固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物油脂中香蘭素

徐彥輝

(安徽省公眾檢驗(yàn)研究院有限公司，合肥 230051)

植物油脂包括菜籽油、花生油、芝麻油等很多種類，是人們?nèi)粘Ｉ钪斜匦璧氖称?。隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)植物油的質(zhì)量安全也越來(lái)越關(guān)注。目前，我國(guó)還沒(méi)有關(guān)于植物油脂中香蘭素含量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

香蘭素，又名香草醛，化學(xué)名稱為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，是從蕓香科植物香莢蘭豆中提取的一種有機(jī)化合物。香蘭素是一種可食用的香精，用來(lái)增加食物的香氣，讓食物更加美味和清香；被廣泛應(yīng)用于食品中，但是過(guò)量攝入香蘭素會(huì)導(dǎo)致頭暈、惡心、呼吸困難，甚至損傷肝、腎[1]。目前GB 2760—2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中嚴(yán)格規(guī)定了香蘭素的使用限量，并且規(guī)定了植物油脂、動(dòng)物油脂等食品中不得添加。然而，不法商販為了達(dá)到以次充好、以假亂真的目的，在食品中違法添加此類物質(zhì)。“香精奶粉”、“香精油”等事件引起了廣泛關(guān)注。因此，基于日常監(jiān)管需要，建立相應(yīng)的檢測(cè)方法迫在眉睫。香蘭素的檢驗(yàn)方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[1]，植物油脂中香蘭素檢測(cè)研究較少。植物油脂中脂肪含量高，不易凈化，因此需要采用合適的提取、凈化方法才能準(zhǔn)確測(cè)定植物油脂中的香蘭素含量[2-5]。筆者選擇2%氫氧化鈉溶液作為提取溶劑，采用陰離子固相萃取柱進(jìn)行凈化，利用液相色譜-串聯(lián)色譜法測(cè)定植物油脂中香蘭素含量，方法快捷，測(cè)量精密度、準(zhǔn)確度滿足要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：4500 型，美國(guó)AB 公司。

去離子水發(fā)生器：Milli-Q 型，美國(guó)密理博公司。

電子天平：XP205 型，感量0.01 g，瑞士梅特勒托利多公司。

甲醇、甲酸、乙酸乙酯、環(huán)己烷：均為色譜純，美國(guó)天地試劑公司。

微孔濾膜：孔徑為0.22 μm。

陰離子固相萃取柱：PAX 型，500 mg/3 mL，艾杰爾公司。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))，德國(guó)Dr. Ehrensorfer 公司。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL，精確稱取香蘭素10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于-20℃冰箱中保存。根據(jù)實(shí)際需要用色譜流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成適合的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

植物油脂樣品：市售芝麻油、菜籽油、大豆油。實(shí)驗(yàn)用水為去離子高純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：Eclipse Plus C18RRHD 柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為甲醇，流量為0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：3.0 kV；去溶劑溫度：450 ℃；氣體流量：800 L/min；定性離子：m/z93；定量離子：m/z125；碰撞能量等參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)參數(shù)

1.3 樣品處理

稱取約1 g 植物油脂樣品(精確至0.01 g)于10 mL 離心管中，加入0.5 mL 二氯甲烷，再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液，渦旋提取10 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，移出上層水相；殘余物再用3 mL 2%氫氧化鈉溶液重復(fù)提取一次，合并水相。

用3 mL 甲醇、3 mL 2%氫氧化鈉溶液活化固相萃取柱，然后將提取液上固相萃取柱，調(diào)節(jié)流量為1～2 滴每秒，待全部溶液通過(guò)SPE 小柱后，依次用6 mL超純水、6 mL甲醇淋洗，棄去流出液；用6 mL 5%甲酸-甲醇洗脫目標(biāo)物，收集流出液。將流出液于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，? mL 初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 μm 濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由文獻(xiàn)可知，油脂的檢測(cè)方法中提取溶劑多為甲醇、乙腈及堿性溶液(例如2%氫氧化鈉溶液)等，凈化方式有直接提取濃縮、固相萃取柱凈化[6-9]。

分別以甲醇、乙腈、2%氫氧化鈉溶液作為植物油脂樣品中香蘭素的提取溶劑，試驗(yàn)比較了目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈雖然能夠有效地提取香蘭素，但同時(shí)會(huì)提取出較多的油脂，特別是采用溶劑提取后直接進(jìn)樣測(cè)定，提取液中殘留的油脂及其它干擾物質(zhì)較多，容易造成基質(zhì)效應(yīng)及質(zhì)譜儀污染。而且直接進(jìn)樣提取液中甲醇含量太高，進(jìn)樣后易造成溶劑擴(kuò)散，香蘭素的色譜峰形不對(duì)稱，特別是當(dāng)樣品中香蘭素含量較小時(shí)影響更加明顯。

當(dāng)采用2%氫氧化鈉溶液提取時(shí)，香蘭素在堿性環(huán)境中成離子狀態(tài)，在水溶液中的溶解性增強(qiáng)，能夠更好地與油脂分離，再采用陰離子固相萃取柱凈化，該凈化方式能夠有效去除油脂等其它干擾物質(zhì)，且使用初始流動(dòng)相消除了有機(jī)相比例過(guò)大造成的溶劑效應(yīng)影響，凈化回收率為85.6%～111%，能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)植物油脂中香蘭素含量。

提取過(guò)程中加入0.5 mL 二氯甲烷能夠讓油脂中非極性成分集中到二氯甲烷層，因?yàn)槎燃淄槊芏缺人?，?jīng)過(guò)渦旋離心后二氯甲烷和2%氫氧化鈉溶液會(huì)產(chǎn)生分層，這樣在提取過(guò)程中加入二氯甲烷能夠除去部分油脂中非極性物質(zhì)，有利于減輕固相萃取柱凈化壓力，同時(shí)能夠更好的消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

香蘭素分子結(jié)構(gòu)中含有芳香醛基，在堿性環(huán)境下易成陰離子狀態(tài)，因此可以采用陰離子固相萃取柱凈化，堿性提取溶液中離子狀態(tài)的香蘭素被陰離子固相萃取柱吸附后，再用純水和甲醇依次淋洗，能夠去除鹽分及脂質(zhì)色素等大分子物質(zhì)干擾，再用酸性甲醇進(jìn)行洗脫，氮?dú)獯蹈珊蠊┮合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析[10-15]。

選擇實(shí)驗(yàn)室常見的PAX 型陰離子固相萃取柱，為了確定合適的甲醇中甲酸濃度，用2%氫氧化鈉溶液配制10 ng/mL 香蘭素溶液，取5 mL 香蘭素溶液分別進(jìn)樣至3 根PAX 固相萃取柱(固相萃取柱已用3 mL 甲醇、3 mL 2%氫氧化鈉溶液活化)中，依次用6 mL 超純水、6 mL 甲醇淋洗，棄去流出液后，再分別用1%甲酸-甲醇、3%甲酸-甲醇、5%甲酸-甲醇各6 mL 進(jìn)行洗脫，將流出液于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，? mL 初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 μm 濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，香蘭素的回收率如圖1 所示。由圖1 可知，用5%甲酸-甲醇作為洗脫溶液，香蘭素的回收率最高，且接近100%，因此選擇5%甲酸-甲醇作為洗脫溶液。

圖1 不同濃度甲酸-甲醇洗脫時(shí)香蘭素的回收率

為了確定合適的洗脫體積，采用2%氫氧化鈉溶液配制10 ng/mL 香蘭素溶液，取5 mL 香蘭素溶液進(jìn)樣至已活化的PAX 固相萃取柱中，經(jīng)過(guò)6 mL超純水、6 mL 甲醇淋洗后，用5%甲酸-甲醇進(jìn)行洗脫，每2 mL 收集一次，即分別收集2、4、6、8、10 mL 時(shí)的分段流出液，將流出液于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑贸跏剂鲃?dòng)相定容后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，結(jié)果表明，當(dāng)洗脫體積為6 mL 時(shí)已完全洗脫，8 mL、10 mL 時(shí)的分段流出液中無(wú)香蘭素，故選擇下洗脫液用量為6 mL。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制1 μg/mL 的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Analyst軟件(美國(guó)AB SCIEX 公司)自動(dòng)優(yōu)化得到香蘭素的子離子、傳輸電壓及碰撞能量，具體參數(shù)見表2。

2.3.1 去溶劑溫度的優(yōu)化

去溶劑氣就是利用高溫的惰性氣體使噴霧毛細(xì)管尖端的流動(dòng)相溶劑蒸發(fā)并通過(guò)氣流帶走，從而使帶電霧滴變小，然后進(jìn)一步通過(guò)帶電霧滴間的碰撞不斷發(fā)生庫(kù)侖爆炸，最終由很小的帶電霧滴產(chǎn)生氣相離子[16-18]。較高的去溶劑溫度有助于提高溶劑、離子蒸發(fā)氣化，比較了在400、450、500、550、600 ℃去溶劑溫度，結(jié)果表明去溶劑溫度在450 ℃時(shí)香蘭素的響應(yīng)值最高，因此選擇香蘭素的去溶劑溫度為450 ℃。

2.3.2 去溶劑流量的優(yōu)化

物質(zhì)的離子化過(guò)程不僅跟去溶劑的溫度有關(guān)系，還與氣體流量有關(guān)系，只有在最優(yōu)條件下，物質(zhì)的離子化效率才會(huì)最高。分別考察了去溶劑流量為600、700、800 L/min 時(shí)香蘭素的響應(yīng)值，結(jié)果表明，去溶劑流量在800 L/min 時(shí)香蘭素的響應(yīng)值最高，去溶劑流量?jī)?yōu)化的結(jié)果為800 L/min。

2.3.3 電離電壓的優(yōu)化

物質(zhì)的離子化過(guò)程還與電離電壓有關(guān)系，整個(gè)離子化過(guò)程在電離電壓、去溶劑溫度以及去溶劑流量的共同作用下，使物質(zhì)離子化，形成帶電荷的離子，因此電離電壓也需要優(yōu)化。比較了香蘭素在1.0、2.0、3.0、4.0 kV 不同電離電壓下的響應(yīng)值，結(jié)果表明，電離電壓在3.0 kV 時(shí)香蘭素響應(yīng)值最高，因此電離電壓的優(yōu)化結(jié)果為3.0 kV。

最終選擇去溶劑溫度、去溶劑氣體流速及合適電離電壓的最優(yōu)條件分別為450 ℃、800 L/min及3.0 kV。圖2～圖4 為空白樣品、10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液、10 μg/kg 加標(biāo)樣品中香蘭素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。

圖2 空白樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

圖3 10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

圖4 10 μg/kg 加標(biāo)樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

2.4 線性方程、線性范圍與檢出限

配制1、2、5、10、50 μg/L 的香蘭素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2 儀器工作條件測(cè)定。以目標(biāo)物定量離子的色譜峰面積為y軸，香蘭素的質(zhì)量濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1～50 μg/L范圍內(nèi)，香蘭素的定量離子的色譜峰面積與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，線性方程為y=15 623x-3 125，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

以空白樣品添加不同濃度的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過(guò)前處理后按照優(yōu)化條件上機(jī)測(cè)定，以信噪比S/N為3 時(shí)對(duì)應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度為方法檢出限，并依據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算得出植物油脂中香蘭素的檢出限為1.0 μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取6 份植物油脂樣品，分別添加10、50 μg/kg 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品，按本方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果列于表3。由表3 可知，6 份樣品兩水平的平均加標(biāo)回收率為102.5%和98.4%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.1%和8.6%。該方法的精密度和準(zhǔn)確度滿足分析要求。

表3 油脂樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了檢測(cè)植物油脂中香蘭素含量的凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該法操作簡(jiǎn)便，定性、定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，可滿足實(shí)驗(yàn)室大量、快速分析的需求。