當歸四逆湯中細辛的藥效成分及其毒性研究Δ

余玖霞，梅 茜，許金國，蘇聯(lián)麟，毛春芹，謝 輝，陸兔林#

(1.南京市江寧中醫(yī)院藥學部，南京211100； 2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210046)

當歸四逆湯在國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中居第13首[1]。該方出自《傷寒論》，組成有當歸、桂枝、白芍、細辛、甘草、木通和大棗，原文記載，“手足厥寒，脈細欲絕者，當歸四逆湯主之”和“下利脈大者，虛也，以強下之故也。設(shè)脈浮革，因爾腸鳴者，屬當歸四逆湯”。該方具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈等作用，在臨床被用于痛經(jīng)、類風濕關(guān)節(jié)炎和糖尿病周圍神經(jīng)病變等疾病[2-8]?，F(xiàn)代藥理學研究結(jié)果表明，當歸四逆湯中的細辛除鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳和平喘等基于傳統(tǒng)功效藥理活性外，還有抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗抑郁、降壓和抗腫瘤等作用，其止痛機制可能與熱敏通道瞬時感受器電位香草酸受體1(TRPV1)被激活有關(guān)[9-11]。課題組前期研究結(jié)果表明，細辛是當歸四逆湯中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。歷代部分本草記載細辛“有小毒”，現(xiàn)代研究結(jié)果認為其毒性與劑量有關(guān)[12-13]。目前尚未見針對當歸四逆湯中細辛的藥效成分及毒性的相關(guān)報道。本研究通過建立細辛飲片的水煎液及當歸四逆湯的指紋圖譜，指認細辛有效成分，并結(jié)合小鼠急性毒性試驗驗證細辛及其復方的安全性，為進一步研究當歸四逆湯中細辛的作用機制及相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性ICR小鼠，購自南京市青龍山動物養(yǎng)殖場，許可證號為SCXK(浙)2019-0002。

1.2 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ZYX0071型超純水系統(tǒng)(南京漢隆實驗器材有限公司)；TD5001C型電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；MS-105D型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；H1650-W型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MG-H21S011型多功能電陶爐(廣東美的生活電器制造有限公司)；2.1 L砂鍋(江西舒雅陶瓷有限公司)。

1.3 藥品與試劑

當歸四逆湯的藥材均購自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，每味藥收集至少3個產(chǎn)地，總批次至少15批，前期研究[2]已確定優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陳建偉教授鑒定確定基源；根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質(zhì)基準的申報資料要求(征求意見稿)》，按照《中華人民共和國藥典：一部》(2020年版)將藥材炮制成合格飲片，隨機組成當歸四逆湯樣品23批；原料信息見表1。甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)；磷酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；其他試劑均為分析純；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

表1 當歸四逆湯藥材來源Tab 1 Source of the medicinal materials of Danggui Sini decoction

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流動相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(梯度洗脫，0～3 min，5%乙腈；3～10 min，5%～10%乙腈；10～15 min，10%～12%乙腈；15～30 min，12%～14%乙腈；30～35 min，14%～17%乙腈；35～40 min，17%～19%乙腈；40～50 min，19%～25%乙腈；50～75 min，25%～45%乙腈；75～90 min，45%～70%乙腈；90～92 min，70%～95%乙腈；92～95 min，95%～5%乙腈)；體積流量：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

課題組經(jīng)前期研究已得15批細辛飲片水煎液、23批當歸四逆湯和1批缺細辛陰性水煎液，分別取上述液體3 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理，放冷，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得細辛飲片供試品溶液、當歸四逆湯供試品溶液和陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

課題組前期研究已做方法學考察[2]，結(jié)果表明，儀器精密度良好，該方法重復性良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 細辛飲片指紋圖譜的建立

取15批細辛飲片供試品溶液按色譜條件進行測定，記錄色譜圖。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012A)軟件，以S1為參照峰，采用平均數(shù)法，進行多點校正和色譜峰匹配，得到細辛飲片高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜疊加圖，共確認11個色譜峰，見圖1—2。

圖1 細辛飲片水煎液HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint spectrum of asarum water decoction

圖2 細辛飲片水煎液HPLC指紋圖譜共有模式圖Fig 2 The common pattern of HPLC fingerprint spectrum of asarum water decoction

2.5 細辛飲片指紋圖譜的相似度評價

通過評價系統(tǒng)軟件，計算指紋圖譜相似度，結(jié)果顯示，15批細辛飲片指紋圖譜相似度均>0.90，表明同產(chǎn)地不同批次細辛藥材炮制得到的細辛飲片主要物質(zhì)群相似度較高，細辛飲片質(zhì)量穩(wěn)定均一，見表2。

表2 15批細辛飲片水煎液HPLC指紋圖譜相似度Tab 2 Similarity of HPLC fingerprint spectrum of 15 batches of asarum water decoction

2.6 當歸四逆湯樣品指紋圖譜的建立

取23批當歸四逆湯供試品溶液按色譜條件進行測定，記錄色譜圖。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012A)軟件，以S1為參照峰，采用平均數(shù)法，進行多點校正和色譜峰匹配，得到當歸四逆湯指紋圖譜疊加圖相似度均>0.90，可見其主要物質(zhì)群相似度高、穩(wěn)定性好，其中細辛的藥效成分也在復方中有所體現(xiàn)，可進一步對細辛飲片和當歸四逆湯的相關(guān)性進行研究確定。23批當歸四逆湯樣品共有模式圖結(jié)果見圖3。

2.7 細辛飲片、細辛飲片陰性制劑與當歸四逆湯樣品相關(guān)性研究

取細辛飲片供試品溶液、當歸四逆湯供試品溶液和陰性對照溶液進行測定，記錄色譜圖。分別將上述供試品溶液的色譜圖進行疊加比較，分析當歸四逆湯樣品指紋圖譜的色譜峰歸屬。當歸四逆湯樣品指紋圖譜中共有7個峰來自細辛飲片，采用混合對照品指認了其中2個成分：4號峰阿魏酸、23號峰細辛脂素，見圖4。推測包括阿魏酸、細辛脂素在內(nèi)的這7個成分是當歸四逆湯中細辛發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)群。

圖4 當歸四逆湯樣品、細辛飲片水煎液和細辛飲片陰性水煎液色譜圖Fig 4 Chromatograms of sample of Danggui Sini decoction, asarum water decoction and negative asarum water decoction

2.8 當歸四逆湯及細辛飲片單煎急性毒性試驗

取禁食(不禁水)12 h的雄性ICR小鼠42只，體重20～22 g，隨機均分為細辛單煎組、復方組，每組21只。單煎組小鼠以最大濃度0.978 4 g/mL，最大給藥劑量0.5 mL/10 g灌胃給藥；復方組小鼠以最大濃度0.622 8 g/mL，最大給藥劑量0.5 mL/10 g灌胃給藥，均1日2次。連續(xù)觀察2周，記錄受試小鼠活動、行為及死亡等情況，死亡小鼠及時進行尸檢。實驗結(jié)束后，對所有小鼠進行大體解剖，觀察心、肝、脾、肺及腎等臟器和組織的體積、顏色和質(zhì)地等變化，并拍照稱重。

按上述劑量灌胃給藥的小鼠，在給藥后當日均見活動減少，糞便棕褐色、質(zhì)地較軟但成形，次日恢復正常。小鼠體重增長正常，毛色、膚色和呼吸正常，鼻、眼及口腔未出現(xiàn)異常分泌物，2周內(nèi)未見死亡。實驗結(jié)束后經(jīng)大體解剖，肉眼見心、肝、脾、肺及腎等臟器和組織在體積、顏色和質(zhì)地等方面無異常改變，小鼠體重見圖5—6。故當歸四逆湯1日2次灌胃給藥的小鼠最大給藥量為31.14 g/kg，細辛單煎組1日2次灌胃給藥的小鼠最大給藥量為48.92 g/kg。

A.體重；B.臟器重量A. weight; B. weight of organs

A.體重；B.臟器重量A. weight; B. weight of organs

3 討論

經(jīng)典名方的開發(fā)研究要求從藥材源頭對其進行質(zhì)量控制及溯源分析，本實驗通過對當歸四逆湯中細辛飲片、當歸四逆湯樣品指紋圖譜進行研究，從飲片到當歸四逆湯樣品的物質(zhì)群進行分析，對當歸四逆湯中細辛的藥效成分進行初步確定，通過相關(guān)性研究，對其進行整體化、過程化的質(zhì)量控制。HPLC指紋圖譜符合中醫(yī)藥整體性的特點，能較全面地反映所含成分信息，尤其適用于多成分、多靶點的中藥分析，可較好地體現(xiàn)中藥成分的復雜性和相關(guān)性，在中藥質(zhì)量控制、有效成分研究和作用機制研究等多方面發(fā)揮重要作用[14-15]；能夠全面表征中藥及制劑的整體化學信息，適用于闡釋經(jīng)典名方“藥材-飲片-方劑”傳遞規(guī)律。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當歸四逆湯原料藥材細辛及其飲片均指認14個色譜峰，根據(jù)色譜峰峰形及位置可知細辛主要藥效物質(zhì)群在炮制過程中未造成丟失，其藥效物質(zhì)群可以較好地從藥材傳遞到飲片。本研究結(jié)果表明，當歸四逆湯細辛飲片的水煎液指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度>0.90，表明同產(chǎn)地不同批次細辛飲片的主要物質(zhì)群相似度較高。當歸四逆湯樣品指紋圖譜共確認25個色譜峰，其中1號峰、4號峰、19號峰、20號峰、23號峰、24號峰和25號峰歸屬于細辛飲片，經(jīng)對照品指認出4號峰為阿魏酸、23號峰為細辛脂素，說明當歸四逆湯中細辛的物質(zhì)群可追溯到飲片。結(jié)合當歸四逆湯飲片、樣品指紋圖譜研究和共有峰歸屬研究，7個色譜峰歸屬于細辛，占當歸四逆湯樣品總峰面積的14.61%。綜上所述，當歸四逆湯制備工藝較合理，其中細辛飲片的主要藥效物質(zhì)群能夠從“藥材-飲片-方劑”逐級進行傳遞，且物質(zhì)群歸屬關(guān)系清晰明確。

自古有“細辛不過錢”的說法?，F(xiàn)代研究結(jié)果證明，細辛含有的馬兜鈴酸Ⅰ具有腎毒性、致癌和致肝損傷等作用，因此使用前需對馬兜鈴酸Ⅰ進行限量檢測，檢查合格后的細辛藥材經(jīng)炮制加工成飲片。歷代關(guān)于細辛的炮制方法有凈制、切制、加熱炮制及加輔料炮制等，而現(xiàn)代炮制方法相對單一。近年來研究結(jié)果表明，炒制、堿制、酒制和低溫超微粉碎等方法可有效降低細辛毒性，增強臨床應(yīng)用安全性[16]。利用小鼠進行急性毒性試驗?zāi)軌虼_定中毒作用方式及反應(yīng)，為亞急性毒性試驗觀察指標、劑量分組等提供參考[17-18]；至今仍被廣泛用于測試各種毒性中藥的作用，如鉤藤堿[19]、新鮮唐古特大黃莖[20]和枸杞子[21]等。本研究對小鼠進行了1日2次灌胃給藥的最大給藥量試驗(當歸四逆湯組為31.14 g/kg、細辛單煎組為48.92 g/kg)，給藥后2周內(nèi)均未見小鼠有明顯異常情況和死亡，實驗結(jié)束后經(jīng)大體解剖，肉眼見心、肝、脾、肺及腎等臟器和組織在體積、顏色和質(zhì)地等方面無異常改變。若當歸四逆湯按1 868.4 g細辛生藥量/60 kg(即31.14 g/kg)計算，則小鼠劑量為臨床用量的622.8倍[(1 868.4 g/kg)/(3 g/60 kg)]；細辛單煎按2 935.2 g生藥量/60 kg(即48.92 g/kg)計算，則小鼠劑量為臨床用量的978.4倍[(2 935.2 g/60 kg)/(3 g/60 kg)]，表明當歸四逆湯、細辛臨床應(yīng)用安全性較高。