快速響應(yīng)組氨酸的銥（Ⅲ）配合物熒光探針

王 慧，胡 磊，沈舒婷，于 坤，王亞軒，谷曉霞

皖南醫(yī)學院 藥學院，安徽 蕪湖 241002

0 引 言

金屬配合物因其優(yōu)良的光物理性質(zhì)，如斯托克斯位移較大、光穩(wěn)定性好、損傷閾值高、光學壽命長、量子產(chǎn)率高和發(fā)光波段易調(diào)節(jié)等優(yōu)勢，在生物成像、化學傳感、有機發(fā)光二極管、光動力學治療和抗腫瘤等多個領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用［1～3］。在眾多金屬配合物中，環(huán)金屬銥配合物（cyclometalated iridium complex）因磷光壽命短、量子產(chǎn)率高、激發(fā)態(tài)豐富，且其光物理化學性質(zhì)在環(huán)境或輔助配體改變時易呈現(xiàn)多種響應(yīng)，從而受到國內(nèi)外學者的青睞［4，5］。目前，銥配合物已被廣泛用于檢測陽離子（如Pb2+、Ag+、Hg2+等）、陰離子（如F-、Cl-、ClO-等）、氨基酸（如半胱氨酸、核苷酸、高半胱氨酸）、氧分子、pH 值等［6，7］。銥配合物熒光探針與有機分子熒光探針相比，可檢測的物質(zhì)范圍較小，如在氨基酸檢測中，銥配合物熒光探針大多用于檢測半胱氨酸和高半光氨酸［8，9］，而對于組氨酸的檢測還鮮見報道。組氨酸（histidine，His）作為一種人體必需氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)，在人體生理活動中有著重要作用。組氨酸水平異常與一些疾病有關(guān)，如慢性腎疾病、急性肝衰竭等［10］。因此，開發(fā)對組氨酸響應(yīng)快、靈敏度高的銥配合物探針仍具有挑戰(zhàn)性和潛在應(yīng)用價值。

鑒于此，本文以苯并噻唑為母體，以弱配位能力的乙腈分子作為受體單元，引入不同的末端基團，設(shè)計合成了兩種銥配合物探針（IrSN1 和IrSN2），并借助質(zhì)譜研究了探針響應(yīng)組氨酸的機理，借助熒光光譜研究了探針對組氨酸的識別性質(zhì)。此外，本文還考察了探針I(yè)rSN1 用于細胞成像的可行性。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

試劑：對羥基苯甲醛（98%）、2-氨基苯硫酚（96%）、三氯化銥（Ir＞52%）、4-（三氟甲基）苯甲醛（97%）、硝酸銀（99.8%）、四丁基溴化銨（99%）、二乙二醇單甲醚（99%）、對甲苯磺酰氯（99%），其他試劑為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司，實驗用水為超純水。

儀器：Bruker Avance 400 型磁共振儀（Bruker公司，TMS 為內(nèi)標），UV-5900PC 型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司），F(xiàn)-4600 型熒光分光光度計（HITACHI 公司），Nicolet FT-IR-is5 型傅里葉 變換紅外光譜儀（Thermo Fisher 公司，KBr 壓片），Aglient 7250& JEOL-JMS-T100LP AccuTOF型高分辨質(zhì)譜儀（Agilent 公司），TCS SP8 型激光共聚焦顯微成像儀（Leica 公司），Infinite 200 pro 型酶標儀（Tecan 公司）。

1.2 銥配合熒光探針I(yè)rSN1 和IrSN2 的合成與表征

銥配合物探針I(yè)rSN1，IrSN2 的合成路線如圖1所示。

圖1 探針I(yè)rSN1，IrSN2 的合成路線Fig.1 The synthesis routes of probes IrSN1 and IrSN2

1.2.1 配體L1 的合成與表征

在100 mL 圓底燒瓶中，依次加入中間體4-（2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基）苯甲醛（M1）［11］（2.24 g，10 mmol）、2-氨基苯硫酚（1.25 g，10 mmol）和15 mL 無水乙醇，加熱回流6 h 后，減壓蒸出大部分乙醇，冷卻至室溫，加入少量甲醇分散，析出淡黃色固體，減壓過濾，收集濾餅，真空干燥，得淡黃色固體L1（2.23 g），產(chǎn)率67%，磁共振氫譜（1H NMR，400 MHz，d6-DMSO）化學位移值δ：8.11（d，J=7.8 Hz，1H），8.03（t，J=6.3 Hz，3H），7.53（t，J=7.6 Hz，1H），7.43（t，J=7.6 Hz，1H），7.13（d，J=7.7 Hz，2H），4.19（m，2H），3.78（m，2H），3.61（m，2H），3.48（m，2H），3.25（s，3H）。

1.2.2 配體L2 的合成與表征

在100 mL 圓底燒瓶中，依次加入4-（三氟甲基）苯甲醛（M2）（1.74 g，10 mmol）、2-氨基苯硫酚（1.25 g，10 mmol）和15 mL 無水乙醇，加熱回流反應(yīng)6 h 后，冷卻至室溫，析出淡黃色固體，減壓過濾，收集濾餅，真空干燥，得淡黃色片狀固體L2（1.87 g），產(chǎn)率64%，1H NMR（400 MHz，d6-DMSO）化學位移值δ：8.32（d，J=8.1 Hz，2H），8.22（d，J=7.9 Hz，1H），8.14（d，J=8.1 Hz，1H），7.95（d，J=8.2 Hz，2H），7.61（t，J=7.6 Hz，1H），7.53（t，J=7.5 Hz，1H）。

1.2.3 IrSN1 和IrSN2 的 合 成 與 表 征

氬氣保護下，在避光的100 mL 三口燒瓶中，依次加入IrCl3·3H2O（0.70 g，2 mmol）和相應(yīng)配體L1或L2（4 mmol），溶 劑 為15 mL 乙 二 醇 單 乙 醚 和5 mL 水的混合溶劑，110oC 反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，析出固體，減壓過濾，收集濾餅用乙醇重結(jié)晶，得相應(yīng)的中間體銥二氯聚物。氬氣保護下，在避光的100 mL 三口燒瓶中，依次加入中間體銥二氯聚物（0.163 mmol）、硝酸銀（0.07 g，0.326 mmol）和30 mL 乙腈，加熱回流24 h 后，冷卻至室溫，減壓過濾，除去生成的氯化銀，收集濾液，蒸餾濃縮濾液后，加入少量二氯甲烷，有固體（為過量的硝酸銀）析出，減壓過濾，收集濾液，蒸出溶劑得相應(yīng)的產(chǎn)物IrSN1或IrSN2。

IrSN1為紫黑色固體，0.10 g，收率62%。1H NMR（400 MHz，d6-DMSO）數(shù)據(jù)：8.77（m，2H），8.32（m，3H），7.71（m，7H），6.56（m，2H），3.75（m，4H），3.51～3.41（m，16H），3.17～3.11（m，8H），2.08（s，8H）。磁共振碳譜13C NMR（101 MHz，d6-DMSO）數(shù)據(jù)：178.23，158.49，148.47，132.12，129.48，126.41，123.79，122.06，118.09，116.43，105.72，69.31，67.97，66.62，64.96，56.33。高分辨質(zhì)譜（ESI-MS）：理論值993.2964，實驗值890.1895［M-NO3--CH3CN］+。IrSN2 為橘紅色固體，0.11 g，收率78%。1H NMR（400 MHz，d6-DMSO）數(shù)據(jù)：8.89（d，J=8.3 Hz，2H），8.50（d，J=8.0 Hz，2H），8.06（d，J=7.9 Hz，2H），7.80（m，4H），7.23（t，J=9.5 Hz，2H），6.24（s，2H），2.09（s，6H）。13C NMR（101 MHz，d6-DMSO）數(shù) 據(jù)：177.97，148.07，143.49，138.84，130.24，128.30，128.00，127.19，127.05，125.34，122.72，119.01，117.69，116.45。ESI-MS數(shù)據(jù)：理論值893.055 2，實驗值791.042 3［MNO3--CH3CN+1］+。

1.3 熒光光譜測定

探針I(yè)rSN1 和IrSN2 用二甲基亞砜溶解，配制成濃度為1.0×10-3mol/L 的母液。選取牛血清白蛋白（BSA）、組蛋白（Histone）、谷胱甘肽（GSH）、焦磷酸鈉（ppi）以及16 種氨基酸（L-半胱氨酸（Cys）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-丙氨酸（Ala）、L-谷氨酸（Glu）、L-谷氨酰胺（Gln）、L-精氨酸（Arg）、L-賴氨酸（Lys）、L-絡(luò)氨酸（Tyr）、L-亮氨酸（Leu）、L-脯氨酸（Pro）、L-色氨酸（Try）、L-絲氨酸（Ser）、L-蘇氨酸（Thr）、L-纈氨酸（Val）、L-異亮氨酸（Iso）、L-組氨酸（His））作為分析物來源，其中BSA、組蛋白的濃度為5 mg/mL，其余分析物的濃度為1.0×10-2mol/L。分別移取50 μL 探針溶液和200 μL 上述各種分析物，置于5 mL 的容量瓶中，用DMF/PBS（體積比2/3）的混合溶液定容。熒光光譜測試條件：激發(fā)波長為405 nm，狹縫寬度均為10.0 nm，電壓為500 V。

1.4 細胞毒性測試與細胞成像方法

細胞毒性測試：采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法研究探針I(yè)rSN1 對人肝癌細胞株（HepG2 細胞）的毒性。在37oC，5%CO2條件下，將可傳代HepG2 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至密度85%左右時，移去孔中培養(yǎng)基，加入提前配制好的含不同濃度IrSN1 探針的培養(yǎng)基溶液，每孔加入溶液體積為100 μL，探針終濃度分別為4、8、10、15、20、25 μmol/L，同時設(shè)置對照組和調(diào)零組，每組設(shè)3 組平行實驗。與細胞共培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL MTT 溶液（10 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。移去孔中培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 二甲基亞砜溶液，恒溫低速振蕩10 min，用酶標儀測定490 nm 波長處每個孔中溶液吸光度值。

細胞成像測試：將HepG2 細胞接種于共聚焦小皿中，待皿內(nèi)細胞生長至密度50%左右時，將探針I(yè)rSN1（20 μmol/L）溶液加入到小皿中，與細胞共培養(yǎng)不同時間后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗兩遍，直接用于顯影。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針設(shè)計及反應(yīng)機理研究

在分子設(shè)計中，以弱配位能力的乙腈分子作為輔助配體，在配體中引入醚氧鏈和三氟甲基作為不同的供吸電子基團，考察不同結(jié)構(gòu)單元對探針識別組氨酸的影響。根據(jù)文獻報道［12］，在探針溶液中加入組氨酸后，組氨酸中咪唑環(huán)上的N 原子和氨基中的N 原子可與Ir 配位形成相應(yīng)的產(chǎn)物。基于此，利用高分辨質(zhì)譜研究了探針與組氨酸作用后的產(chǎn)物，結(jié)果如圖2 所示。探針I(yè)rSN1 和IrSN2 與組氨酸結(jié)合后，在質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)一個與產(chǎn)物相對應(yīng)的峰，峰位分別在1 004.233 6 和904.083 5，表明這兩種探針中的乙腈分子已被組氨酸取代并形成了相應(yīng)的產(chǎn)物。2021 年，Kostko 等［13］研究了水溶液中組氨酸的局部電子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在pH 7.0 時，胺基氮被質(zhì)子化，羧基碳被去質(zhì)子化，形成兩性離子結(jié)構(gòu)。因此，我們推測探針與組氨酸結(jié)合后的配位模式如圖3 所示，當探針中的乙腈分子被組氨酸取代后，組氨酸中的羧基以羧酸根離子形式存在。

圖2 探針I(yè)rSN1(a)和IrSN2(b)與組氨酸作用后的質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of probes IrSN1 (a)and IrSN2 (b)in the presence of excess His

圖3 推測的探針I(yè)rSN1 和IrSN2 與組氨酸的作用機理Fig.3 The possible mechanism of probes IrSN1 and IrSN2 reacting with His

為進一步理解探針對組氨酸的光學響應(yīng)，通過激發(fā)態(tài)密度泛函理論研究了探針與組氨酸反應(yīng)前后的分子軌道能級圖。理論計算采用Gaussian09程序包，對于激發(fā)態(tài)的優(yōu)化及熒光光譜的計算采用6-31g 基組（對于C、H、O、N、S、F 原子）及Lanl2dz基組（對于Ir 原子），實驗結(jié)果如圖4 所示。根據(jù)計算，探針I(yè)rSN1 和IrSN2 的發(fā)射峰分別位于524 nm和549 nm，是最高占據(jù)分子軌道（HOMO）到最低未占分子軌道（LUMO）躍遷，軌道間能級差ΔE分別為2.336 4 eV 和2.259 8 eV，振子強度f分別為0.001 0 和0.002 4，其中，HOMO 軌道電子云主要集中在配體L1 或L2 上，LUMO 軌道電子云主要集中在輔助配體乙腈分子上，可歸屬于配體與配體之間（L1L2CT，此處L1代表配體L1 或L2，L2代表輔助配體乙腈）的躍遷。探針I(yè)rSN1、IrSN2 與組氨酸反應(yīng)后，分別形成新的化合物IrSN1+His 和IrSN2+His。根據(jù)計算，IrSN1+His 的熒光發(fā)射峰位于537 nm，為HOMO-1 到LUMO 躍遷，ΔE=2.306 0 eV，f=0.012 0，其中，HOMO-1 軌道電子云主要集中在配體L1 和銥原子上，LUMO 軌道電子云主要集中在組氨酸上，是金屬到配體（MLCT，此處M 代表金屬銥原子，L 代表配體L1）和配體與配體之間（L1L2CT，此處L1代表配體L1，L2代表組氨酸）的混合躍遷；IrSN2+His 的熒光發(fā)射峰位于571 nm，為HOMO 到LUMO+2 躍 遷，ΔE=2.172 4 eV，f=0.010 9，其中，HOMO 軌道電子云主要集中在組氨酸分子上，LUMO+2 軌道電子云主要集中在銥原子和配體L2 上，是配體與配體（L1L2CT，此處L1代表組氨酸，L2代表配體L2）和配體到金屬之間（LMCT，此處L 代表組氨酸，M 代表金屬銥原子）的混合躍遷。探針與組氨酸反應(yīng)前后電子云的轉(zhuǎn)移以及振子強度的提高，有助于提高配合物的熒光強度。

圖4 探針I(yè)rSN1(a)和IrSN2(b)與組氨酸反應(yīng)前后的分子軌道能級圖Fig.4 The molecular orbitals distributions of probes IrSN1 (a)and IrSN2 (b)before and after the reaction with His

2.2 探針對組氨酸的選擇性和動力學研究

首先測試了探針I(yè)rSN1 和IrSN2 在DMF/PBS（體積比2/3）溶液中的紫外-可見吸收光譜。由圖5（a）可知，探針I(yè)rSN1 和IrSN2 在280～380 nm 之間有強吸收峰，在380～550 nm 之間吸收峰相對較弱，可歸因于配體內(nèi)π-π*躍遷以及混合的單線態(tài)和三線態(tài)的金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移（1MLCT 和3MLCT）。以405 nm 為激發(fā)波長，考察了在DMF/PBS 溶液中探針I(yè)rSN1 或IrSN2 與20 倍當量的組氨酸作用前后的熒光光譜。如圖5（b）所示，在探針溶液中加入組氨酸后，探針I(yè)rSN1 和IrSN2 的熒光強度分別增強了約4.5 倍和1.5 倍。與IrSN2 相比，探針I(yè)rSN1 的熒光強度增強更為明顯，表明探針I(yè)rSN1 對組氨酸的識別性能更強。

進一步考察了探針I(yè)rSN1 對組氨酸的特異性識別能力。在DMF/PBS 溶液中加入組氨酸或20 倍當量的其他分析物（包括15 種氨基酸、牛血清白蛋白（BSA）、組蛋白、ppi、谷胱甘肽（GSH）），檢測熒光強度比值的變化。如圖5（c）所示，只有組氨酸的加入才會引起探針I(yè)rSN1 的熒光強度發(fā)生明顯變化，而其他分析物的加入并沒有引起明顯的熒光強度變化，表明探針I(yè)rSN1 對組氨酸具有較好的選擇性。

本文還考察了探針I(yè)rSN1 識別組氨酸的速度。在10 μmol/L 探針I(yè)rSN1 溶液中加入20 倍當量的組氨酸后，每間隔1 min 掃描一次熒光光譜，取537 nm處的熒光強度值繪制動力學曲線。如圖5（d）所示，探針在537 nm 處的熒光強度隨時間的增加而逐漸增強，在15 min 時探針的熒光強度達到最大并趨于穩(wěn)定。與 已報道探 針［12，14］相比，探 針I(yè)rSN1 對組氨酸的響應(yīng)更快。

圖5 (a)探針I(yè)rSN1 和IrSN2 的紫外-可見吸收光譜;(b)探針I(yè)rSN1 和IrSN2 與組氨酸作用前后的熒光光譜;(c)探針I(yè)rSN1 與不同分析物作用后的熒光強度比值變化;(d)探針I(yè)rSN1 與組氨酸作用的動力學曲線Fig. 5 (a)UV-Vis absorption spectra of probes IrSN1 and IrSN2;(b)fluorescence spectra of probes IrSN1 and IrSN2 before and after reaction with His;(c)the fluorescence intensity change ratio of probe IrSN1 after adding various analytes;(d)kinetic curves of the interaction between probe IrSN1 and His

2.3 探針對組氨酸的檢測

圖6（a）為探針I(yè)rSN1 與不同濃度組氨酸作用后的熒光發(fā)射光譜圖。可以看出，探針I(yè)rSN1 的熒光強度隨著組氨酸濃度的增加逐漸增強，當組氨酸的濃度達到2.5×10-4mol/L 時，探針I(yè)rSN1 的熒光強度趨于穩(wěn)定。以組氨酸的濃度為橫坐標、探針I(yè)rSN1在537 nm處熒光強度為縱坐標作圖，結(jié)果如圖6（b）所示。探針I(yè)rSN1 的熒光強度與組氨酸的濃度在0～2.5×10-4mol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=2.38×106x+137.55，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6，利用公式3σ/斜率［15］（斜率=2.38×106）計算探針I(yè)rSN1對組氨酸的檢出限為9.67 μmol/L。

圖6 (a)探針I(yè)rSN1 與不同濃度的組氨酸作用后的熒光光譜;(b)探針I(yè)rSN1 的熒光強度值與組氨酸濃度間的線性關(guān)系Fig.6 (a)Fluorescence spectra of probe IrSN1 upon the addition of His with different concentration;(b)fluorescence titration curves of probe IrSN1 with the concentration of His 1-21:0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 μmol/L

2.4 探針I(yè)rSN1 的細胞成像

采用MTT 法考察了探針I(yè)rSN1 對HepG2 細胞的細胞毒性。不同濃度（4、8、10、15、20、25 μmol/L）探針I(yè)rSN1 溶液與HepG2 細胞共培養(yǎng)24 h 后，細胞存活率均高于80%，表明探針I(yè)rSN1 細胞毒性較低，適用于細胞成像研究。

利用共聚焦顯微鏡評估了探針I(yè)rSN1 對HepG2細胞內(nèi)組氨酸的檢測能力。將探針I(yè)rSN1（10 μmol/L）與HepG2 細胞在37oC 下共培養(yǎng)不同時間（0、15、30、40、60 min）后，用PBS 清洗3 次，直接進行共聚焦顯微成像，結(jié)果見圖7。由圖7 可知，當共培養(yǎng)時間小于15 min 時，細胞內(nèi)的熒光主要來源于細胞質(zhì)區(qū)域；當共培養(yǎng)時間超過30 min 時，可在整個細胞區(qū)域觀察到較強熒光信號。這說明隨著時間延長，探針I(yè)rSN1 與細胞內(nèi)組氨酸結(jié)合越多，導(dǎo)致細胞內(nèi)熒光信號增強。

圖7 探針I(yè)rSN1 與HepG2 細胞共孵育不同時間的細胞成像圖（標尺：20 μm）Fig.7 Cell imaging of HepG2 cells incubated with probe IrSN1 for different time（scale bar:20 μm）

3 結(jié) 語

本文設(shè)計、合成了兩種熒光增強型銥配合物探針I(yè)rSN1 和IrSN2，并將IrSN1 用于組氨酸的檢測及細胞內(nèi)成像。結(jié)果表明，探針中的乙腈分子可被組氨酸取代并參與配位，形成一種新的配合物。與探針I(yè)rSN2 相比，探針I(yè)rSN1 對組氨酸的響應(yīng)具有更高的靈敏度。在DMF/PBS 混合溶液中，探針I(yè)rSN1 對組氨酸的檢出限為9.67 μmol/L，其熒光強度能在15 min 內(nèi)達到最大并趨于穩(wěn)定，同時還能夠克服BSA、組蛋白、ppi、GSH 和其他15 種氨基酸等多種分析物的干擾，具有較好的選擇性。另外，探針I(yè)rSN1 細胞毒性較低，能夠全部著色細胞，可用于細胞內(nèi)組氨酸的成像分析。該實驗結(jié)果可望為設(shè)計、合成識別組氨酸的銥配合物探針提供實驗依據(jù)。