Musashi2在不同分子分型乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及臨床意義

平靜，周東華，朱大江，田杰，陳瑩，范菊花

Musashi家族是一類進(jìn)化保守的RNA結(jié)合蛋白，包 括Musashi1和Musashi2兩 個(gè) 亞 型［1］。Musashi2比Musashi1表達(dá)更為廣泛，參與多種人類遺傳疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程［2］。乳腺癌是我國(guó)女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是乳腺癌最常見的病理類型［3］。乳腺癌的分子分型與其臨床生物學(xué)特征有關(guān)，對(duì)評(píng)估患者的預(yù)后有重要意義［4］。有關(guān)Musashi2在不同分子亞型乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及其臨床意義鮮見報(bào)道。本研究擬采用免疫組織化學(xué)及熒光原位雜交對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌進(jìn)行分子分型，檢測(cè)Musashi2蛋白在不同分子亞型乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)，探討其表達(dá)與臨床和分子病理特征及術(shù)后無病生存時(shí)間的相關(guān)性，以期探索新的與乳腺癌進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料 收集佛山市婦幼保健院病理科2013年3月—2019年3月經(jīng)病理確診且臨床資料齊全的125例女性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本?；颊咝腥橄侔┣谐g(shù)，標(biāo)本離體后立即進(jìn)行書頁狀切開并用4%中性甲醛固定后取材。其中65例伴導(dǎo)管原位癌，123例伴正常乳腺組織，以癌周導(dǎo)管原位癌和正常乳腺組織作為研究對(duì)照。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌按照世界衛(wèi)生組織（WHO）乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)（2012）［5］進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)90例，Ⅲ級(jí)24例。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第8版標(biāo)準(zhǔn)［6］進(jìn)行TNM分期：早期（Ⅰ+Ⅱ期）85例，晚期（Ⅲ+Ⅳ期）40例。乳腺癌分子分型參照《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》［7］，其中Luminal A型24例，Luminal B型67例，人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）過表達(dá)型17例，三陰型17例。患者年齡33～71歲，平均（48±10）歲，術(shù)前均未做放、化療及免疫治療。

1.2 主要試劑 免疫組織化學(xué)染色抗體濃縮型兔抗人多克隆抗體Musashi2（1∶100）購(gòu)自SAB公司，其余抗體包括雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2和Ki67等均購(gòu)自羅氏（Roche）公司。HER-2基因擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉公司。

1.3 HE及免疫組織化學(xué)染色 乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本離體后立即用4%中性甲醛固定6 h以上，對(duì)取材后的組織塊進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，并用蘇木素伊紅（HE）染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。免疫組織化學(xué)檢測(cè)所用儀器為羅氏公司Ventana BenchMark XT全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀，按照Ventana全自動(dòng)染色說明書設(shè)置染色程序。

1.4 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)檢測(cè)以腫瘤細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Musashi2陽性。ER、PR和Ki67陽性標(biāo)準(zhǔn)均為腫瘤細(xì)胞核著棕黃色顆粒。HER-2蛋白陽性定位于腫瘤細(xì)胞膜，呈棕黃色。HER-2蛋白和基因檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照《乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2014版）》［8］。HER-2免疫組織化學(xué)陽性分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)為“+”：＞10%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色；“++”：（1）＞10%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整和（或）弱至中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色；（2）≤10%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色；“+++”：＞10%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色。對(duì)HER-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果為“++”的病例進(jìn)一步做熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)。

1.5 FISH檢測(cè) 將乳腺癌組織切片過夜烘烤后進(jìn)行脫蠟、乙醇梯度復(fù)水、漂洗、蛋白酶K工作液孵育，再次漂洗，乙醇梯度脫水，丙酮液浸泡后待玻片自然干燥，加熱玻片至56℃，再按照HER-2基因擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作。

1.6 分子分型 自2013年以來，以Ki67界定不同乳腺癌分子分型的界值有所變化，本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，采用14%作為判斷Ki67高低的界值。具體分子分型標(biāo)準(zhǔn)為“Luminal A型”：ER、PR陽性且PR＞20%，HER-2陰性，Ki67≤14%；“Luminal B型”：（1）ER、PR陽性，HER-2陰性，且Ki67＞14%或PR≤20%；（2）ER、PR陽性，HER-2陽性（蛋白過表達(dá)或基因擴(kuò)增），任何狀態(tài)的Ki-67；“HER-2過表達(dá)型”：HER-2陽性（蛋白過表達(dá)或基因擴(kuò)增），ER、PR陰性；“三陰型”：ER、PR和HER-2均陰性［7］。

1.7 隨訪 術(shù)后通過門診復(fù)查、電話等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止于2020年3月，隨訪時(shí)間12～85個(gè)月，平均隨訪時(shí)間（65±14）個(gè)月。無病生存時(shí)間定義為手術(shù)至腫瘤復(fù)發(fā)或患者死亡的時(shí)間。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，采用Bonferroni法校正P值；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并行Log-rankχ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Musashi2在不同乳腺組織中的表達(dá) Musashi2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管原位癌和正常乳腺組織中的陽性率分別為56.80%（71/125）、63.08%（41/65）和21.95%（27/123），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=42.078，P＜0.01），在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管原位癌中的陽性率明顯高于正常乳腺組織（χ2分別為31.501和31.154，P＜0.01），但Musashi2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管原位癌中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同乳腺組織中Musashi2的表達(dá)情況見圖1。

Fig.1 Immunohistochemistry staining and fluorescence in situ hybridization of different tissues in breast cancer圖1 乳腺癌不同組織免疫組織化學(xué)染色及熒光原位雜交

2.2 Musashi2在不同分子亞型乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá) Musashi2蛋白陽性表達(dá)率在Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型和三陰型中分別為70.83%（17/24）、68.66%（46/67）、29.41%（5/17）和17.65%（3/17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.582，P＜0.05）。Musashi2在Luminal A型 和Luminal B型中的陽性率明顯高于HER2過表達(dá)型（χ2分別為6.866和8.756）和三陰型（χ2分別為11.267和14.516），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但在Luminal A型和Luminal B型中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.039，P＞0.05）。

2.3 Musashi2表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系 Musashi2在TNM分期早期乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的陽性率明顯高于晚期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)，脈管是否受累和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移情況下，Musashi2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of positive expression rate of Musashi2 in invasive ductal carcinoma of breast between patients with different clinicopathological features表1 不同臨床病理特征的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者M(jìn)usashi2表達(dá)陽性率比較 ［例（%）］

2.4 Musashi2表達(dá)水平與ER、PR、HER-2和Ki67的相關(guān)性結(jié)果 Musashi2在ER、PR陽性的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陽性率較高，而在ER、PR陰性的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陽性率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），Musashi2表達(dá)水平與ER、PR呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Musashi2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)與HER-2和Ki67無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

Tab.2 The relationship between Musashi2 expression and molecular pathological features of breast invasive ductal carcinoma表2 Musashi2表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分子病理特征的關(guān)系 ［例（%）］

2.5 Musashi2表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后隨訪125例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中Musashi2陽性表達(dá)71例，Musashi2陰性表達(dá)54例。Kaplan-Meier生存曲線表明Musashi2陽性組和陰性組術(shù)后無病生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（67±12）個(gè)月vs.（63±15）個(gè)月，Log-rankχ2=0.752，P＞0.05］，見圖2。

3 討論

Fig.2 Survival curves of Musashi2 protein negative and positive expressions in patients with breast invasive ductal carcinoma圖2 Musashi2蛋白陰性和陽性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者生存曲線

RNA結(jié)合蛋白Musashi1和Musashi2是與癌癥發(fā)生、進(jìn)展和藥物耐受等多種關(guān)鍵生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)的調(diào)節(jié)因子［9］。人類Musashi2基因位于17q22染色體上，編碼分布于神經(jīng)、造血、胰腺和上皮組織干細(xì)胞的RNA結(jié)合蛋白［10］。Musashi2的識(shí)別基序通過與目標(biāo)mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，在mRNA前處理或選擇性剪接過程中增加或減少其表達(dá)，干擾它們進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或影響靶基因的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄［11］。Musashi2在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用。一些研究發(fā)現(xiàn)Musashi2在宮頸癌［12］、前列腺癌［13］、胃癌［14］和胰腺癌［15］等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與其預(yù)后不良有關(guān)。

Musashi2是一種復(fù)雜的多功能蛋白，其功能不僅取決于細(xì)胞類型，還與其所處的微環(huán)境有關(guān)，Musashi2在不同腫瘤組織中的表達(dá)水平及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響可能有所不同［16-17］。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，具有不同的免疫表型、治療反應(yīng)及預(yù)后［18］。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的分子亞型中，Luminal A型對(duì)內(nèi)分泌治療敏感、預(yù)后好；Luminal B型在接受內(nèi)分泌治療后無病生存率較高；而HER-2過表達(dá)型和三陰型惡性程度較高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移較早，預(yù)后較差［19］。有關(guān)Musashi2在乳腺癌中的表達(dá)及與其分子分型的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。Katz等［20］分析來自癌癥基因組圖譜的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Musashi2在至少50%的乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，體外細(xì)胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)管腔型（Luminal A型和Luminal B型）乳腺癌細(xì)胞系中Musashi1和Musashi2的表達(dá)高于三陰型。本研究結(jié)果證實(shí)，Musashi2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管原位癌中的陽性率明顯高于正常乳腺組織。在進(jìn)一步研究Musashi2在不同分子亞型乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Musashi2在Luminal A型中陽性率最高，在Luminal A型和Luminal B型中的陽性率明顯高于HER-2過表達(dá)型和三陰型，與Katz等［20］的研究結(jié)果一致。筆者在對(duì)Musashi2與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，Musashi2在早期乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病例中的陽性率明顯高于晚期病例，但在不同年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)，脈管是否受累和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的乳腺潤(rùn)性導(dǎo)管癌，Musashi2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，筆者推測(cè)Musashi2可能在早期乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中發(fā)揮作用。李菲菲［21］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Musashi2可抑制乳腺癌模型小鼠腫瘤細(xì)胞及新生血管的生長(zhǎng)，從而降低其惡性程度。Musashi2高表達(dá)的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌不容易發(fā)生增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是Musashi2蛋白過表達(dá)抑制了乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)細(xì)胞所需因子Jagged1的翻譯，促使細(xì)胞維持在上皮狀態(tài)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌進(jìn)行Musashi2檢測(cè)能在一定程度上評(píng)估其生物學(xué)行為。

一般來說，ER、PR陽性的乳腺癌分化程度較好、進(jìn)展較慢，術(shù)后不易復(fù)發(fā)，且對(duì)激素治療的敏感性高，采用內(nèi)分泌治療能明顯改善患者預(yù)后［22］。雌激素受體1（ESR1）是乳腺癌治療與預(yù)后評(píng)價(jià)的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，ESR1可調(diào)控多個(gè)下游基因（例如FOXA1、GATA3、CCND1和TFF1等），Musashi2能與ESR1 mRNA及ESR1靶基因如GATA3和FOXA1相結(jié)合，在調(diào)節(jié)ESR1功能方面發(fā)揮協(xié)同作用。Kang等［23］研究發(fā)現(xiàn)Musashi2在ER和PR陽性的乳腺癌中高表達(dá)，Musashi2是ESR1的上游調(diào)節(jié)因子。Musashi2通過直接結(jié)合ESR1的3′端非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)ESR1 mRNA并增強(qiáng)ESR1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而維持ESR1功能。Musashi2與ESR1表達(dá)密切相關(guān)，并可能影響乳腺癌患者的預(yù)后。在接受內(nèi)分泌治療的ER陽性乳腺癌患者，Musashi2水平可以預(yù)測(cè)接受他莫昔芬治療患者的預(yù)后，Musashi2高表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率明顯優(yōu)于Musashi2低表達(dá)患者［23］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)Musashi2在ER、PR陽性的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陽性率較高，且Musashi2表達(dá)水平與ER、PR呈顯著正相關(guān)，可輔助乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者合理地選擇內(nèi)分泌治療方案。筆者在對(duì)Musashi2表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的預(yù)后進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，Musashi2陽性組和陰性組患者無病生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本組研究納入的樣本數(shù)量偏少以及隨訪時(shí)間較短有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Musashi2蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)與其分子分型和TNM分期有關(guān)，Musashi2高表達(dá)提示腫瘤惡性程度較低。Musashi2與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌不同分子分型標(biāo)志物之間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需在細(xì)胞及分子水平深入研究。