心理應(yīng)激致血漿外泌體miR-184-3p抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移功能的作用分析

蘇曉雪，黎靜，趙威，劉林玲，劉素君，農(nóng)騰川，譚機永，△

慢性應(yīng)激可通過導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，從而誘發(fā)和加劇心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展［1］。應(yīng)激相關(guān)內(nèi)皮功能障礙是嚴重心血管疾病的早期危險因素之一［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激會導(dǎo)致大鼠血管內(nèi)皮細胞功能紊亂及線粒體損傷［3］，然而其損傷機制尚未明確。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）能夠參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的生物學功能［4］。心理應(yīng)激可導(dǎo)致血漿外泌體miRNA表達譜改變［5］。本研究通過探討心理應(yīng)激后血漿外泌體miR-184-3p對血管內(nèi)皮細胞功能的影響，挖掘心理應(yīng)激相關(guān)疾病早期診斷的分子標志物，旨在闡明心理應(yīng)激誘發(fā)和加劇心血管疾病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量約20 g，標準飼料喂養(yǎng)，購自廣西醫(yī)科大學動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2020-0003；小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（MPVEC）購自上海奧陸生物科技有限公司；過表達陰性對照物（NC mimic）、miR-184-3p過表達類似物（miR-184-3p mimic）、riboFECT Cp Transfection Kit（166T）、外泌體提取試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BeyoClick?EdU-594細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SYBR Green PCR Master Mix及Trizol購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 動物學實驗

1.2.1 分組及應(yīng)激處理 將60只小鼠通過隨機數(shù)字表法分為對照組（30只）和心理應(yīng)激組（30只）。心理應(yīng)激組給予21 d慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激刺激。每天隨機給予1種應(yīng)激刺激，應(yīng)激源包括：禁水24 h、40℃熱水游泳5 min、束縛實驗1 h、夾尾實驗5 min、濕墊料24 h、夜間光照12 h、水平搖床10 min。除了喂食和鼠籠清理以外，對照組不做任何應(yīng)激處理。第21天應(yīng)激結(jié)束后，每組各隨機抽取11只小鼠進行行為學實驗來分析心理應(yīng)激模型效果。

1.2.2 曠場實驗 模型建立后對小鼠進行曠場實驗。曠場實驗箱由邊長50 cm、高40 cm開口向上的不透明結(jié)構(gòu)制成，側(cè)壁和底面為白色。在底面正中心位置畫一個邊長為25 cm的正方形中心區(qū)域。實驗過程中，將小鼠放置在實驗箱的角落，通過攝像機記錄5 min內(nèi)小鼠停留在中心區(qū)域的總時間。

1.2.3 高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮實驗可檢測與焦慮相關(guān)的行為變化。由2個不透明的相對閉合臂和2個相對開放臂（50 cm×10 cm×50 cm）構(gòu)成，距離地面50 cm，呈現(xiàn)“十”字狀。實驗過程中，將小鼠置于中央?yún)^(qū)域（邊長10 cm的正方形），通過攝像機記錄5 min內(nèi)小鼠在開放臂停留時間。

1.2.4 強迫游泳實驗 實驗過程中，將小鼠放入水溫（25±2）℃、水深25 cm的透明桶內(nèi)。通過攝像機記錄8 min內(nèi)小鼠的行為，其中前2 min為適應(yīng)時間，統(tǒng)計后6 min的漂浮不動時間。

1.2.5 提取血漿外泌體及形態(tài)觀察 行為學實驗結(jié)束后，采用眼球取血法收集全部小鼠全血，4℃、2 000×g離心5 min，收集上清液。采用外泌體提取試劑盒提取血漿外泌體，用PBS溶解沉淀，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將上述方法提取的血漿外泌體在PBS中重懸，滴加在碳覆膜銅網(wǎng)上吸附90 s，醋酸鈾染液負染30 s，置于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.2.6 qPCR檢測血漿外泌體中miR-184-3p的相對表達量 采用Trizol法提取血漿外泌體中的RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量qPCR檢測miRNA表達水平，每個樣本重復(fù)測量3次。cel-miR-39-3p上游引物5′-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3′，mmu-miR-184-3p上游引物5′-CCTGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3′。采用試劑盒提供通用下游引物，以cel-miR-39-3p為外參，通過2-ΔΔCt法計算mmu-miR-184-3p的相對表達量。

1.3 細胞學實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將MPVEC用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待生長融合度至80%時，將該細胞以1×105個/孔接種至6孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，次日進行干預(yù)和轉(zhuǎn)染。在外泌體干預(yù)實驗中，用BCA試劑盒對PBS中的外泌體進行定量。分別取20μg對照組和心理應(yīng)激組小鼠血漿外泌體轉(zhuǎn)入MPVEC，分為陰性對照（C-EXO）組和干預(yù)（S-EXO）組，干預(yù)24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。細胞轉(zhuǎn)染實驗中，分別將NC mimics及miR-184-3p mimic轉(zhuǎn)染至MPVEC，分為陰性對照（NC mimic）組和miR-184-3p mimic組，嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求操作，轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 劃痕實驗 干預(yù)內(nèi)皮細胞24 h后，用直尺和10μL的吸頭垂直于6孔板進行劃痕，做等間距的3條豎線，用PBS清洗去除劃下的細胞后加入無外泌體血清培養(yǎng)基，用普通光學顯微鏡記錄0 h和12 h時細胞的遷移情況。通過Image J計算劃痕遷移率，劃痕遷移率=（0 h劃痕面積-12 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.3.3 EdU增殖染色實驗 干預(yù)內(nèi)皮細胞24 h后，加入EdU反應(yīng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h標記細胞，加入Click反應(yīng)液室溫避光孵育30 min染色細胞質(zhì)，Hoechst 33342溶液室溫避光孵育10 min染色細胞核，最后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞。通過Image J軟件計算細胞增殖率，細胞增殖率=Azide596紅染細胞數(shù)/Hoechst藍染細胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學檢測結(jié)果 曠場實驗結(jié)果表明，心理應(yīng)激組小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域停留的時間顯著短于對照組（P＜0.01）；高架十字迷宮實驗結(jié)果表明，心理應(yīng)激組小鼠在開放臂停留時間與對照組比較顯著縮短（P＜0.05）；強迫游泳實驗結(jié)果表明，心理應(yīng)激組小鼠在水面漂浮不動的時間顯著長于對照組（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Changes of behavioral test indexes in two groups of mice表1 2組小鼠行為學檢測指標的變化（n=11，s，±s）

Tab.1 Changes of behavioral test indexes in two groups of mice表1 2組小鼠行為學檢測指標的變化（n=11，s，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組心理應(yīng)激組t曠場實驗（中央?yún)^(qū)域停留時間）12.18±5.41 6.36±1.32 3.454＊＊高架十字迷宮實驗（開放臂停留時間）114.50±12.51 104.50±8.94 2.176＊游泳實驗（漂浮不動時間）241.70±18.70 313.50±8.28 11.650＊＊

2.3 血漿外泌體miR-184-3p水平分析 qPCR結(jié)果表明，與對照組比較，心理應(yīng)激組血漿外泌體中

2.2 超微電鏡分析外泌體形態(tài) 在超微透射電鏡下觀察，可見清晰完整的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為30～200 nm。見圖1。miR-184-3p水 平 顯 著 升 高（1.25±0.13vs.1.00±0.01，t=3.178，P＜0.05）。

Fig.1 Morphology and structure of plasma exosomes under ultratransmission electron microscopy(×15 000)圖1 超微透射電鏡下血漿外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)（×15 000）

2.4 血漿外泌體對血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，與C-EXO組相比，S-EXO組的血管內(nèi)皮細胞遷移率顯著降低（P＜0.01），見圖2，表2。EdU增殖染色結(jié)果顯示，與C-EXO組相比，S-EXO組細胞陽性增殖率顯著下降（P＜0.01），見圖3，表2。

Fig.2 Scratch test of vascular endothelial cells after plasma exosome intervention(×10)圖2 血漿外泌體干預(yù)后血管內(nèi)皮細胞劃痕實驗（×10）

Tab.2 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表2 2組血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

Tab.2 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表2 2組血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01。

組別C-EXO組S-EXO組t劃痕遷移率57.53±8.66 4.31±2.64 10.180＊＊EdU增殖率69.67±1.53 53.33±5.51 4.950＊＊

Fig.3 EdU staining of vascular endothelial cells after plasma exosome intervention(×20)圖3 血漿外泌體干預(yù)后血管內(nèi)皮細胞EdU增殖染色情況（×20）

2.5 miR-184-3p對血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，相比NC mimic組，miR-184-3p mimic組的血管內(nèi)皮細胞遷移能力顯著下降（P＜0.05），見圖4，表3。EdU增殖染色結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-184-3p mimic組的血管內(nèi)皮細胞增殖率顯著下降（P＜0.05），見圖5，表3。

Fig.4 Effects of miR-184-3p on the scratch experiment of vascular endothelial cells(×20)圖4 miR-184-3p對血管內(nèi)皮細胞劃痕實驗的影響（×20）

Tab.3 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表3 2組血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表3 2組血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05。

組別NC mimic組miR-184-3p mimic組t EdU增殖率55.80±1.91 45.60±4.62 3.534＊劃痕遷移率58.30±6.33 42.97±1.86 4.025＊

3 討論

心血管疾病是全球高發(fā)性疾病，其發(fā)病率和病死率不斷增加，心理應(yīng)激已被證明與心血管疾病存在密切的聯(lián)系［6］。本實驗通過構(gòu)建具有多種刺激因素的慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激小鼠模型，希望能借此模擬人類社會壓力。筆者通過曠場實驗、高架十字迷宮實驗及強迫游泳實驗等實驗分析小鼠在心理應(yīng)激后的行為學變化，結(jié)果表明心理應(yīng)激后小鼠對未知事物的探索行為顯著減少，在應(yīng)激環(huán)境中表現(xiàn)出絕望抑郁狀態(tài)，提示本研究心理應(yīng)激模型建立成功。相關(guān)研究結(jié)果也證實，心理應(yīng)激后實驗動物有焦慮和抑郁類行為改變［7］。

血管內(nèi)皮細胞對維持血管正常生理功能有重要作用，其作為血管壁的重要組成部分與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。血管內(nèi)皮的完整性受到內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響，血管內(nèi)皮細胞的異常增殖和凋亡是動脈粥樣硬化性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)［9］。血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力的下降可抑制血管內(nèi)膜的新生，妨礙損傷后修復(fù)和血管生成［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激源性血漿外泌體能夠降低血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖能力，影響了血管內(nèi)皮細胞的正常生理功能，提示心理應(yīng)激可能通過外泌體途徑損傷血管內(nèi)皮細胞，這可能是心理應(yīng)激誘發(fā)和加劇心血管疾病的重要機制。

Fig.5 Effects of miR-184-3p on proliferation and EdU staining of endothelial cells（×20）圖5 miR-184-3p對血管內(nèi)皮細胞EdU增殖染色的影響（×20）

外泌體是一類由細胞分泌的胞外囊泡，可通過傳遞miRNAs等生物分子介導(dǎo)細胞間信號通訊［11］。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥可導(dǎo)致大鼠血漿外泌體特異性miRNAs顯著升高，這些miRNAs可能是診斷和預(yù)測壓力相關(guān)性精神疾病的生物標志物［5］。已有研究證實，外泌體miRNAs可以通過促進血管生成、維持內(nèi)皮細胞穩(wěn)定性、抑制內(nèi)皮遷移和增殖等病理生理過程來影響心血管病的發(fā)生發(fā)展［12］。例如，外泌體miR-155表達下調(diào)可以抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移［13］；miR-26a-5p表達下調(diào)可以促進冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞凋亡［14］；低表達的miR-186-5p可減輕炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮細胞的損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激組小鼠血漿外泌體可以顯著抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移功能，同時心理應(yīng)激小鼠血漿外泌體中miR-184-3p顯著升高。進一步將血管內(nèi)皮細胞miR-184-3p過表達后，能夠顯著抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移功能。相關(guān)研究也證實，高表達的miR-184-3p能夠通過抑制肺血管發(fā)育來破壞正常的肺發(fā)育和功能［16］；局部對角膜注射miR-184可以顯著降低角膜新生重建、抑制增殖和遷移等［17］。這些研究結(jié)果進一步證實miR-184-3p具有抑制正常血管內(nèi)皮細胞功能和抗血管生成的特性。miRNAs可在轉(zhuǎn)錄后水平對其靶基因的表達發(fā)揮負性調(diào)控作用［18］。miR-184能夠直接靶向促血管生成因子Gata2（FOG2）來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，從而影響血管的生成［17］。因此筆者推測，心理應(yīng)激后血漿外泌體可能通過介導(dǎo)miR-184-3p靶向調(diào)節(jié)VEGF信號通路相關(guān)基因表達來影響血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移功能。

綜上所述，心理應(yīng)激可能通過外泌體途徑導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的miR-184-3p的表達上調(diào)，靶向調(diào)節(jié)VEGF信號通路相關(guān)基因的表達，從而抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移功能，這可能是心理應(yīng)激誘發(fā)心血管疾病的重要原因。這也提示血漿外泌體miRNA-184-3p有可能是心理應(yīng)激相關(guān)疾病早期診斷的重要分子標志物。