維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形小鼠組蛋白H2BK120ub1泛素化修飾及相關(guān)基因表達(dá)變化

王珊 成翕悅 裴培 劉帆 占小俊

神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)是一類出生缺陷，對中國出生人口素質(zhì)造成巨大影響，NTDs主要包括無腦畸形、脊柱裂和腦膨出[1]。近年來，NTDs的發(fā)病機(jī)制受遺傳基因嚴(yán)格的調(diào)控以及環(huán)境交互作用共同決定，神經(jīng)管發(fā)育關(guān)鍵時期對孕婦體內(nèi)生化代謝物質(zhì)的變化極為敏感[2-3]。維生素A是胚胎發(fā)育過程中重要的成形素, 在體內(nèi)的分布對胚胎發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。孕婦如果在孕期攝入較多的維生素A，或者攝入其衍生物維甲酸(retinoic acid，RA) ，那么當(dāng)其體內(nèi)代謝平衡被打破時可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，可致一系列發(fā)育缺陷發(fā)生，包括NTDs的發(fā)生[4]。小鼠是用來研究NTDs發(fā)生機(jī)制的一種較為理想的模型，這是源于小鼠神經(jīng)管的發(fā)育過程和人類十分相似。而如何構(gòu)建小鼠的NTDs模型，目前已知的方法包括某種藥劑干預(yù)、高糖、高溫等[5]，而RA干預(yù)是經(jīng)典的有效的NTDs造模方式[6]。前期研究課題組發(fā)現(xiàn)，過量RA的致畸作用導(dǎo)致組蛋白單泛素化H2AK119ub修飾異常變化，進(jìn)一步協(xié)同通過表觀作用調(diào)控肢節(jié)發(fā)育基因Hox[7]。本研究對RA誘導(dǎo)的小鼠NTDs模型進(jìn)行免疫印記實(shí)驗(yàn),從而檢測組蛋白泛素化H2BK120ub1的表達(dá)以及神經(jīng)管發(fā)育基因Pax6、Nestin表達(dá)變化，從而探究RA導(dǎo)致NTDs的可能機(jī)制,進(jìn)而為該病的防范提供可能。

對象與方法

一、研究對象

本研究對象為雄性和雌性的SPF級8～12周的C57BL/6小鼠，均從北京維通利華動物有限公司購入，體重為19～23 g。小鼠安置在動物房內(nèi),為單籠飼養(yǎng),自由飲水、攝食，環(huán)境溫度為(22±2)℃，濕度50%～60%，光照24 h完成一次晝夜交替。

二、方法

1.RA誘導(dǎo)NTDs胎鼠標(biāo)本制備：SPF級C57BL/6小鼠單籠飼養(yǎng)，飼喂繁殖飼料以及常規(guī)自由飲食飲水。于20：00點(diǎn)將小鼠按雌雄比例2∶1進(jìn)行合籠(交配)，并于第2日早晨8：00檢查陰栓，將12：00點(diǎn)定為孕0.5 d(E0.5)，隨機(jī)將孕鼠分成對照組及實(shí)驗(yàn)組。在孕7.5 d對懷孕小鼠采取RA 25 mg/kg灌胃處理，并將其作為實(shí)驗(yàn)組，對照組則給予同等劑量香油灌胃，孕鼠E9.5、E10.5脫頸處死，解剖出子宮，放置在PBS皿中，仔細(xì)分離出胚胎，每組各8只，并保證胚胎完整。觀察對照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠胚胎以及神經(jīng)管發(fā)育，拍照記錄。E10.5 d小鼠分離出腦泡及脊髓組織分別混樣，將樣品均分為三管，即實(shí)驗(yàn)組和對照組各三管樣品，液氮保存進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)[7]。

2. 維生素A、維甲酸濃度測定：標(biāo)本準(zhǔn)備采用PBS反復(fù)凍融法，將小鼠組織從-80 ℃冰箱取出，稱取組織重量，將配好的1×PBS溶液(1 mL)加入組織(100 mg)中，充分勻漿后放置-20℃冰箱過夜。第2天取出組織，放室溫1 h，使組織充分融化后，再次放置-20℃過夜。第3天取出組織，放室溫1 h，待充分融化后，4℃，5 000 g離心5 min，取上清。用樣本稀釋劑將標(biāo)本稀釋100倍；維生素A的樣本濃度測定按照武漢華美Human Vitamin A,VA ELISA Kit(CSB-E07889h)操作步驟進(jìn)行[8]。維甲酸的樣本濃度測定按照武漢華美Human Retinoic Acid ELISA Kit(CSB-E16712h)操作步驟進(jìn)行[9]。最后應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀(波長設(shè)置450nm) 測定每孔光密度，波長設(shè)置450 nm，將所測濃度用Curve Expert軟件繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 組蛋白提?。悍Q量樣品，用手術(shù)刀或剪刀將樣品切成小塊(1～2 mm3)，將組織塊轉(zhuǎn)移到Dounce均質(zhì)器中；用蒸餾水以1∶10的比例將10×的預(yù)裂解緩沖液稀釋到1×的預(yù)裂解緩沖液中(例如，1 mL的10×裂解前緩沖液+9 mL水)；加入稀釋后的1×裂解前緩沖液，每200 mg組織加入1 mL裂解前緩沖液，50～60 strokes以分解組織碎片；將裂解后混合物勻漿后，置于離心管(15 mL)中，離心5 min(4 ℃，3 000 rpm)。如果總混合液較少(<2 mL)，則用EP管(2 mL)收集混合液，離心1 min(4℃，10 000 rpm)后棄上清。

4. Western blot檢測：制備好的胚鼠腦、脊髓組織的組蛋白加樣量為20 ug，用15%的SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，樣品經(jīng)分離電泳后，再用PVDF膜電轉(zhuǎn),電轉(zhuǎn)結(jié)束后取出膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后取模，將膜用H2BK120ub1(1：500)、H2B(1：500)一抗4 ℃孵育過夜；第二日上午取出膜，將其放入PBST溶液中，放置在搖床上洗膜3次，每次10 min。再將膜浸入孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗中，室溫放置1h,然后繼續(xù)用 PBST洗膜3次，每次10 min。最后，化學(xué)發(fā)光試劑顯影，全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描，計算條帶豐度、統(tǒng)計分析，生物學(xué)重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)三次。

5. RT-PCR 檢測：Trizol試劑分別提取胚鼠鼠腦、脊髓組織中總RNA,反轉(zhuǎn)錄 cDNA 試劑盒將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 反應(yīng)體系：4 μL的5×mix 緩沖液，1 μL的RNA酶抑制劑(20 U/μL)，2 μL的10 mM dNTP Mix，1 μL的RevertAid M-MuLV RT(200 U/μL)，以及1 μL的Oligo(dT)引物，1 μg的RNA，再加入去離子水補(bǔ)齊至20 μL，混勻瞬時離心；將PCR的反應(yīng)條件設(shè)置為42 ℃，60 min；70 ℃，5 min。SybrGreen 染料進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為：5 μL的PCR Mix 緩沖液(2×)，各0.5 μL的正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)，各2 μL的cDNA及去離子水，最后的總體積為10 μL；反應(yīng)條件為：(94 ℃，5 min)×1 循環(huán)；(94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min)×35 循環(huán)；(72 ℃，10 min)×1 循環(huán)。進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。Pax6 正向引物：GCACTCGAGGCAACCAATGAGGGCATT，Pax6 反向引物：ACCAAGCTTGACAACCGGGTTCTACGCGAGGA；Nestin正向引物：GCAGAGAAGACAGTGAGGCAGATG，Nestin反向引物:GGAGGCAGGAGACTTCAGGTAGAG

6. ChIP 實(shí)驗(yàn)：加入270 μL的濃度為37%的甲醛(終濃度為1%)，放置室溫10 min，然后加入10×甘氨酸1 mL，室溫放置5 min，停止交聯(lián)后預(yù)冷的PBS洗滌沉淀3次，加入1mL的1×PBS+PIC(protease inhibitor cocktail)，離心5 min(4 ℃，1 500 rpm)；利用CST ChIP試劑盒加入1mL緩沖液B+DTT進(jìn)行重懸；利用CST ChIP試劑盒中緩沖液C加入1 mL將細(xì)胞進(jìn)行重懸，4 ℃，3 000 rpm，5 min離心，棄上清液；加入3 μL的Micrococcal Nuclease，將其充分顛倒混勻，放置37 ℃孵育20 min，從而把 DNA消化為200～500 bp的片段；加入0.5 M的EDTA 50 μL以終止反應(yīng)，然后離心1 min(4℃，13 000 rpm)，棄上清液；加入CST ChIP試劑盒中60 μL Solution D以重懸細(xì)胞，然后放在冰盒上靜置10 min；在交聯(lián)后的染色質(zhì)樣品中加入ChIP緩沖液400 μL(包含2 μL蛋白酶抑制劑)，混勻后放在冰盒上；吸取樣品10～20 μL作為2% Input，剩余樣品中加入H2BK120ub1抗體，陰性對照組加入IgG，然后放在搖床上，4 ℃孵育過夜；第二天向樣品中加入ChIP-Grade蛋白G瓊脂糖微球，在4 ℃搖床上2 h，以富集免疫沉淀的DNA結(jié)合片段；解交聯(lián)后對目的DNA進(jìn)行純化。

7.ChIP-qPCR：10 μL的EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix-Low ROX, 各0.6 μL 的Forward Primer(10 μM)及 Rorward Primer(10 μM)，2 μL的ChIP DNA 模板，6.8 μL的 Nuclease-free Water；機(jī)器的反應(yīng)條件設(shè)置：95 ℃，30 s，1 cycle；95 ℃，5 s，40 cycles；60 ℃，30 s，40 cycles。Nestin-ChIP正向引物：GTGAGCCACCGCAGACCACC，Nestin-ChIP反向引物：TGGACCCCCGGACAAGCACA，Pax6-ChIP正向引物：ATGCCCCCAGCGCCACTCTA，Pax6-ChIP反向引物：TCAACCCGTCGGAGGCCCAT。

8. 統(tǒng)計學(xué)處理：利用SPSS 12.0分析軟件進(jìn)行Student′st檢驗(yàn)、單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RA誘導(dǎo)C57BL/6小鼠NTDs模型的建立

結(jié)果顯示，正常小鼠胚胎外觀結(jié)構(gòu)完整尾部細(xì)長彎曲，較為圓潤飽滿,神經(jīng)管發(fā)育較好并且閉合完全(圖1A)。相比對照組，NTDs組小鼠畸形胚胎體積較小伴有不同程度的發(fā)育遲緩, 以腦部畸形端腦、后腦發(fā)育形態(tài)異常為主要表現(xiàn)，主要表型為NTDs(圖1B、圖1C)。

圖1 RA誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠NTDs模型

二、RA誘導(dǎo)的NTDs胎鼠,維生素A和維甲酸表達(dá)變化

用ELLISA方法檢測E10.5d的正常對照和NTDs小鼠腦和脊髓組織中維甲酸和維生素A的濃度。結(jié)果顯示，腦和脊髓組織中，維甲酸濃度分別為：(12.96±0.09)vs.(40.53±1.18)，(17.23±0.91)vs.(33.89±5.41)，見圖2A，維甲酸濃度顯著升高有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。維生素A分別為：(14.07±0.27)vs.(24.13±1.14)，(11.53±0.07)vs.(30.73±2.29)，見圖2B，維生素A濃度顯著升高有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 RA誘導(dǎo)E10.5 NTDs小鼠維生素A和維甲酸表達(dá)變化

三、RA誘導(dǎo)NTDs小鼠胚腦、脊髓組織，H2BK120ub1蛋白水平表達(dá)變化

對E10.5的NTDs小鼠胚胎解剖，取脊髓組織和腦組織，行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：NTDs組小鼠胚胎相較于陰性對照組的小鼠胚胎，其脊髓和腦中H2BK120ub1表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)三次(n=3)，認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異，見圖3A、圖3B。

圖3 RA誘導(dǎo)E10.5的NTDs小鼠H2BK120ub1蛋白表達(dá)

四、RA誘導(dǎo)的NTDs胚腦、脊髓組織,神經(jīng)管發(fā)育基因表達(dá)變化

利用RA干預(yù)的E10.5小鼠NTDs模型驗(yàn)證分化基因在異常生理狀態(tài)下的變化。小鼠胚胎腦和脊髓組織qPCR結(jié)果示：神經(jīng)管發(fā)育基因Pax6、Nestin的mRNA水平明顯升高(P<0.05)，進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)三次(n=3)，有統(tǒng)計學(xué)差異 ，見圖4A、圖4B。

圖4 RA誘導(dǎo)E10.5的NTDs小鼠，Pax6、Nestin mRNA表達(dá)變化

五、RA誘導(dǎo)的NTDs胚腦、脊髓組織，神經(jīng)管發(fā)育基因與H2BK120ub結(jié)合變化

ChIP -qPCR 結(jié)果顯示，RA誘導(dǎo)的NTDs胚腦、脊髓組織H2BK120ub1與Pax6、Nestin基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力增強(qiáng)，Normal Rabbit IgG 抗體做陰性對照，進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)三次(n=3)，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖5A、圖5B。

圖5 RA誘導(dǎo)E10.5的NTDs小鼠，H2BK120ub1蛋白和Pax6、Nestin基因啟動子區(qū)域結(jié)合的變化

討 論

NTDs主要是由于胚胎受精后3～4周時神經(jīng)管閉合不完全導(dǎo)致的。NTDs由遺傳、外環(huán)境共同作用造成[7]。孕期葉酸缺乏、高糖高熱、酒精及藥物致畸均可引起NTDs[1]。外環(huán)境因素可以通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制影響NTDs的易感性[7]。然而其具體機(jī)制未闡明。因此，研究 NTDs發(fā)生的表觀遺傳機(jī)制有重要意義。組蛋白泛素化修飾作為常見的表觀遺傳修飾方法，對基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑有關(guān)鍵作用[7]。

RA參與神經(jīng)細(xì)胞增殖分化，在視力、器官生成方面有調(diào)控作用。在發(fā)育過程中，RA劑量紊亂能導(dǎo)致嚴(yán)重畸形，如NTDs[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)RA誘導(dǎo)NTDs胎鼠的腦和脊髓組織中，維生素A和維甲酸濃度顯著升高，提示胚胎期過量RA注射會引起腦、脊髓等重要器官維生素A、維甲酸過量表達(dá)，導(dǎo)致NTDs。

組蛋白H2AK119、H2BK120是常見單泛素化位點(diǎn)，這種修飾會作為染色質(zhì)狀態(tài)的信號存在。前期研究發(fā)現(xiàn)，RA誘導(dǎo)NTDs小鼠模型中，胚胎腦組織組蛋白H2AK119ub泛素化水平下調(diào)，會調(diào)控 Hox基因表達(dá)[7]。在本研究中，Western blot顯示：RA誘導(dǎo)NTDs小鼠模型中，其腦組織H2AK120ub1水平顯著上調(diào)。同時，RA會引起組蛋白甲基化H3K27me3，H3K4me3、組蛋白乙酰化H3K27ac水平發(fā)生改變[12]。研究發(fā)現(xiàn)，RA可結(jié)合核受體復(fù)合物，促使組蛋白N端尾部產(chǎn)生共價修飾，從而激活轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[13]、促進(jìn)細(xì)胞分化，進(jìn)而發(fā)揮表觀遺傳修飾作用。

表觀遺傳調(diào)控，特別是組蛋白修飾調(diào)控，是干細(xì)胞研究領(lǐng)域焦點(diǎn)。表觀遺傳能調(diào)節(jié)多能干細(xì)胞的自我更新和多向分化之間的平衡[14]。多潛能的原始外胚層細(xì)胞通過一系列發(fā)育調(diào)控因子進(jìn)一步發(fā)育分化為神經(jīng)干細(xì)胞，如原始外胚層細(xì)胞分化基因Cdx2、中胚層分化基因Nestin、Pax6[15]。早期胚胎發(fā)育信號通路調(diào)控受上述胚層分化基因調(diào)控，保證胚胎組織精細(xì)化形成，包括神經(jīng)管的發(fā)生和閉合[16]。其中Pax6、Nestin基因是神經(jīng)管發(fā)育相關(guān)基因[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)，RA誘導(dǎo)人畸胎瘤細(xì)胞NT2細(xì)胞系中，Nestin、Pax6被顯著激活[18]，本研究中RA誘導(dǎo)小鼠NTDs模型，其腦和脊髓組織的分化基因顯著上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證RA誘導(dǎo)對于胚層分化基因的影響。研究顯示H2BK120ub1在胚胎干細(xì)胞的分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。前期研究人員利用ChIP等方法，發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞分化到E7時，H2BK120ub1與Nestin、Pax6結(jié)合顯著增強(qiáng)，Nestin、Pax6 mRNA水平增高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA誘導(dǎo)NTDs小鼠胚腦，H2BK120ub1與Nestin、Pax6結(jié)合顯著增強(qiáng)，Nestin、Pax6表達(dá)增高，這和小鼠胚胎干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Pax基因是否突變與神經(jīng)管閉合相關(guān)信號通路有密切關(guān)聯(lián)[19]，研究發(fā)現(xiàn)該基因存在純合突變時，鼠胚會存在嚴(yán)重腦畸形,而該基因發(fā)生雜合突變時，小鼠腦異常會顯著減輕。Nestin基因?qū)τ谠缙谏窠?jīng)管發(fā)育發(fā)揮重要作用，敲除小鼠在胚胎E10.5死亡，神經(jīng)管發(fā)育受阻。神經(jīng)胚形成時，在E7.5，Nestin基因開始廣泛高表達(dá)；當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞遷移基本完成后,Nestin基因的表達(dá)量呈減少狀態(tài)；當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞遷移完成，E10.5時在頭尾部分神經(jīng)管區(qū)域表達(dá)，隨著停止細(xì)胞分裂，Nestin基因表達(dá)量降到最低[20-21]。因此，可用Nestin鑒定神經(jīng)干細(xì)胞以及用作早期原始神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志分子[22]。選擇RA誘導(dǎo)E10.5小鼠NTDs胚腦、脊髓組織，Nestin基因的異常增高可能與RA導(dǎo)致H2BK120ub1的轉(zhuǎn)錄活化水平增強(qiáng)有關(guān)，可能是導(dǎo)致NTDs發(fā)生的原因之一。

綜上所述，RA誘導(dǎo)的NTDs小鼠模型，腦、脊髓組織組蛋白單泛素化H2BK120蛋白表達(dá)水平增加，導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育基因Nestin、Pax6異常激活可能是引起NTDs發(fā)生的原因之一。