γ-分泌酶抑制劑在肺纖維化上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

韓姣，王華兵，徐玲文，董芳

肺纖維化預(yù)后極差，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［1-2］。特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種嚴(yán)重的、發(fā)展性的、原因不明的纖維間質(zhì)性肺炎，多數(shù)患者預(yù)后不良［1］。目前，間質(zhì)性肺疾病、肺結(jié)核、肺癌放療、肺部寄生蟲感染等均可引起肺纖維化的形成，但是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確。有研究證實(shí)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是引起肺纖維化的重要步驟［3］。Notch信號(hào)是一條保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在肺組織早期發(fā)育過(guò)程中，其家族成員對(duì)肺上皮細(xì)胞的發(fā)育［4-5］、生長(zhǎng)及凋亡［6-7］起著重要的調(diào)控作用。γ-分泌酶抑制劑（γsecretase inhibitor，DAPT）可間接抑制γ-分泌酶底物Notch的活性，進(jìn)而影響肺上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和肺上皮細(xì)胞分化。Notch信號(hào)是形成EMT的重要通路［8］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討DAPT能否阻斷、逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的EMT，為肺纖維化相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌上皮細(xì)胞株A549購(gòu)自上海賽百慷公司，在武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心-80℃凍存后保存于液氮罐中；TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Pepro Tech公司；DAPT購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；胎牛血清購(gòu)自四季青公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；兔抗人E-鈣黏合素（Ecadherin）、α-肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司；Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）熒光定量試劑盒購(gòu)自Takara公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及形態(tài)觀察 將A549細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 mg/L、鏈霉素100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基），置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將等量（1×105/mL）細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，再用不含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。對(duì)照組：用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；TGF-β1組：在含有10μg/L TGF-β1的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；TGF-β1+DAPT組：在含有10μg/L TGF-β1和2μmol DAPT的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；DAPT組：在含有2μmol DAPT的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，隔天換液，加入干預(yù)后48 h于倒置顯微鏡（×400）觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)E-鈣黏合素及α-SMA的mRNA表達(dá) 提取上述4組細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA濃度。進(jìn)行qPCR反應(yīng)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。用Trizol法提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作合成cDNA。反應(yīng)條件：42℃60 min，70℃10 min。反應(yīng)體系（20μL）：RNA反應(yīng)Mix 12μL，RNA樣品4μL，無(wú)酶水4μL。反應(yīng)結(jié)束后將cDNA稀釋10倍，按照SYBR Green熒光定量試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系（20μL）：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA模板2μL，滅菌水6μL。反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃15 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，以2－ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞E-鈣黏合素及α-SMA的表達(dá) 收集1.2.1各組細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，按BCA試劑盒操作步驟進(jìn)行蛋白定量，每個(gè)泳道加入50μg蛋白樣品，根據(jù)蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜（1∶10 000稀釋的E-鈣黏合素、α-SMA，1∶1 000稀釋GAPDH），TBST充分洗滌PVDF膜3～4次，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL法發(fā)光顯影，用Image J軟件將E-鈣黏合素、α-SMA分別與GAPDH灰度值標(biāo)準(zhǔn)化之比作為其蛋白表達(dá)的半定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果比較 對(duì)照組細(xì)胞呈多邊形，鋪路石樣，細(xì)胞間連接緊密。與對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，細(xì)胞拉長(zhǎng)變成梭形，類似于紡錘體狀且細(xì)胞間連接減少。TGFβ1+DAPT組僅有極少數(shù)細(xì)胞呈梭形，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)和對(duì)照組相似。而DAPT組形態(tài)與對(duì)照組大致一致，見(jiàn)圖1。

2.2 各組E-鈣黏合素及α-SMAmRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，TGF-β1組E-鈣黏合素mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低，α-SMAmRNA相對(duì)表達(dá)水平增加（P＜0.05）；TGF-β1+DAPT組和DAPT組E-鈣黏合素及α-SMAmRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與TGF-β1組比較，TGF-β1+DAPT組E-鈣黏合素mRNA相對(duì)表達(dá)水平增加，α-SMAmRNA相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Fig.1 Comparison of cell morphology between the four groups(Bar=20μm)圖1 倒置顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)的比較（Bar=20μm）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of E-cadherin andα-SMA mRNA between the four groups表2各組細(xì)胞E-鈣黏合素和α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of E-cadherin andα-SMA mRNA between the four groups表2各組細(xì)胞E-鈣黏合素和α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+DAPT組DAPT組F E-鈣黏合素0.997±0.149 0.044±0.036a 0.802±0.093b 1.026±0.168b 14.254＊α-SMA 1.045±0.174 1.863±0.095a 1.369±0.149b 1.075±0.065b 26.142＊

2.3 各組E-鈣黏合素及α-SMA蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，TGF-β1組E-鈣黏合素蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加（P＜0.05）；TGF-β1+DAPT組和DAPT組E-鈣黏合素及α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與TGF-β1組比較，TGF-β1+DAPT組E-鈣黏合素相對(duì)表達(dá)水平增加，α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

Fig.2 Western blot assay of E-cadherin andα-SMA圖2 E-鈣黏合素和α-SMA蛋白的Western blot圖

Tab.3 Comparison of proteins of E-cadherin and α-SMA between the four groups表3 各組細(xì)胞E-鈣黏合素和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of proteins of E-cadherin and α-SMA between the four groups表3 各組細(xì)胞E-鈣黏合素和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+DAPT組DAPT組F E-鈣黏合素0.551±0.052 0.286±0.023a 0.497±0.057b 0.590±0.059b 22.121＊α-SMA 0.357±0.037 0.647±0.042a 0.484±0.049ab 0.380±0.040b 29.753＊

3 討論

肌成纖維細(xì)胞（MFb）的活化與增生是肺纖維化特征性的病理生理過(guò)程，大量的肌纖維母細(xì)胞堆積并過(guò)分產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)是肺纖維化形成和發(fā)展的原因［9-10］。在肺纖維化發(fā)病過(guò)程中，多數(shù)病理性的MFb是通過(guò)EMT轉(zhuǎn)分化而來(lái)［11-12］。EMT表現(xiàn)為上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏合素表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（vimentin）表達(dá)升高，而α-SMA作為間質(zhì)標(biāo)志物可用于評(píng)價(jià)EMT［13-14］。TGF-β1可以誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞向肺間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［15-16］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1組E-鈣黏合素蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低、α-SMA蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平增加，表明TGF-β1處理后可顯著抑制A549細(xì)胞中肺上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏合素mRNA及蛋白表達(dá)，而促進(jìn)肺間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)。另外，與對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，細(xì)胞拉長(zhǎng)變成梭形，類似于紡錘體狀且細(xì)胞間連接減少，表明TGF-β1可促使EMT從而導(dǎo)致肺纖維化。

Notch信號(hào)通路在肺組織生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化中起著重要作用［17-18］。有研究顯示，使用Notch信號(hào)阻斷劑DAPT干預(yù)后，TGF-β1誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞與正常肺上皮細(xì)胞無(wú)明顯變化，細(xì)胞外基質(zhì)亦無(wú)明顯增加，說(shuō)明Notch信號(hào)可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌［19］。Notch信號(hào)通路極有可能作為TGF-β1的一個(gè)下游因子參與了其誘導(dǎo)的EMT。本研究結(jié)果亦顯示，Notch信號(hào)通路經(jīng)特異性抑制劑DAPT干預(yù)后，肺上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞維持典型的鋪路石樣形態(tài)，部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變，并可促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏合素mRNA及蛋白的表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)，再次證實(shí)Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT能夠從基因和蛋白水平阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的形態(tài)改變、E-鈣黏合素減少、α-SMA增加等變化，即有效逆轉(zhuǎn)EMT。

綜上所述，Notch信號(hào)特異性阻斷劑DAPT很可能是抑制肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵因素，其可作為一種有效的藥物來(lái)抑制EMT，治療肺纖維化或抑制肺纖維化的發(fā)生，為臨床治療肺纖維化帶來(lái)新的希望。