雙絨毛膜雙胎生長不一致的非靶向代謝組學(xué)研究

宮曉麗 魏瑗 李曉娜 郭一潔 趙揚(yáng)玉

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是產(chǎn)科常見的并發(fā)癥之一，國內(nèi)發(fā)病率為6%～13%[1]，可導(dǎo)致圍產(chǎn)期的不良妊娠結(jié)局，亦增加成人期代謝性疾病的發(fā)生風(fēng)險。FGR不僅在單胎妊娠中發(fā)生，雙胎妊娠時，兩胎兒生長不一致也會表現(xiàn)為一胎兒FGR，單絨毛膜雙胎妊娠(monochorionic double amniotic，MCDA)和雙絨毛膜雙胎妊娠(double chorionic double amniotic，DCDA)診斷標(biāo)準(zhǔn)略有不同，但均存在一胎兒存在生長受限的情況。盡管MCDA發(fā)生選擇性胎兒生長受限(selective fetal growth restriction，sFGR)的風(fēng)險更高，但在排除宮內(nèi)胎兒死亡和MCDA特異性并發(fā)癥后，絨毛膜性質(zhì)不同的雙胎在產(chǎn)科并發(fā)癥、新生兒死亡率和發(fā)病率方面并無差異[2]。新生兒發(fā)病率和死亡率隨兩胎兒體重差異增加而升高，當(dāng)體重差異在26%～30%時，相對危險度為2.9，當(dāng)差異升高到31%～40%時，相對危險度達(dá)5.6[3]。DCDA發(fā)生生長不一致的原因主要為胎盤灌注不足，研究顯示DCDA中生長受限兒更容易發(fā)生胎兒窘迫，且在發(fā)生胎兒窘迫前超聲顯示其臍動脈搏動指數(shù)(pulsatility index，PI)與單胎生長受限兒的表現(xiàn)一致，均為逐漸增加，而MCDA合并有雙胎輸血綜合征的小胎兒超聲表現(xiàn)為心輸出峰速增加，并無PI的變化[4]。

代謝組學(xué)是最接近表型的組學(xué)研究手段，能夠直接反映機(jī)體因生理或病理情況發(fā)生的變化。既往已有多項研究將代謝組學(xué)應(yīng)用于圍產(chǎn)領(lǐng)域來幫助診斷和預(yù)測妊娠期并發(fā)癥如子癇前期[5-6]，妊娠期糖尿病[7-8]等，從代謝的角度加深對疾病發(fā)生機(jī)制的理解。而應(yīng)用于FGR的研究主要集中在單胎妊娠，以及發(fā)生在MCDA的sFGR[9-16]，尚無研究關(guān)注DCDA雙胎生長不一致。本研究利用基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)的非靶向代謝組學(xué)方法篩選雙胎生長不一致兩胎兒臍血差異代謝物，以期為DCDA胎兒生長異常及FGR的發(fā)生機(jī)制提供更多線索。

對象與方法

一、研究對象

本研究為回顧性病例對照研究，經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[(2017)醫(yī)倫審第(089-02)號]。本研究納入2017年7月—2020年7月在北京大學(xué)第三醫(yī)院建檔并規(guī)律產(chǎn)檢的雙胎妊娠孕婦。

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：DCDA，雙胎均活產(chǎn)，孕婦年齡18～45歲；按照《雙胎妊娠臨床處理指南》[17]篩選雙胎生長不一致病例。生長不一致診斷標(biāo)準(zhǔn)：雙胎中一胎兒估測體重<同胎齡第3百分位數(shù)；或一胎兒符合以下3個條件中的至少2個：(1)一胎估測體重<第10百分位數(shù)；(2)2個胎兒估測體重差異≥25%；(3)較小胎兒的臍動脈搏動指數(shù)>第95百分位數(shù)。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：母體孕期嚴(yán)重并發(fā)癥或合并癥，如重度子癇前期，早發(fā)型子癇前期、妊娠期糖尿病等急慢性病史；胎兒染色體異?；蛳忍煨曰?。

二、研究方法

1. 臨床信息采集：(1)孕婦一般資料。主要包括年齡、身高、孕前體重等；(2)孕婦臨床資料。主要包括孕產(chǎn)次、既往疾病史、本次妊娠方式、并發(fā)癥、分娩孕周、分娩方式、有無胎膜早破等；(3)胎兒資料。主要包括性別和出生體重。

2. 樣本采集與儲存：采集分娩時兩胎兒臍血2～4 mL于EDTA抗凝管中離心后，移取上層血漿并分裝于1.5 mL離心管中，-80℃冰箱保存至檢測。

3. 非靶向代謝組學(xué)研究:

(1)儀器與試劑。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)配備有：DionexTMUltiMateTM3000超高效液相色譜(美國Thermo公司)，Q ExactiveTM四極桿軌道離子阱質(zhì)譜(美國Thermo公司)以及XCalibur質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集軟件(美國Thermo公司)。BEH Amide(1.7 μm 2.1 mm*100 mm)親水作用色譜柱(美國Waters公司)，Mix-3000 震蕩混勻器(杭州米歐儀器有限公司)，Mikro 220R臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Hettich公司)，真空離心濃縮儀(美國Thermo公司)，色譜純甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨(美國Fisher Scientific)，氨基酸同位素混合內(nèi)標(biāo)(美國CIL公司)。

(2)樣品制備。血漿樣本在4°C冰箱融化30～60分鐘，取100 μL血漿至1.5 mL離心管中，加入300 μL的乙腈，充分振蕩15秒，進(jìn)行蛋白沉淀。12 000 rpm，4℃，離心10分鐘。取上層液100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)(內(nèi)標(biāo)原液用75%乙腈稀釋5倍，成待加的內(nèi)標(biāo)液)。渦旋10秒，置于200 μL內(nèi)襯管中，待測。

(3)色譜條件。色譜柱：Waters UPLC BEH Amide(1.7 μm, 2.1 mm*100 mm)；流動相：A相為乙腈(含0.1%甲酸，10 mM乙酸銨)和B相為水(0.1%甲酸，10 mM乙酸銨)；洗脫程序見表1。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL；柱溫：40℃。

表1 樣本洗脫程序

4. 質(zhì)譜條件：質(zhì)譜分析采用裝備了熱電噴霧離子源的四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFisher Scientific Q ExactiveTM)。正離子離子源電壓為3.7 kv。毛細(xì)管加熱溫度320 ℃。鞘氣壓力30 psi，輔助氣壓力10 psi。容積加熱蒸發(fā)溫度300 ℃。鞘氣和輔助氣均為氮?dú)狻Ｅ鲎矚鉃榈獨(dú)?，壓力?.5 mTorr。一級全掃描參數(shù)為：分辨率70 000，自動增益控制目標(biāo)為1 × 106，最大隔離時間50 ms，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍50～1 500。液質(zhì)系統(tǒng)由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件控制，數(shù)據(jù)采集由該軟件操作。

5. 樣本分析質(zhì)控：為了評價樣本分析過程中儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，應(yīng)用質(zhì)控樣本(quality control，QC)和內(nèi)標(biāo)監(jiān)測整個分析過程。QC樣本為所有樣本等體積混合得到，前處理方法同真實(shí)樣品。分析過程中，先采用5個空白樣本平衡色譜柱，再用3個質(zhì)控樣本平衡柱條件；繼而每間隔6～8個樣本插入1個質(zhì)控樣本，監(jiān)測整個液質(zhì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。計算質(zhì)控樣本中提取的代謝特征的變異系數(shù)值，變異系數(shù)超過30%的代謝特征被刪除。

6. 非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理：將采集的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用Progenesis QI軟件處理，包括原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入、峰對齊、峰提取、歸一化等步驟，獲得保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)表格文件。色譜提取峰的時間為1至11 min，峰提取的強(qiáng)度限定為模式3。各種加合離子如加氫和加鈉等均去卷積到每一個離子特征。依據(jù)80%規(guī)則去除得到代謝物特征的零值[18]。應(yīng)用statTarget基于QC信號進(jìn)行隨機(jī)森林信號偏移校正(random forest signal correction，RFSC)方法[19]，對所有樣本的代謝特征進(jìn)行校正。采用Simca(Umetrics，版本14.1)統(tǒng)計分析軟件，Pareto scaling數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)用于比較兩胎兒代謝物的情況。根據(jù)PLS-DA模型計算得到變量權(quán)重值(variable importance for the projection，VIP)，以VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合單變量統(tǒng)計分析Wilcoxon符號秩檢驗、變化倍數(shù)(fold change, FC)分析，篩選差異代謝物特征。使用R軟件繪制火山圖，散點(diǎn)圖繪制采用GraphpadPrism 8.3軟件完成。差異代謝物鑒定通過與HMDB、KEGG和mzCloud等數(shù)據(jù)庫(搜庫一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜誤差均為10 ppm)以及標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)、二級譜碎裂規(guī)律等比對確定。熱圖及代謝通路富集用MetaboAnalyst 5.0分析獲得。

結(jié) 果

一、母體和胎兒一般情況

按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)共篩選出雙胎生長不一致26例，孕婦平均年齡(33.2±4.6)歲，BMI平均為(22.1±2.7)kg/m2，均為初產(chǎn)婦，均通過ART妊娠，分娩平均孕周(36.4±1.6)周。小胎兒平均出生體重為(1 966.8±305.8)g，大胎兒為(2 837.4±410.2)g，兩者有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)，且小胎兒體重均低于同胎齡第10百分位數(shù)；雙胎性別組成：女/女 3例，男/男 8例，男/女 15例。

二、代謝組學(xué)分析結(jié)果

1.數(shù)據(jù)質(zhì)量控制評價：樣本分析過程中，每隔6～8個樣本插入1個QC以及使用氨基酸同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液監(jiān)測液質(zhì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。氨基酸內(nèi)標(biāo)在校正后的相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)為2.6%至10.5%，均低于20%，提示所有樣本分析過程中儀器信號穩(wěn)定、重復(fù)性好。應(yīng)用statTarget對QC樣本進(jìn)行校正，圖1(a)計算所有QC樣品中檢測到的代謝物的RSD，校正后所有QC樣品代謝物的RSD均下降，RSD≤10%的代謝物數(shù)量增多(由53%提高到95%左右)，使得QC樣品在質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(RSD<30%)可重復(fù)檢測，見圖1 (b)。

圖1 (a)代謝物特征校正后RSD分布圖；(b)代謝物特征校正后RSD變化圖

2.雙胎生長不一致臍血代謝組學(xué)分析：采用PLS-DA模型的得分圖顯示兩組樣本分開趨勢明顯，提示生長不一致兩胎兒臍血代謝物具有差異，見圖2(a)。以VIP>1、P<0.05、FC>1.2或FC<0.83作為篩選條件，共篩選出318個差異代謝物，結(jié)果以火山圖呈現(xiàn)，見圖2(b)，紅色點(diǎn)代表與大胎兒相比，小胎兒臍血中有94個化合物上調(diào)，藍(lán)色點(diǎn)代表與大胎兒相比，小胎兒臍血中有224個化合物下調(diào)，灰色點(diǎn)代表無顯著差異的代謝物。經(jīng)搜庫及標(biāo)準(zhǔn)品比對，最終鑒定出35個代謝物(表2)。對鑒定出的差異代謝物進(jìn)一步做聚類分析，用熱圖呈現(xiàn)(圖3)，與大胎兒相比，有25個差異代謝物在小胎兒中表達(dá)下調(diào)，10個上調(diào)。

圖2 (a) PLS-DA得分圖，S代表雙胎生長不一致中體重較小胎兒，L代表體重較大胎兒；(b) 差異代謝物火山圖

圖3 差異代謝物聚類分析熱圖S代表雙胎生長不一致中體重較小胎兒，L代表體重較大胎兒

表2 雙胎生長不一致臍血差異代謝物

應(yīng)用MetaboAnalyst 5.0對篩選到的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析和富集分析，見圖4，圓圈越大，紅色越深，代表根據(jù)數(shù)據(jù)確定的代謝物對其相關(guān)的代謝途徑有重要影響，胎兒體重相關(guān)的差異代謝物主要與蛋氨酸代謝，精胺代謝，甜菜堿代謝、甘油磷脂等代謝通路有關(guān)。

圖4 (a)SPMDB數(shù)據(jù)庫富集分析；(b)通路分析

討 論

DCDA胎兒因起源于2個受精卵，所處母體環(huán)境相同，但在遺傳方面具有生長潛能的差異；然而遺傳學(xué)的差異可能并非導(dǎo)致生長不一致甚至一胎兒生長受限的主要原因。本研究中生長不一致組的小胎兒體重均低于同孕齡兒應(yīng)有體重的第10百分位數(shù)，提示這一胎兒存在生長受限的情況。因此，本研究結(jié)果從代謝角度對FGR的發(fā)生機(jī)制具有借鑒意義。目前有關(guān)代謝組學(xué)在DCDA胎兒生長發(fā)育中的研究十分有限。本研究首次應(yīng)用UPLC-MS非靶向代謝組學(xué)的分析方法對DCDA雙胎生長不一致臍血差異代謝物進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)生長受限兒與正常胎兒代謝輪廓存在差異，主要體現(xiàn)在氨基酸代謝、磷脂代謝等，盡管研究樣本不同，但所涉及代謝通路與本團(tuán)隊前期應(yīng)用氣相色譜技術(shù)在sFGR中的發(fā)現(xiàn)一致[20]，提示這些代謝通路對胎兒生長發(fā)育起重要作用。

氨基酸是胎兒發(fā)育和生長的重要前體，為蛋白質(zhì)、核苷酸和神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成提供來源。本研究發(fā)現(xiàn)蛋氨酸在生長受限兒中上調(diào)，此結(jié)果與在sIUGR[21]、單胎FGR[12]及體外實(shí)驗[14]中的結(jié)論一致。蛋氨酸在為人體提供甲基后生成同型半胱氨酸，多項研究報道高同型半胱氨酸血癥與胎兒生長受限有關(guān)[22-24]，高濃度的同型半胱氨酸可能會通過誘導(dǎo)過氧化氫和氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，絨毛血管數(shù)量減少，進(jìn)而抑制胎盤血液灌注。高同型半胱氨酸水平可通過降低內(nèi)皮細(xì)胞對精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而降低內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)[25-26]，而NO能夠抑制胎盤血管內(nèi)皮素I及血栓素A2來增加血循環(huán)量，進(jìn)而增加營養(yǎng)物質(zhì)供給[27]。精氨酸作為NO的前體，本研究顯示其在生長受限兒中下調(diào)，推測可能在同型半胱氨酸的影響下，與胎盤內(nèi)皮細(xì)胞對精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降相關(guān)。此外，同型半胱氨酸還可以通過調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移影響胎盤血管的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[28]。

本研究還觀察到色氨酸的中間代謝產(chǎn)物犬尿酸在生長受限兒中低于正常胎兒，與Dunn[29]，Horgan[14]等人在合并有胎兒生長受限的胎盤組織中的發(fā)現(xiàn)一致。本研究發(fā)現(xiàn)色氨酸的另一個中間代謝物5-羥吲哚乙酸在生長受限兒臍血中下調(diào)，與子癇前期患者的血漿和尿液中濃度降低趨勢一致[30]；子癇前期與FGR均為胎盤源性疾病，胎盤病理改變類似。FGR的胎盤功能不全，母體轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒的營養(yǎng)物質(zhì)有限，不足以滿足胎兒(尤其是大腦)對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗需求。色氨酸作為人體中重要神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的前體，本研究顯示色氨酸兩條主要代謝途徑中的犬尿酸及5-羥吲哚乙酸在生長受限兒中均下調(diào)，提示胎兒可能存在色氨酸缺乏或相關(guān)酶活性異常的情況；以及與自閉癥關(guān)系密切相關(guān)的5-羥色胺合成障礙[31]，研究顯示FGR胎兒發(fā)生自閉行為及社會和社會心理功能減退風(fēng)險更高[32]。

本研究發(fā)現(xiàn)膽堿和磷脂類代謝物在生長受限兒中下調(diào)。膽堿是體內(nèi)一種重要有機(jī)堿，神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和生物膜主要成分磷脂的前體，也可為各種甲基化反應(yīng)提供甲基，在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。動物實(shí)驗顯示對胎盤功能受損的孕鼠補(bǔ)充日糧中膽堿，可增加胎鼠的體重[33]；細(xì)胞實(shí)驗則證實(shí)膽堿可減低滋養(yǎng)細(xì)胞促炎、促凋及抗血管生成因子的豐度[34]，因此推測膽堿在胎兒及胎盤的生長發(fā)育方面發(fā)揮積極的作用。然而，在人群的研究中，結(jié)論尚不統(tǒng)一。來自西班牙的兩項病例對照研究顯示，與適于胎齡兒相比，膽堿在合并有FGR的胎兒臍血中水平更低[35-36]，與本研究結(jié)果一致。來自日本和荷蘭[37-38]的研究則顯示臍血膽堿濃度與出生體重負(fù)相關(guān)。另有研究顯示臍血膽堿水平與胎兒體重并無關(guān)系[39-40]。不一致的結(jié)果可能與樣本量、檢測方法、人群構(gòu)成或統(tǒng)計學(xué)方法有關(guān)，仍需更多的研究來確認(rèn)。

對差異代謝物進(jìn)行通路分析發(fā)現(xiàn)，代謝物主要影響半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甜菜堿代謝、磷脂代謝、精胺生物合成等，提示這些代謝通路紊亂可能參與了胎兒生長受限的發(fā)生發(fā)展。其中，甜菜堿代謝與蛋氨酸代謝都參與一碳代謝，一碳代謝是體內(nèi)主要甲基供體的來源，表觀遺傳可通過DNA甲基化、組蛋白的修飾等對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響胎兒生長。

本研究應(yīng)用代謝組學(xué)的方法篩選與DCDA雙胎生長不一致有關(guān)的臍血差異代謝物，排除了外界因素和母體環(huán)境影響，有助于對FGR發(fā)生機(jī)制的理解。然而，研究尚存在不足之處：首先，本研究所采用的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)僅為正離子模式，所獲代謝組信息不夠全面，無法覆蓋有機(jī)酸等負(fù)離子模式優(yōu)先檢測的化合物，可能會遺漏對胎兒生長發(fā)育重要的小分子代謝物；其次，尚有部分脂質(zhì)不能確定其具體代謝物名稱，需通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步驗證。

目前尚不清楚雙胎生長不一致的發(fā)生機(jī)制與代謝物的關(guān)系，胎盤作為母體和胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的器官，對于營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)起重要調(diào)控作用，弄清雙胎妊娠胎盤如何調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分配將有利于探索生長不一致的發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而為臨床干預(yù)，優(yōu)化妊娠結(jié)局提供更多依據(jù)。