WFIKKN2結(jié)合TGF-β家族調(diào)控生殖細(xì)胞發(fā)育的研究進(jìn)展

曲江雪 覃清圓 劉濤 嚴(yán)杰

WFIKKN2(WAP,Kazal,Immunoglobulin,Kunitz and NTR Domain-Containing Protein 2)蛋白是在血清中發(fā)現(xiàn)的一種新的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族因子的胞外結(jié)合蛋白，也稱為血清生長(zhǎng)分化因子相關(guān)蛋白(growth and differentiation factor-associated serum protein 1,GASP1)，目前已知與之特異性結(jié)合的TGF-β家族成員為：肌肉生長(zhǎng)抑制素[myostatin,MSTN，也稱為生長(zhǎng)分化因子8(growth and differentiation factor 8,GDF8)]、生長(zhǎng)分化因子11(growth and differentiation factor 11,GDF11)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)。WFIKKN2與TGF-β家族成員協(xié)同發(fā)揮功能，二者密不可分。本文檢索了2021年2月份以前PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中所有帶有以下關(guān)鍵詞的英文文獻(xiàn)：①WFIKKN2；②TGF-β家族；③雄性生殖細(xì)胞；④雌性生殖細(xì)胞，就WFIKKN2及以其為分子伴侶的TGF-β家族因子在生殖細(xì)胞發(fā)生調(diào)控機(jī)制等方面的研究進(jìn)展綜述。

一、WFIKKN2分子結(jié)構(gòu)

WFIKKN2基因位于人類17號(hào)染色體長(zhǎng)臂中，高表達(dá)于成人卵巢、睪丸、大腦和肌肉組織，小鼠同源基因位于11號(hào)染色體中，高表達(dá)于小鼠胸腺、大腦、卵巢和肌肉組織。WFIKKN2蛋白在人和小鼠的同源性為92.19%，屬于整合蛋白家族成員，包含6個(gè)結(jié)構(gòu)域：1個(gè)乳清酸性蛋白(whey acidic protein,WAP)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)卵泡抑素(follistatin，F(xiàn)ST)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)免疫球蛋白C2型結(jié)構(gòu)域(immunoglobulin C2 type domain,IgC2)、2個(gè)Kunitz(KU)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Netrin(NTR)結(jié)構(gòu)域。

二、WFIKKN2與TGF-β家族成員的結(jié)合機(jī)理

WFIKKN2作為TGF-β家族因子的胞外結(jié)合蛋白發(fā)揮作用。WFIKKN2通過(guò)FST結(jié)構(gòu)域、KU結(jié)構(gòu)域和/或NTR結(jié)構(gòu)域與TGF-β家族MSTN、GDF11、TGF-β1、BMP2、BMP4 5個(gè)因子結(jié)合[1,2]。WFIKKN2對(duì)MSTN、GDF11生物活性起抑制作用：WFIKKN2與MSTN或GDF11成熟二聚體結(jié)合形成WFIKKN2-MSTN或WFIKKN2-GDF11復(fù)合物，這是SMAD信號(hào)通路的假性信號(hào)分子。WFIKKN2-MSTN復(fù)合物雖可以與Ⅱ型受體結(jié)合但阻斷了Ⅰ型受體的募集與磷酸化，從而阻斷了受體二聚化，使信號(hào)無(wú)法下傳；而WFIKKN2-GDF11復(fù)合物直接阻斷了GDF11與II型受體的相互作用。因此WFIKKN2阻斷了下游的經(jīng)典SMAD信號(hào)通路傳導(dǎo)，而通過(guò)激活非經(jīng)典(non-SMAD)途徑調(diào)控核基因表達(dá)[1](圖1)。WFIKKN2與TGF-β1、BMP2及BMP4結(jié)合后對(duì)他們的生物活性無(wú)抑制作用[3,4]，其確切作用需要進(jìn)一步研究揭示。

圖1 WFIKKN2蛋白與TGF-β家族成員的結(jié)合

三、WFIKKN2-TGF-β家族成員在雌性生殖細(xì)胞發(fā)生與發(fā)育中的作用

WFIKKN2是近年來(lái)才被研究報(bào)道的一種新的TGF-β家族成員的胞外結(jié)合蛋白，高表達(dá)于人卵巢的原始卵泡階段卵母細(xì)胞內(nèi)，其在雌性生殖細(xì)胞的具體作用尚缺乏研究報(bào)道。然而受WFIKKN2調(diào)節(jié)的TGF-β家族因子BMP2、BMP4、MSTN、TGF-β1在雌性生殖細(xì)胞發(fā)生中的作用均已得到證實(shí)。

1.WFIKKN2-BMP2

BMP2促進(jìn)胚胎內(nèi)胎兒卵巢發(fā)育，BMP2在人妊娠8周～9周低表達(dá)，隨妊娠進(jìn)展增加而增加，其通過(guò)Wnt信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell，PGC)向卵原細(xì)胞分化[5]，促進(jìn)胎兒卵巢產(chǎn)生。BMP2在成人卵巢中主要在人顆粒細(xì)胞中表達(dá)，以旁分泌/自分泌方式調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，在卵泡液中的表達(dá)水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)，臨床將其列為卵母細(xì)胞質(zhì)量及體外受精能力的預(yù)測(cè)因子[6]。BMP2具有與MSTN相似的調(diào)節(jié)激素生成的作用，它可增加卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)受體合成、促進(jìn)雌二醇生成，且抑制黃體生成素(luteinizing hormone，LH)受體及甾體生成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)合成、抑制孕酮產(chǎn)生[7]。在黃體退化過(guò)程中，檢測(cè)到BMP2基因在黃體顆粒細(xì)胞及黃體卵泡膜細(xì)胞表達(dá)升高，其也作為黃體溶解的調(diào)節(jié)因子[8]。BMP2還可促進(jìn)卵泡體外發(fā)育，體外培養(yǎng)牛原始卵泡液中添加BMP2，初級(jí)卵泡比例增高，促進(jìn)次級(jí)卵泡向竇卵泡發(fā)育，BMP2與FSH共同作用更有助于體外原始、次級(jí)卵泡培養(yǎng)[9]。

2.WFIKKN2-BMP4

BMP4調(diào)控胎兒卵巢與成人卵泡發(fā)育過(guò)程的作用均有報(bào)道。BMP4在人妊娠8周～9周表達(dá)最高，后隨妊娠增加而降低[10]，這種現(xiàn)象機(jī)制尚未明確，但已確定的是，在胎兒卵巢產(chǎn)生后，BMP4通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)胎兒卵巢中原始生殖細(xì)胞PGC數(shù)量[10]。研究還發(fā)現(xiàn)BMP4在成人卵巢間質(zhì)細(xì)胞和卵泡膜前體細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)旁分泌/自分泌方式促進(jìn)原始卵泡向初級(jí)卵泡發(fā)育[11]。而在嚙齒類動(dòng)物中，BMP4表達(dá)在卵巢所有細(xì)胞中，具有促進(jìn)原始卵泡池激活的作用[12]。在卵泡發(fā)育晚期，BMP4抑制CX43基因表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞及周圍丘顆粒細(xì)胞發(fā)育同步[13]。BMP4還通過(guò)SMAD信號(hào)通路促進(jìn)透明質(zhì)酸酶2(hyaluronan synthase 2,HAS2)、透明質(zhì)酸及前列腺素E2合成，為卵泡排卵做好準(zhǔn)備[3]。BMP4還參與黃體溶解與退化[8]。BMP4也具有調(diào)節(jié)激素合成的作用，它通過(guò)SMAD信號(hào)通路上調(diào)類固醇生成酶基因的表達(dá)，增加類固醇合成酶量，促進(jìn)顆粒細(xì)胞雌激素合成，抑制顆粒細(xì)胞中StAR合成、降低孕酮產(chǎn)生，抑制卵泡膜細(xì)胞雄激素的合成[10]。

3.WFIKKN2-MSTN

MSTN及其受體基因ACVR2A、ACVR2B和ALK5在人類卵巢生長(zhǎng)卵泡階段(初級(jí)卵泡至成熟卵泡階段)的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，MSTN通過(guò)旁分泌/自分泌方式發(fā)揮作用，在人的卵泡液中檢測(cè)到成熟的MSTN二聚體[4]。MSTN通過(guò)間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK) 5活化的SMAD2/3和ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)人顆粒細(xì)胞靶基因調(diào)控而調(diào)節(jié)促性腺激素受體基因，進(jìn)一步調(diào)控人顆粒細(xì)胞孕酮及雌激素的產(chǎn)生[14]。MSTN下調(diào)LH受體(LHCGR)、STAR表達(dá)，抑制LHCGR及StAR的合成，抑制LH受體合成，減少顆粒細(xì)胞對(duì)LH的應(yīng)答，抑制孕酮的產(chǎn)生。MSTN上調(diào)FSH受體(FSHR)表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞中FSHR合成，增大對(duì)FSH的應(yīng)答，促進(jìn)雌二醇的生成[15]，MSTN作為孕酮的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，防止在大卵泡階段過(guò)早黃體化，促進(jìn)卵泡向成熟卵泡發(fā)育。MSTN抑制顆粒細(xì)胞的增殖，通過(guò)與顆粒細(xì)胞膜ALK4和ALK5結(jié)合，活化SMAD2/3- SMAD4信號(hào)通路傳導(dǎo)，不僅上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達(dá)，還誘導(dǎo)LOX的表達(dá)及其活性增強(qiáng)，抑制顆粒細(xì)胞增殖，其意義在于調(diào)控排卵后的顆粒細(xì)胞由高增殖狀態(tài)到非增殖及終末分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)卵泡的成熟及排卵后的黃體化生成[16]。MSTN還可通過(guò)SMAD2/3信號(hào)傳導(dǎo)下調(diào)戊四環(huán)素3(pentraxin 3,PTX3)基因表達(dá)[17]，與卵泡發(fā)育障礙相關(guān)。MSTN同樣在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation,IVM)中發(fā)揮作用：在IVM培養(yǎng)液中添加MSTN，可改變卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄模式，降低IVM成熟卵母細(xì)胞10%活性氧(reactive oxygen species,ROS)和增加谷胱甘肽水平，促進(jìn)卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟與發(fā)育潛能[18]。由此推測(cè)WFIKKN2與MSTN結(jié)合干擾經(jīng)典SMAD作用通路，可能作為提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的干預(yù)手段。

4.WFIKKN2-TGF-β1

TGF-β1及其受體TGFβR2及ALK5均表達(dá)于顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞上，通過(guò)旁分泌/自分泌方式調(diào)節(jié)類固醇生成、顆粒細(xì)胞增殖和分化作用,TGF-β1促進(jìn)人顆粒細(xì)胞中CX43表達(dá)，介導(dǎo)卵母細(xì)胞與周圍丘顆粒細(xì)胞之間的縫隙連接和細(xì)胞通訊，促進(jìn)卵泡發(fā)育[11]。此外，TGF-β1通過(guò)TGFβR2和ALK5結(jié)合，激活SMAD2/3-SMAD4信號(hào)通路，上調(diào)環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)前列腺素E2的合成，調(diào)控卵泡排卵活動(dòng)[19]，并且TGF-β1通過(guò)SMAD2/3-SMAD4信號(hào)通路對(duì)人顆粒葉黃素(human granulosa-lutein cells hGL)細(xì)胞中透明質(zhì)酸的合成發(fā)揮作用[11]。

綜上所述，根據(jù)TGF-β家族成員BMP2、BMP4、MSTN及TGF-β1在雌性生殖細(xì)胞發(fā)生中的作用，以及WFIKKN2對(duì)TGF-β家族因子的分子伴侶作用，可以推測(cè)WFIKKN2可能在雌性生殖細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育中發(fā)揮重要雙向調(diào)控作用，但是具體機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。目前，尚無(wú)GDF11在雌性生殖細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育中發(fā)揮作用的研究。

四、WFIKKN2-TGF-β家族成員在雄性生殖細(xì)胞發(fā)生與發(fā)育中的作用

WFIKKN2在睪丸中高表達(dá)，然而在雄性生殖細(xì)胞中的功能尚未報(bào)道。但是，以WFIKKN2為分子伴侶的TGF-β1、BMP2、BMP4、GDF11在雄性生殖細(xì)胞發(fā)生中的作用已有相關(guān)研究。

TGF-β1在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞及早期精子均有表達(dá)，參與精子發(fā)生。TGF-β1在富含精子區(qū)域的精液中濃度較高，參與射精。Tgfβ1基因突變小鼠雖生殖器官、精子形態(tài)正常，但血清和睪丸內(nèi)睪酮和血清內(nèi)雄烯二酮減少，陰莖勃起反射和射精減少，影響雄鼠交配能力[20]。TGF-β1降低精子發(fā)生過(guò)程中圓形精子產(chǎn)生，TGF-β1阻斷二級(jí)精母細(xì)胞調(diào)節(jié)第二次減數(shù)分裂、精母細(xì)胞胞核及胞質(zhì)成熟同步，減少圓形精子形成[21]。TGF-β1通過(guò)SMAD信號(hào)通路抑制睪丸生精細(xì)胞NECL2的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞連接蛋白樣分子2(nectin-like molecule-2,Necl2)內(nèi)吞及溶解，調(diào)節(jié)Necl2在睪丸中的作用[22]。BMP2表達(dá)于人胚胎內(nèi)胚層，低表達(dá)Bmp2小鼠體內(nèi)顯示出原始生殖干細(xì)胞數(shù)量減少，對(duì)7日齡小鼠睪丸組織進(jìn)行培養(yǎng)，BMP2促進(jìn)精原細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖，并且Ⅰ型受體基因表達(dá)升高[23]。BMP4表達(dá)于人胚胎外胚層，低表達(dá)Bmp4的小鼠體內(nèi)也顯示原始生殖干細(xì)胞數(shù)量減少，其機(jī)制可能是SMAD1和SMAD5激活減少而影響原始生精細(xì)胞的發(fā)育，在Smad1、Smad5基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)原始生殖干細(xì)胞的缺乏，使用重組BMP4蛋白培養(yǎng)從胚胎外胚層分離出的胚胎干細(xì)胞出現(xiàn)原始生精細(xì)胞的分化[23]。BMP4在睪丸的精原細(xì)胞中表達(dá)。Bmp4在出生后小鼠睪丸的支持細(xì)胞中表達(dá)，其受體基因Alk3和Smad5在增殖的精原細(xì)胞均特異性表達(dá)，BMP4蛋白培養(yǎng)的精原細(xì)胞可檢測(cè)出細(xì)胞核內(nèi)SMAD4/5復(fù)合體增多，有絲分裂及分化作用增強(qiáng)，BMP4通過(guò)SMAD信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)精原細(xì)胞的增殖和分化[24]。GDF11基因在精原細(xì)胞瘤中高表達(dá)[25]，但其功能尚未明確，推測(cè)其延緩了腫瘤表型及惡變的發(fā)生。

由上可知TGF-β家族因子在雄性生殖細(xì)胞發(fā)生中的作用，那么根據(jù)最近發(fā)現(xiàn)的WFIKKN2對(duì)TGF-β家族因子的分子伴侶作用，可以推測(cè)WFIKKN2在雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育中也發(fā)揮一定的作用，亟待今后研究證實(shí)。

五、展望

研究證實(shí)WFIKKN2是一種新的TGF-β家族因子的胞外結(jié)合蛋白，是MSTN、GDF11、TGF-β1、BMP2和BMP4等因子發(fā)揮作用必不可少的分子伴侶，但其在生殖細(xì)胞發(fā)生發(fā)育中的具體作用研究較少，推測(cè)其作為分泌型因子可能通過(guò)旁分泌/自分泌方式，與在生殖細(xì)胞內(nèi)具有功能的TGF-β家族因子結(jié)合發(fā)揮正向或者負(fù)向調(diào)控作用，參與調(diào)控精/卵原細(xì)胞增殖與分化、卵子/精子發(fā)生等生物事件，亟待進(jìn)一步研究和探索。