miR-301a對小鼠壞死性小腸結(jié)腸炎的影響及作用機(jī)制

鄒大軍，胡福德，周啟立，徐曉青

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因，而幸存的嬰兒也常出現(xiàn)嚴(yán)重的后遺癥，包括短腸綜合征、膽汁淤積和神經(jīng)發(fā)育受損［1］。NEC的病理生理機(jī)制仍不完全清楚。研究表明，在潰瘍性結(jié)腸炎的組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的miRNAs［2］。miRNAs在消化系統(tǒng)疾病中扮演關(guān)鍵角色［3］。miR-301a作為重要的miRNA已被視為結(jié)腸癌、胃癌的生物活性標(biāo)志物［4-5］。然而，miR-301a在NEC中的作用尚不清楚。因此，本研究通過檢測miR-301a及相關(guān)炎性因子在小鼠NEC中的表達(dá)水平，探索miR-301a在NEC疾病進(jìn)展中的可能作用及機(jī)制，為NEC的臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級10日齡BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量4.2～8.0 g，平均（6.0±1.3）g，購自承德醫(yī)學(xué)院動物研究中心（動物生產(chǎn)許可證號：SYXK冀2017-001），飼養(yǎng)在濕度45%～65%，溫度28～30℃的環(huán)境中。miR-301a拮抗劑（序列：mGmCmUmUmUmGmAmCmAmAmUmAmCmUmAmUmUmGm CmAmCmUmG）購自中國武漢金凱瑞生物工程有限公司。腫瘤壞死因子（TNF）-α（貨號：ml059766）、白細(xì)胞介素（IL）-6（貨號：ml63159）和IL-8（貨號：ml058632）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。兔抗人胱天蛋白酶（Caspase）-1抗體（貨號：22915-1-AP）購自美國Proteintech Group；兔抗人β-actin抗體（貨號：AC038）購自武漢ABclonal公司。Esbilac幼犬配方奶粉購自美國PetAg公司。QT-MIX-3型缺氧箱購自長沙長錦科技有限公司。Trizol試劑（貨號：15596026）購自賽默飛公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：1708890）、SYBR Premix Ex TaqⅡ系統(tǒng)（貨號：1725124）、Image Lab 3.0軟件均購自伯樂公司。HE染色試劑盒（貨號：B0001 B0002）購自武漢博爾夫生物科技有限公司。細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號：11684817910）購自羅氏公司。RIPA緩沖液（貨號：BL504A）購自北京蘭杰柯科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 60只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、NEC組、miR-301a拮抗劑組，每組20只。對照組小鼠與母鼠同籠，由母鼠喂養(yǎng)；NEC組和miR-301a拮抗劑組采用Esbilac幼犬配方奶粉每天經(jīng)口插管喂養(yǎng)4次，起始喂食量為0.1 mL，逐漸增加至0.25 mL。每天早晚2次喂養(yǎng)后將小鼠放入缺氧箱（5%O2、95%N2）持續(xù)10 min，隨即打開缺氧箱，將其置入冰箱冷藏，給予4℃刺激持續(xù)10 min，連續(xù)5 d，誘導(dǎo)NEC［6］。miR-301a拮抗劑組誘導(dǎo)NEC的同時(shí)給予miR-301a拮抗劑（20μL/d）喂養(yǎng)5 d。

1.3 取材 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察小鼠的一般情況，測體質(zhì)量。最后1次冷刺激后12 h，小鼠在麻醉下心臟采血，分離保存血清，取出十二指腸下段至直腸上段腸組織，保存一半新鮮組織，一半組織甲醛固定，石蠟包埋。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測miR-301a和Caspase-1 mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑從小腸組織中分離出總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用SYBR Premix Ex TaqⅡ系統(tǒng)行PCR。miR-301a引物：上游5′-ACACTCCAGCTGGGGCTCTGACTTTATTGC-3′，下 游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTAGT-3′；Caspase-1引物：上游5′-ATGGCCGACAAGGTCCTGAGG-3′，下游5′-GACATGATCGCACAGGTCTCGTG-3′；U6引物：上 游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR反應(yīng)條件：94℃2 min；94℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.5 HE染色和損傷評分 將上述石蠟包塊進(jìn)行連續(xù)5μm切片，用二甲苯脫蠟、梯度乙醇至脫水后，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察組織切片的病理改變。采用雙盲法對腸道組織進(jìn)行損傷評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，腸壁結(jié)構(gòu)正常，上皮完整；1分，輕度的黏膜下和（或）固有層分離；2分，輕度的黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫；3分，重度黏膜下和（或）固有層腫脹分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫，局部絨毛脫落；4分，腸絨毛消失伴腸壞死。

1.6 ELISA檢測血清TNF-α、IL-6和IL-8的含量 使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量。通過分光光度法測定450 nm處吸光度（A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.7 TUNEL染色測定小鼠腸組織的細(xì)胞凋亡情況 組織切片，按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，每張切片選擇5個(gè)染色典型的不重疊的高倍視野，計(jì)數(shù)凋亡的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.8 Western blot檢測Caspase-1蛋白表達(dá)水平 將獲取的腸道組織溶解在RIPA緩沖液中，并以14 000 r/min離心10 min。離心后，用BCA測定總蛋白質(zhì)濃度。在12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯膜上，將膜與Caspase-1（1∶1 250）和β-actin（1∶500）一抗在4℃冰箱孵育過夜。在TBST中洗膜后，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，漂洗后ECL顯影。最后用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較行Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)改變表現(xiàn)及體質(zhì)量 入組實(shí)驗(yàn)時(shí)3組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組小鼠每天進(jìn)食正常，體質(zhì)量穩(wěn)定增長，結(jié)束時(shí)體質(zhì)量增長最明顯；NEC組小鼠從第2天開始相繼出現(xiàn)精神萎靡、腹脹、進(jìn)食障礙，體質(zhì)量較實(shí)驗(yàn)前明顯減輕，并出現(xiàn)血便。與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組小鼠上述表現(xiàn)出現(xiàn)較晚，且癥狀較輕，體質(zhì)量下降趨勢變緩，見圖1。

2.2 各組腸組織病理形態(tài)變化及損傷評分 HE病理染色結(jié)果顯示對照組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸道絨毛及上皮完整；NEC組小鼠腸壁全層大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜層、黏膜下層及固有層可見明顯的分離水腫，絨毛變性水腫，部分壞死；miR-301a拮抗劑組小鼠腸黏膜下和固有層腫脹分離程度及肌層水腫程度減輕，絨毛脫落情況及壞死也減輕，見圖2。與對照組（0.7±0.3）相比，NEC組（3.4±0.7）小鼠腸組織損傷評分升高，而miR-301a拮抗劑組（1.2±0.5）小鼠腸組織損傷評分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=20，F(xiàn)=172.000，P＜0.01）。

2.3 各組小鼠血清中炎性因子表達(dá)水平比較 與對照組相比，NEC組小鼠中TNF-α、IL-6和IL-8含量升高（P＜0.05）；與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8含量下降（P＜0.05），見圖3A～C。

2.4 各組腸組織細(xì)胞凋亡水平 與對照組相比，NEC組腸組織凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組腸組織凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖3D。

Fig.2 Variations of HE staining in 3 groups of mice(HE staining,×200)圖2 3組小鼠腸組織病理改變（HE染色，×200）

Fig.3 Comparison of inflammatory factor expression and apoptosis level in intestinal tissue between three groups of mice圖3 3組小鼠腸組織炎性因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡水平比較

2.5 各組腸組織中miR-301a和Caspase-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，NEC組miR-301a和Caspase-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，與NEC組相比，miR-301a拮抗劑組miR-301a和Caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），見圖4A、B。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，NEC組Caspase-1的蛋白水平明顯升高，miR-301a拮抗劑組降低了上述指標(biāo)的表達(dá)水平，見圖4C。

Fig.4 Comparison of miR-301a and Caspase-1 protein expression levels in intestinal tissue between the three groups of mice圖4 3組小鼠腸組織miR-301a和Caspase-1 mRNA及Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

NEC是新生兒胃腸道炎癥死亡的重要原因。研究表明炎癥級聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致NEC發(fā)展的途徑［7］，該炎癥理論涉及到大量的炎性因子、受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它們通過激活腸道免疫反應(yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腸壁損傷和壞死［8］。在潰瘍性結(jié)腸炎組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的miRNA，miRNA在炎癥中的作用尤其重要，是介導(dǎo)炎癥與組織修復(fù)的重要因素。研究表明，miRNA在能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化中起重要作用，對這些功能的干擾會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥的增加以及細(xì)胞修復(fù)能力的下降，這些在NEC的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要［9］。miR-124通過靶向Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶1（ROCK1）來抑制Toll樣受體9（TLR9）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腸道細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致NEC的進(jìn)展［10］。研究表明，miR-301a通過誘導(dǎo)炎癥性腸病中的IL-17A和TNF-α來促進(jìn)腸黏膜炎癥［11］。然而，miR-301a在NEC中的作用尚不清楚。

多項(xiàng)研究已經(jīng)證明，由miRNA介導(dǎo)的RNA通過各種干擾途徑參與調(diào)節(jié)眾多免疫過程，進(jìn)而在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用［12］。Chen等［13］對NEC的細(xì)胞和動物模型的研究表明，miR-146a-5p的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)NEC中NLRP3炎性小體下游炎性因子和氯通道蛋白4（CLIC4）的表達(dá)，進(jìn)而加重NEC的腸道炎癥損傷。另有研究表明，在腸道炎癥組織中高表達(dá)的miR-301a可以降低B細(xì)胞易位基因1（BTG1）的表達(dá)，從而降低上皮細(xì)胞的完整性，促進(jìn)小鼠結(jié)腸的炎癥以及刺激腫瘤的發(fā)生［14］。Caspase-1作為新興的生物標(biāo)志物在多種疾病中表達(dá)升高，同樣也是NEC的常用監(jiān)測因子，用于NEC的病情評估［15-16］。本研究表明，miR-301a在NEC小鼠的腸組織中高度表達(dá)，同時(shí)伴隨Caspase-1的表達(dá)升高，使用miR-301a拮抗劑干預(yù)后，小鼠腸組織的病理炎癥等級降低，Caspase-1的表達(dá)下降，這表明miR-301a在NEC的炎癥進(jìn)展中起了重要作用。

研究表明，對于NEC患兒，IL-8、IL-10和TNFα可用作早期診斷的生物標(biāo)志物［17-19］。IL-8作為中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的化學(xué)吸引劑，其腸道表達(dá)與NEC相關(guān)，IL-8可用作進(jìn)行NEC術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)評估的標(biāo)記，手術(shù)前6 h內(nèi)獲得的IL-8水平與手術(shù)期間觀察到的實(shí)際疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而IL-8水平的升高與60 d死亡率有關(guān)［20］。本研究結(jié)果證實(shí)，NEC組腸組織miR-301a高表達(dá)，同時(shí)伴隨TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)增加以及細(xì)胞凋亡率升高，而給予miR-301a拮抗劑治療后，炎性因子的表達(dá)均降低，細(xì)胞凋亡率下降，這表明miR-301a可能是NEC的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-301a通過促進(jìn)腸道組織細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致NEC的進(jìn)展，而miR-301a可能是NEC的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。但由于NEC發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，miR-301a促進(jìn)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致NEC進(jìn)展的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。此外，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，目前也僅在小鼠模型中觀察到了miR-301a對于NEC的促進(jìn)作用，而miR-301a增加TNF-α、IL-6、IL-8和細(xì)胞凋亡水平的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。