單囊胚凍融移植周期中不同冷凍保存時(shí)間對(duì)臨床妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響

江亞萍 姜銳 任新玲 靳鐳 賀慧

自1983年首例冷凍胚胎移植后獲得臨床妊娠，體外胚胎冷凍保存越來(lái)越多地用于輔助生殖技術(shù)(ART)[1]。這項(xiàng)技術(shù)的使用不僅提高了累計(jì)活產(chǎn)率，還降低了卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)的風(fēng)險(xiǎn)，并將多胎妊娠率降至最低[2-3]。此外，它還可用于因子宮容受性或植入前基因診斷而不適合進(jìn)行新鮮胚胎移植的患者，以及與某些婦科疾病或衰老相關(guān)的癌癥或卵巢儲(chǔ)備減少患者的生育能力保存[4]。胚胎冷凍技術(shù)主要分為兩類(lèi)：程序化冷凍和玻璃化冷凍，玻璃化冷凍具有更高的存活率和更好的臨床妊娠結(jié)局，近年來(lái)胚胎玻璃化冷凍已成為ART治療的基本工具，逐漸取代傳統(tǒng)的程序化冷凍[5-6]。然而，玻璃化冷凍中胚胎暴露于有一定胚胎毒性的高濃度冷凍保護(hù)劑和接觸液氮造成的潛在污染等安全性問(wèn)題也引起關(guān)注[2,7]。玻璃化冷凍是否會(huì)影響胚胎的生存能力和隨后的著床潛力仍有爭(zhēng)議。本研究將本中心在2018年1月—2020年12月期間進(jìn)行的玻璃化胚胎解凍周期進(jìn)行回顧性分析，探討單囊胚凍融移植周期中玻璃化冷凍保存時(shí)間對(duì)胚胎存活率、妊娠結(jié)局的影響，更好地為臨床工作提供參考。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析本生殖中心2018年1月—2020年12月9 462例玻璃化冷凍解凍單囊胚移植周期的患者資料。排除繼培移植、胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)、未成熟卵體外成熟(IVM)冷凍胚胎以及解凍的復(fù)凍胚胎。根據(jù)玻璃化冷凍保存時(shí)間分四組，保存時(shí)間0 ～ <2月組有3 350例；2 ～ <6月組有3 224例，6 ～ <12月組有1 448例；≥12月組有1 440例。

二、研究方法

1.胚胎評(píng)分和冷凍：卵母細(xì)胞通過(guò)常規(guī)體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)進(jìn)行授精。在受精的第3天，根據(jù)患者該周期的具體情況移植或冷凍一至兩個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的卵裂期胚胎，余下胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第五天(D5)或第六天(D6)。囊胚選用 Gardner 的評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]，首先根據(jù)囊胚腔擴(kuò)張等級(jí)分為1～6期；3期及以上胚胎根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層分別評(píng)級(jí)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分為A：細(xì)胞數(shù)多，緊密成團(tuán)，清晰可見(jiàn)；B：細(xì)胞數(shù)少，排列松散；C：細(xì)胞數(shù)極少，幾乎沒(méi)有，不清晰。滋養(yǎng)層分為A：細(xì)胞數(shù)多，呈鐮刀形連續(xù)平鋪；B:細(xì)胞數(shù)少，排列松散；C：細(xì)胞數(shù)極少，幾乎沒(méi)有，不清晰。冷凍標(biāo)準(zhǔn)為D5和D6形成≥3BC以上可利用囊胚。囊胚冷凍前人工皺縮：使用激光照射，在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處打孔，待其囊腔皺縮；6期囊胚需適當(dāng)調(diào)小激光作用時(shí)間。冷凍前將玻璃化冷凍液(日本加藤，其中包括1號(hào)液Equilibration Solution和2號(hào)液Vitrification Solution)置常溫預(yù)溫。根據(jù)冷凍試劑盒說(shuō)明將待冷凍胚胎放入1號(hào)液中并開(kāi)始計(jì)時(shí)，5～8 min后(觀察胚胎卵裂球狀態(tài))將胚胎移入2號(hào)液體(約0.2 mL)。在2號(hào)液內(nèi)將胚胎清洗數(shù)次，1 min內(nèi)將胚胎放置于冷凍載桿前端近黑色標(biāo)記處，將裝載胚胎的冷凍載桿迅速放入液氮中，在液氮中套上外套管。

2. 胚胎復(fù)蘇和移植：復(fù)蘇前將玻璃化復(fù)蘇試劑盒(KITAZATO，日本)置常溫預(yù)溫。根據(jù)復(fù)蘇試劑盒說(shuō)明將冷凍胚胎依次經(jīng)過(guò)試劑1號(hào)液、2號(hào)液、3號(hào)液清洗各1 min、3 min、5 min，轉(zhuǎn)入4號(hào)液后將培養(yǎng)皿放于37 ℃熱臺(tái)，5 min后將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中，觀察囊胚形態(tài)及細(xì)胞色澤，囊胚腔全部或部分?jǐn)U張為存活，培養(yǎng)箱培養(yǎng)待移植。復(fù)蘇存活率=復(fù)蘇胚胎數(shù)/存活胚胎數(shù)×100%，本中心非全部胚胎單管單凍，故復(fù)蘇及存活胚胎數(shù)≥移植胚胎數(shù)。移植前等待臨床醫(yī)生在B超引導(dǎo)下植入外套管進(jìn)入宮腔后，從培養(yǎng)箱取出移植皿并核對(duì)姓名，三段法將胚胎移至移植內(nèi)芯管(cook，美國(guó))中，由臨床醫(yī)生將胚胎置于距宮底1～1.5 cm 處。

3. 移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備：(1)人工周期。月經(jīng)第2～4天口服補(bǔ)佳樂(lè)(拜耳制藥，德國(guó))2 mg/d，第5～8天 2 mg/d bid，第9 ～12 天 3 mg/d bid。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥7 mm且雌激素作用時(shí)間≥10 d時(shí)，肌肉注射黃體酮，在黃體支持第6天進(jìn)行囊胚解凍。(2)降調(diào)人工周期。在早卵泡期肌內(nèi)注射長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)，28 d后給予補(bǔ)佳樂(lè)處理，后續(xù)方案同人工周期。(3)自然周期。根據(jù)患者月經(jīng)周期選擇從月經(jīng)第 10 ～12 天起B(yǎng)超監(jiān)測(cè)卵泡大小與子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，于排卵后4～5 d進(jìn)行囊胚解凍。

4. 妊娠及新生兒結(jié)局判斷：(1)臨床妊娠。囊胚移植12 d后抽血檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素(hCG)，陽(yáng)性者在移植后28 d進(jìn)行B超檢測(cè)，以B超見(jiàn)到宮腔內(nèi)妊娠囊且有胎心搏動(dòng)；(2)流產(chǎn)。臨床妊娠后胎兒丟失，終止妊娠；(3)活產(chǎn)。胎兒娩出后至少具有以下一項(xiàng)生命體征，包括心跳、呼吸、臍帶搏動(dòng)、隨意肌收縮；(4)早產(chǎn)。活產(chǎn)周期中，滿(mǎn)20周至37周前分娩；(5)巨大兒。出生體重大于4 000 g者；(6)低出生體重兒。出生體重小于2 500 g者；(7)極低出生體重兒。出生體重小于 1 500 g者。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件包，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率進(jìn)行描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)基線(xiàn)資料不齊時(shí)，采用Logistic回歸分析或線(xiàn)性回歸分析調(diào)整混雜因素對(duì)應(yīng)變量的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

不同冷凍保持時(shí)間組患者的一般資料見(jiàn)表1。與保存時(shí)間0～<2月組患者比較，其他三組移植時(shí)母親年齡較高，原發(fā)性不孕比例較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四組間的復(fù)蘇方案存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 其他指標(biāo)如患者BMI、內(nèi)膜厚度、不孕年限等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同冷凍保持時(shí)間組患者的一般資料比較

二、妊娠結(jié)局

四組患者的妊娠率分別為58.6%、56.3%、56.0%及55.7%，妊娠率略有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四組活產(chǎn)率分別為46.8%、45.0%、43.4%及43.7%，與0 ～ <2月組相比，6 ～ <12月組及≥12月組活產(chǎn)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四組間復(fù)蘇胚胎存活率、流產(chǎn)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。調(diào)整女方年齡、BMI、內(nèi)膜厚度、不孕類(lèi)型、不孕年限及復(fù)蘇方案等混雜因素的影響后，四組患者的上述指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表2)。

表2 玻璃化冷凍不同保存時(shí)間單囊胚復(fù)蘇移植后妊娠結(jié)局比較

三、新生兒結(jié)局

四組新生兒出生體重分別為(3 308.3±538.4)g，(3 301.9±563.1)g，(3 269.6±530.6)g以及(3 357.7±525.6)g，凍存時(shí)間0～<2月、2～<6月及6～<12月三組間新生兒出生體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而凍存時(shí)間≥12月組出生體重高于其余三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！?2月組的低出生體重兒比例高于0～<2月組(P<0.05)，調(diào)整女方年齡、BMI、內(nèi)膜厚度、不孕類(lèi)型、不孕年限及復(fù)蘇方案等混雜因素的影響后，差異依然存在，調(diào)整后OR=1.6，95%CI為1.0～2.6。其他新生兒結(jié)局，包括多胎比例、新生兒性別比例、分娩方式、出生時(shí)孕周、早產(chǎn)兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例以及巨大兒比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表 3)。

表3 玻璃化冷凍不同保存時(shí)間單囊胚復(fù)蘇移植后新生兒結(jié)局比較[例(%)]

討 論

近年來(lái)，隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的飛速發(fā)展，醫(yī)源性多胎妊娠已成為輔助生殖技術(shù)最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，單囊胚移植可以顯著降低多胎妊娠的發(fā)生，減少產(chǎn)科和子代風(fēng)險(xiǎn)。胚胎冷凍保存技術(shù)可將多胎妊娠率降至最低，提高累積活產(chǎn)率，同時(shí)降低卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。胚胎冷凍技術(shù)主要分為兩類(lèi)：程序化冷凍和玻璃化冷凍，玻璃化冷凍具有更高的存活率和更好的臨床妊娠結(jié)局，近年來(lái)胚胎玻璃化冷凍已成為ART治療的基本工具，逐漸取代傳統(tǒng)的程序化冷凍[5-6]。

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的廣泛應(yīng)用，延長(zhǎng)玻璃化冷凍胚胎保存時(shí)間的安全性引起了全世界的關(guān)注。評(píng)估冷凍保存時(shí)間對(duì)胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響已有文獻(xiàn)報(bào)道，但結(jié)果相互矛盾。

2011年趙慶紅等[9]及2015年趙靜等[10]的研究均表明，胚胎玻璃化冷凍保存時(shí)間不影響解凍后胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局。Ueno等人2018年進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，玻璃化冷凍囊胚的冷凍保存時(shí)間與妊娠和新生兒結(jié)局沒(méi)有顯著關(guān)系[11]。Wirleitner等人于2013年進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性研究，調(diào)查了603個(gè)胚胎移植周期中玻璃化冷凍囊胚的保存時(shí)間對(duì)存活率、植入率和新生兒結(jié)局的影響，他們的研究結(jié)果表明，延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)胚胎或后代都沒(méi)有明顯的負(fù)面影響[12]。然而唐永梅等[13]的研究表明隨著卵裂期胚胎玻璃化凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，臨床妊娠率有下降趨勢(shì)，而囊胚期胚胎凍存時(shí)間>721 d 將出現(xiàn)臨床妊娠率、胚胎種植率的明顯下降。Li等人2020年分析了24 698個(gè)冷凍移植周期中玻璃化冷凍囊胚和卵裂期胚胎保存時(shí)間的影響，他們的研究結(jié)果表明玻璃化冷凍胚胎的長(zhǎng)期保存對(duì)妊娠和活產(chǎn)結(jié)局有負(fù)面影響，但對(duì)新生兒結(jié)局沒(méi)有顯著影響[14]。

本文回顧性分析了近3年單囊胚解凍周期的結(jié)果表明，囊胚凍融胚胎臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率以及新生兒結(jié)局無(wú)明顯差異，而≥12月組，新生兒體重及低出生體重兒比例增加。但受樣本量限制，本結(jié)論需要更近一步的觀察。一項(xiàng)包括337 431名參與者的北歐隊(duì)列研究顯示，冷凍ET導(dǎo)致的早產(chǎn)和低出生體重率明顯低于新鮮ET，而巨大兒的產(chǎn)后發(fā)生率明顯較高[15]。此外有多篇文獻(xiàn)報(bào)告玻璃化冷凍胚胎移植后出生體重的增加，并推測(cè)這種增加與胚胎表觀基因組的改變有關(guān)[16-18]。后來(lái)的一項(xiàng)隊(duì)列研究表明，考慮到3年隨訪后的身體健康指數(shù)，冷凍和新鮮ET組之間沒(méi)有差異[19]。故本研究仍需對(duì)長(zhǎng)期保存胚胎種植后出生嬰兒進(jìn)一步跟蹤研究。

比起程序冷凍法，玻璃化冷凍保存胚胎的復(fù)蘇存活率、妊娠率、活產(chǎn)率明顯提高，增加了胚胎累計(jì)妊娠率，降低了多胎妊娠率，同時(shí)也成為PGT、預(yù)防OHSS 的重要手段。普遍認(rèn)為玻璃化冷凍是安全、有效的技術(shù)。本研究結(jié)果表明，一定時(shí)間內(nèi)，不同囊胚冷凍保存時(shí)間的存活率、妊娠率和新生兒結(jié)局無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而玻璃化冷凍采用的是高濃度保護(hù)劑，其是否具有胚胎毒性尚無(wú)定論，同時(shí)冷凍載體是否接觸液氮、胚胎存儲(chǔ)的環(huán)境等都應(yīng)被綜合考慮，冷凍胚胎應(yīng)該盡早移植，以便改善玻璃化凍融胚胎的臨床結(jié)局，保障后代的出生健康。