是全世界常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第6位，死亡率位居第3位。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類型之一[1, 2]。肝細(xì)胞癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)，主要包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃曲霉毒素、酒精以及非酒精性脂肪性肝病等[3, 4]。大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者首診較晚，因此預(yù)后較差[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種癌基因、抑癌基因及多種信號(hào)途徑與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如受體酪氨酸激酶信號(hào)通路、RAS絲裂原活化蛋白激酶(RAS/RAF/MAPK)信號(hào)通路等[5]。但是，截止目前為止，肝細(xì)胞癌早期診斷、預(yù)后判斷等方面仍無(wú)理想的腫瘤標(biāo)志物，且肝細(xì)胞癌的分子發(fā)病機(jī)制仍不清楚。因此，繼續(xù)尋找與肝細(xì)胞癌早期診斷及預(yù)后判斷有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

研究報(bào)道，線粒體功能異常和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。到目前為止，MitoCarta數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，人類線粒體中共包括1 136種蛋白質(zhì)?；诖?，我們推測(cè)呈差異表達(dá)的線粒體相關(guān)基因可能在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用?；ㄉ南┧崾且环N人體必需脂肪酸，已有大量研究報(bào)道，花生四烯酸與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展緊密相關(guān)，包括肝細(xì)胞癌、膽管癌和卵巢癌等[6,7]。環(huán)氧化物水解酶2(epoxide hydrolase 2，EPHX2)基因位于8號(hào)染色體(8p21.12)，其mRNA由19個(gè)外顯子組成，所編碼的蛋白質(zhì)由555個(gè)氨基酸殘基組成[6]。可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)是由EPHX2基因編碼的多功能蛋白質(zhì)，定位于線粒體，是花生四烯酸代謝途徑中的一種關(guān)鍵酶[7]。sEH可將環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)代謝為二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid，DHET)[8]。已有研究報(bào)道，與正常肝組織相比，sEH在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)[9]。sEH在精原細(xì)胞瘤、膽管癌和進(jìn)展期卵巢癌中表達(dá)水平升高[10]?；贓PHX2在肝細(xì)胞癌中的研究較少，本文利用GEO、TCGA、MitoCarta等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，全面分析EPHX2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平、功能作用及預(yù)后意義，以期望為后續(xù)實(shí)驗(yàn)性研究及肝細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供潛在的分子靶標(biāo)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)，TB Green?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)。肝癌細(xì)胞株MHCC-97 H、HCCLM3(LM3)和正常肝細(xì)胞株QSG-7701為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株。擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(Table 1)。

Table 1 Primer sequences

1.2 公共數(shù)據(jù)獲取

GDC官網(wǎng)下載癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息數(shù)據(jù)。通過(guò)limma包篩選差異表達(dá)基因。篩選差異表達(dá)基因的條件為：logFC>1，P<0.01，且具有完整的臨床信息及隨訪信息。納入本研究的肝細(xì)胞癌樣本340例，正常樣本50例。GEO官網(wǎng)搜索GSE101728，GSE45050，GSE84598和GSE121248肝癌數(shù)據(jù)集，通過(guò)GEO2R在線平臺(tái)篩選肝癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)基因，篩選條件為logFC>1，P<0.05。其中，GSE101728包括7例肝癌樣本，7例癌旁樣本；GSE45050包括6例肝細(xì)胞癌樣本，3例正常肝組織樣本；GSE84598包括22例肝癌樣本，22例正常肝組織樣本；GSE121248包括70例肝癌樣本，37例癌旁樣本。

1.3 篩選肝細(xì)胞癌中線粒體相關(guān)差異表達(dá)基因

篩選上述4個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中的共有差異表達(dá)基因。通過(guò)MitoCarta3.0下載線粒體相關(guān)基因，并與上述差異表達(dá)基因再取交集，篩選肝細(xì)胞癌線粒體相關(guān)差異表達(dá)基因。

1.4 基因表達(dá)水平分析

整理TCGA肝細(xì)胞癌RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。分析EPHX2及本研究篩選獲得的差異表達(dá)基因在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)水平，并分析EPHX2表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)和基因集富集分析

基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)下載EPHX2相關(guān)基因及相關(guān)系數(shù)，運(yùn)行R包(enrichplot和ggplot2)進(jìn)行基因功能分析。基因功能分析主要包括GO分析和KEGG信號(hào)通路分析。下載基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)軟件并安裝。以EPHX2在肝癌樣本中的中位表達(dá)水平的值為分界線，將肝細(xì)胞癌患者分為EPHX2低表達(dá)組和EPHX2高表達(dá)組。上傳EPHX2高表達(dá)組和低表達(dá)組全部基因表達(dá)矩陣，Gene sets database選擇c2.all.v7.4.symbols.gmt[curated]，運(yùn)行GSEA?；赟TRING和Cytoscape完成蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。

1.6 生存預(yù)后分析

根據(jù)TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以EPHX2表達(dá)水平的中位值為標(biāo)準(zhǔn)，將肝癌患者分為EPHX2低表達(dá)組和EPHX2高表達(dá)組。運(yùn)行R包(survival和survminer)繪制Kalpan-Meier生存曲線。

1.7 組織樣本收集

肝癌組織及對(duì)照癌旁組織標(biāo)本21例，來(lái)源于山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。肝癌診斷均經(jīng)病理證實(shí)，自身對(duì)照癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)經(jīng)病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。收集組織標(biāo)本后立即轉(zhuǎn)移至液氮中保存。本研究已通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究倫理審查，病人和家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

1.9 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取組織50～100 mg，按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取組織RNA。按照PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)TB Green?PremixExTaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。兩步法PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋旱谝徊筋A(yù)變性，95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；第二步PCR反應(yīng)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)水平以2-ΔCт進(jìn)行定量。Β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照基因。每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS16.0軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)檢測(cè)EPHX2在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。P<0.05 被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選獲得15個(gè)肝細(xì)胞癌中的線粒體相關(guān)差異表達(dá)基因

在線運(yùn)行分析肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)庫(kù)GSE101728、GSE45050、GSE84598、和GSE121248，分別篩選獲得5 310個(gè)、661個(gè)、1 154個(gè)和952個(gè)在肝細(xì)胞癌組織中呈差異表達(dá)的基因。Fig.1為HCC中差異表達(dá)基因的維恩圖分析。對(duì)以上差異表達(dá)基因取交集，篩選獲得140個(gè)在上述4個(gè)肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中均呈差異表達(dá)基因(見(jiàn)Fig.1A)。于Human MitoCarta3.0網(wǎng)站下載得到1 136個(gè)線粒體相關(guān)基因，與上述140個(gè)差異表達(dá)基因取交集，最終篩選獲得15個(gè)在肝細(xì)胞癌中呈差異表達(dá)的線粒體相關(guān)基因(見(jiàn)Fig.1B)。

Fig.1 Venn diagram analysis of differentially expressed genes in HCC (A)Venn diagram analysis of differentially expressed genes in four HCC GEO databases.(B)After taking the intersection of 140 DEGs from the above four GEO databases and mitochondrion-related genes from MitoCarta, 15 mitochondrion-related DEGs were identified in this study.DEGs, differentially expressed genes

2.2 15個(gè)線粒體相關(guān)差異表達(dá)基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，分析15個(gè)線粒體相關(guān)差異表達(dá)基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常肝組織中相比，溶質(zhì)載體家族25成員47(solute carrier family 25 member 47，SLC25A47)、犬尿氨酸-3-單加氧酶(kynurenine 3-monooxygenase，KMO)、氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶(aminoadipate aminotransferase，AADAT)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ζ1(glutathione S-transferase zeta 1，GSTZ1)、氧化戊二酸脫氫酶L(oxoglutarate dehydrogenase L，OGDHL)、酰基輔酶A合成酶中鏈家族成員5(acyl-CoA synthetase medium chain family member 5，ACSM5)、4-羥基-2氧化戊二酸醛縮酶1(4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase 1，HOGA1)、乙酰輔酶A羧化酶β(acetyl-CoA carboxylase beta，ACACB)、脫氫酶/還原酶1(dehydrogenase/reductase 1，DHRS1)、酰基輔酶A脫氫酶短鏈(acyl-CoA dehydrogenase short chain，ACADS)、?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員1(acyl-CoA synthetase long chain family member 1，ACSL1)、溶質(zhì)載體家族25成員18(solute carrier family 25 member 18，SLC25A18)、EPHX2和甘氨酸脫羧酶(glycine decarboxylase，GLDC)在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.01)；與在正常肝組織中相比，線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶40(translocase of outer mitochondrial membrane 40 like，TOMM40L)在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。Fig.2為肝癌HCC中15個(gè)線粒體相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平。

Fig.2 Expression levels of the 15 mitochondria-related differentially expressed genes in HCC The expression of the 15 mitochondria-related differentially expressed genes was analyzed using TCGA database(including 340 tumor tissues and 50 normal tissues).** P<0.01, compared with the normal group

2.3 環(huán)氧化物水解酶2在肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)

EPHX2是花生四烯酸代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，且花生四烯酸代謝紊亂與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。本研究利用TCGA-RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，分析EPHX2在340例肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平。Fig.3為肝細(xì)胞癌組織中EPHX2的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常肝組織中相比，EPHX2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著降低(6.203 ± 0.074vs8.171 ± 0.059，P<0.01)(Fig.3A)。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，EPHX2在晚期肝癌患者(Ⅲ+Ⅳ期)中的表達(dá)水平顯著低于其在早期肝癌患者(Ⅰ+Ⅱ期)中的表達(dá)水平(5.880 ± 0.160vs6.314 ± 0.082，P=0.011)(Fig.3B)。EPHX2在女性肝癌患者中的表達(dá)水平顯著低于其在男性肝癌患者中的表達(dá)水平(5.923 ± 0.143vs6.333 ± 0.085，P=0.010)(Fig.3C)。隨腫瘤級(jí)別升高，EPHX2表達(dá)水平逐漸降低(6.847 ± 0.154vs6.309 ± 0.093vs5.831 ± 0.139，均P<0.01)(Fig.3D)。EPHX2在肝癌組織中的表達(dá)水平與患者年齡、T分期、N分期、M分期等因素?zé)o關(guān)(均P>0.05)(Table 2)。

Fig.3 The expression level of EPHX2 in HCC (A)The expression level of EPHX2 in 340 HCC and 50 normal tissues.(B)The expression level of EPHX2 in 253 early stages and 87 advanced stages of tumor tissues.(C)The expression level of EPHX2 in the tumor tissues of 108 female and 232 male HCC patients.(D)The expression level of EPHX2 among 46 cases in grade 1, 167 cases in grade 2 and 127 cases in grade 3 tumor tissues in HCC.*P<0.05,** P<0.01

Table 2 The correlation of EPHX2 with HCC patient characteristics

2.4 環(huán)氧化物水解酶2低表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后有關(guān)

生存結(jié)果表明，EPHX2高表達(dá)組的總生存期高于EPHX2低表達(dá)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, Fig.4)。

Fig.4 Survival analysis of EPHX2 in HCC The mRNA expression data of EPHX2 in 340 HCC samples and survival information were extracted from TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/).HCC patients in this study were divided into low(n=170)and high expression groups(n=170)by the mean expression level of EPHX2 in HCC tissues.Comparison of the difference between the two groups was based on the Log-rank test

2.5 環(huán)氧化物水解酶2及共表達(dá)基因的功能富集分析

功能富集分析結(jié)果顯示：生物過(guò)程方面主要與小分子代謝過(guò)程、有機(jī)酸代謝過(guò)程等相關(guān)。在細(xì)胞組成方面主要與線粒體基質(zhì)、過(guò)氧化物酶體等相關(guān)；分子功能方面主要與含硫化合物結(jié)合、氧化還原酶活性等相關(guān)。信號(hào)通路富集結(jié)果顯示：EPHX2主要與補(bǔ)體途徑，脂肪酸降解等信號(hào)通路相關(guān)(Fig.5)。GSEA基因集富集結(jié)果顯示，EPHX2低表達(dá)組肝癌增殖基因簇水平升高(NES =4.558)，肝癌復(fù)發(fā)基因簇水平升高(NES = 3.991)(Fig.6A)。EPHX2高表達(dá)組肝癌腫瘤增殖活性基因簇水平降低(NES =-5.041)，肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因簇水平降低(NES =-4.226)(Fig.6B)。

Fig.5 The functional analysis of EPHX2 and its co-expressed genes GO and KEGG pathway enrichment analysis was performed on EPHX2 and its 335 co-expressed genes.(A)Go term analysis.(B)KEGG analysis.BP, Biology process, CC, cellular component, MF, molecular function

Fig.6 The GSEA findings of the c2 reference gene sets for the high expression of EPHX2 and low expression of EPHX2 groups (A)The EPHX2-lower expression group was mainly enriched in the gene sets labeled with Liver cancer subclass proliferation up, Liver cancer recurrence up and HCC progenitor Wnt up.(B)The EPHX2-higher expression group was mainly enriched in the gene sets labeled with Liver cancer subclass proliferation down, Liver cancer recurrence down and Liver cancer poor survival down.NES, normalized enrichment score

2.6 環(huán)氧化物水解酶2及相關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。正如圖7所示，EPHX2與羥基酸氧化酶1(hydroxyacid oxidase 1，HAO1)、丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine-glyoxylate aminotransferase，AGXT)、?；o酶A氧化酶1(acyl-coenzyme A oxidase 1，ACOX1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶κ1(recombinant glutathione S transferase κ 1，GSTκ1)、固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sterol carrier protein-2，SCP-2)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)以及細(xì)胞色素P450酶家族成員有相互作用(Fig.7A)。相關(guān)性結(jié)果表明，EXPH2與CAT相關(guān)性系數(shù)高達(dá)0.6，EXPH2與ACOX1相關(guān)性系數(shù)為0.56，EXPH2與HAO1相關(guān)性系數(shù)為0.55，EXPH2與SCP-2相關(guān)性系數(shù)為0.54(Fig.7B和Fig.7C)。以上結(jié)果高度提示，EPHX2可能與細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)有關(guān)。

Fig.7 The analysis of protein-protein interaction and correlation for EPHX2 and its co-expressed genes in HCC (A)The protein-protein interaction network map representing the network of EPHX2 and its co-expressed genes.The network model was generated using Cytoscape, focused on EPHX2 and its top 10 co-expressed gene.(B)Correlation for the co-expressed genes was analyzed by GEPIA(http://gepia2.cancer-pku.cn/#correlation).(C)Heat map shows the expression profile of the co-expressed genes for EPHX2 in 340 HCC tissues and 50 normal tissues.Red indicates that the gene has a higher expression; green indicates that the gene has a lower expression level

2.7 驗(yàn)證環(huán)氧化物水解酶2在肝癌組織中呈低表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證EPHX2在肝癌組織和肝癌細(xì)胞株中表達(dá)水平。結(jié)果顯示，EPHX2在9例肝癌患者癌組織中的表達(dá)水平較其在對(duì)照癌旁組織中顯著降低(0.161 ± 0.061vs1.312 ± 0.480，P=0.03)(Fig.8A)。EPHX2在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平顯著低于其在正常肝細(xì)胞中的表達(dá)水平(Fig.8B)。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步驗(yàn)證EPHX2在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在GSE14520數(shù)據(jù)集中，與正常肝組織相比，EPHX2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著降低(6.877 ± 0.089vs8.838 ± 0.044，P<0.01)(Fig.8C)。在GSE25097數(shù)據(jù)集中，與正常肝組織相比，EPHX2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著降低(7.641 ± 0.257vs12.50 ± 0.225，P<0.01)(Fig.8D)。在GSE22058數(shù)據(jù)集中，與正常肝組織相比，EPHX2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著降低(3234± 186.2vs5756 ± 126.3，P<0.01)(Fig.8E)。在GSE36376數(shù)據(jù)集中，與正常肝組織相比，EPHX2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著降低(9.136 ± 0.071vs10.35 ± 0.039，P<0.01)(Fig.8F)。

Fig.8 Validation for the expression level of EPHX2 in HCC (A)The mRNA expression level of EPHX2 in 21 HCC tumors and peritumor tissues by RT-qPCR.(B)The mRNA expression level of EPHX2 in HCC cell lines and normal hepatic cell line by RT-qPCR.RNA was extracted from tissues or cell lines and reverse transcribed into cDNA.Quantitative PCR was used to amplify the target genes.β-Actin was used as an internal control.Data were expressed as mean ± SD(n=3).The expression level of EPHX2 between normal and HCC tumor tissues in GSE14520(C), in GSE25097(D), in GSE22058(E), in GSE36376(F).*P<0.05,** P<0.01

3 討論

本研究通過(guò)GEO和MitoCarta數(shù)據(jù)集共篩選獲得15個(gè)在肝細(xì)胞癌中呈差異表達(dá)的線粒體相關(guān)基因，包括SLC25A47、KMO、AADAT、GSTZ1、OGDHL、ACSM5、HOGA1、ACACB、DHRS1、ACADS、ACSL1、SLC25A18、EPHX2、GLDC和TOMM40L。近年來(lái)，EPHX2在多種惡性腫瘤中的表達(dá)水平已有報(bào)道，例如肝細(xì)胞癌、前列腺癌、膽管癌和乳腺癌等[9-11]。Gui等[9]報(bào)道，在HuH-7和HepG2肝癌細(xì)胞系中，sEH表達(dá)水平顯著降低。Enayetallah等[10]報(bào)道，sEH在肝癌組織中表達(dá)缺失，且sEH在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平也顯著降低。Liu等[12]報(bào)道，EPHX2在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著降低。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，EPHX2在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平顯著降低，且EPXH2低表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后緊密相關(guān)，提示EPHX2可能能夠作為肝細(xì)胞癌患者預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物。此外，本文的研究結(jié)果表明，EPHX2在晚期肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于其在早期肝癌組織中的表達(dá)水平，提示EPHX2可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)。但也有研究報(bào)道，在膽管癌、精原細(xì)胞瘤中，sEH表達(dá)水平增高[10]。Wang等[11]報(bào)道，EPHX2在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著升高。我們推測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)間結(jié)果不一致性，可能與腫瘤類型和各研究團(tuán)隊(duì)的惡性腫瘤患者納入標(biāo)準(zhǔn)與研究方法不同等有關(guān)。

Khadir等[13]報(bào)道，在人原代前脂細(xì)胞和小鼠3T3-L1細(xì)胞分化過(guò)程中，EPHX2的表達(dá)水平升高。使用sEH抑制劑作用于分化的HT-29和Caco2細(xì)胞后，腸上皮細(xì)胞細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯降低[14]。Zhou等[15]報(bào)道，外源性的EET能夠抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)，EPHX2在高級(jí)別肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著低于其在中-低級(jí)別肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平。功能富集結(jié)果表明，在細(xì)胞組成方面，EPHX2主要分布在線粒體、過(guò)氧化物酶體等部位；分子功能主要與含硫化合物的結(jié)合、鐵離子的結(jié)合等有關(guān)；生物過(guò)程主要與有機(jī)酸代謝以及小分子代謝等有關(guān)。信號(hào)通路結(jié)果表明，EPHX2基因主要與補(bǔ)體途徑，花生四烯酸代謝等相關(guān)?；ㄉ南┧岽x是參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條關(guān)鍵途徑，它可被環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)環(huán)氧合酶途徑代謝為具有生物活性的二十烷類化合物，其中CYP450途徑可將花生四烯酸代謝為EETs。sEH是一種雙功能酶，具有環(huán)氧化物水解酶和脂磷酸酶雙重活性[13, 16, 17]。EETs主要由sEH代謝。Enayetallah等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，sEH表達(dá)缺失。已有研究報(bào)道，抑制sEH后，14，15-EET水平升高，最終促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]?；谝延形墨I(xiàn)報(bào)道和本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果，本文推測(cè)，EPHX2于線粒體中參與花生四烯酸代謝，其表達(dá)水平異常降低導(dǎo)致花生四烯酸代謝紊亂，引發(fā)線粒體內(nèi)脂代謝紊亂，最終導(dǎo)致線粒體功能異常，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450家族成員，包括CYP2C8，CYP2C9，CYP2B6，CYP2J2與EPHX2顯著相關(guān)。它們屬于花生四烯酸環(huán)氧酶，可將花生四烯酸代謝成4種具有生物活性的環(huán)氧二十碳三烯酸的區(qū)域異構(gòu)體。EETs可被sEH水解形成二羥基二十碳三烯酸[19]。已有研究表明，在一些腫瘤中，細(xì)胞色素P450家族成員表達(dá)水平上調(diào)，EETs生成增多，通過(guò)促進(jìn)血管生成，最終促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[18]；過(guò)表達(dá)CYP2J2或使用EET類似物升高EETs水平后，對(duì)高血壓、心力衰竭、心肌梗死等多種心血管疾病具有保護(hù)作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中，CYP2C8、CYP2C9、CYP2B6、CYP2J2與EPHX2的mRNA表達(dá)水平相關(guān)，且CYP2C8、CYP2C9、CYP2B6和CYP2J2在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平異常。結(jié)果高度提示，表達(dá)水平異常的花生四烯酸代謝途徑成員CYP2C8、CYP2C9、CYP2B6、CYP2J2和EPXH2，通過(guò)導(dǎo)致花生四烯酸代謝紊亂，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌脂代謝紊亂。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，EPHX2在HCC中呈低表達(dá)，推測(cè)其可能通過(guò)導(dǎo)致EETs累積，促進(jìn)肝細(xì)胞癌惡性發(fā)展，但具體的分子作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，EPHX2高表達(dá)組肝癌患者預(yù)后較好，提示EPHX2可以作為HCC預(yù)后評(píng)估的潛在腫瘤標(biāo)志物。