基于兩種熒光染料的內(nèi)標(biāo)比率型熒光探針檢測水體中銀離子

汪 鵬，熊威威，李文恒，翟 琨?，向東山?

1. 湖北民族大學(xué)生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北恩施445000

0 引 言

銀（silver，Ag）是一種重要的過渡金屬，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、電子、攝影、化妝品等領(lǐng)域［1］。Ag+是銀在自然界中一種常見的存在形式，在低濃度時(shí)具有很強(qiáng)的抗菌活性［2］，可以通過抑制游離巰基蛋白酶的活性抑制其生物學(xué)功能。隨著銀在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，排放到自然界中的Ag+越來越多，Ag+進(jìn)入到水和土壤后，可以被植物根系吸收，再通過食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康構(gòu)成威脅。據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)Ag+過多會(huì)導(dǎo)致精氨酸缺乏癥，還會(huì)對腦部、皮膚、眼睛、肝臟、腎臟和腸道造成損害［3］。因此，建立簡單、快速且準(zhǔn)確的Ag+定量檢測方法具有十分重要的意義。

分子熒光定量檢測法具有選擇性好、靈敏度及準(zhǔn)確度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此基于分子熒光分光光譜法對Ag+的檢測近年來引起了國內(nèi)外科研工作者的較多關(guān)注［1，4，5］。但目前的工作多是利用單一發(fā)射波長的熒光信號對Ag+進(jìn)行定量檢測，測定結(jié)果受環(huán)境因素影響較大，檢測結(jié)果的重復(fù)性較差。比率型熒光探針是一種通過兩個(gè)熒光信號強(qiáng)度比值的變化實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的定量檢測的方法，檢測結(jié)果受環(huán)境因素影響小，方法重復(fù)性更好、準(zhǔn)確度更高［6～8］。目前，基于比率型熒光探針對Ag+進(jìn)行定量檢測已有報(bào)道：Lu 等［9］利用離子印跡比率熒光探針實(shí)現(xiàn)了對Ag+的定量檢測；Jiao 等［10］利用無標(biāo)記的比率熒光碳點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對Ag+的定量檢測；Li等［11］合成一種硫黃素T 的有機(jī)/無機(jī)雜化納米材料實(shí)現(xiàn)了Ag+的比率熒光定量檢測。但這些方法還存在一些不足之處：一是需要合成納米材料或有機(jī)物作為熒光探針，且合成過程較為復(fù)雜；二是熒光探針?biāo)a(chǎn)生的信號強(qiáng)度較弱，不適于Ag+的痕量檢測。

核酸適配體（aptamer）是一種能特異性識別相應(yīng)靶標(biāo)分子的單鏈核酸［12，13］。據(jù)報(bào)道，Ag+的核酸適配體已被篩選出來且得到了較多應(yīng)用［14～17］。SG（SYBR GreenⅠ）是一種非常靈敏的核酸染料，在水溶液中的背景熒光很弱，但與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后熒光信號會(huì)顯著增強(qiáng)［18，19］。本文擬利用熒光染料TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體及核酸染料SG 構(gòu)建一種能特異性識別Ag+的比率型熒光探針，實(shí)現(xiàn)對Ag+高選擇性的定量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

儀器：RF-5301PC 型分子熒光光譜儀（Shimadzu公司），AA800 型原子吸收光譜儀（Perkin-Elmer 公司）及Ethos Plus 型微波消解系統(tǒng)（Milestone公司）。

試劑：硝酸銀（AgNO3）為優(yōu)級純，其他化學(xué)試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SG 生物試劑原液（上海瑞安生物技術(shù)有限公司）是用無水二甲基亞砜（DMSO）配制的10 000 倍濃縮液，使用時(shí)用雙蒸水稀釋10 000 倍配制成工作液；緩沖溶液為0.1 mol/L 的Tris-HNO3緩沖溶液（50 mmol/L NaNO3，pH 7.8）；熒光染料TAMRA 標(biāo)記的Ag+核酸適配體委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，其核苷酸堿基序列為：5′-TCTC TCT TCT CTT CAT AAA TCA ACA CAA CAC ACA-（CH2）6-TAMRA-3′（斜體部分為Ag+的適配體）；實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。

1.2 熒光探針的制備

將TAMRA 標(biāo)記的Ag+核酸適配體用0.1 mol/L Tris-HNO3緩沖溶液配制成濃度為5×10-7mol/L 的儲備液。先將50 μL 不同濃度（4×10-8～2.4×10-6mol/L）的AgNO3溶液加入到50 μL 5×10-7mol/L TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體中，再加入100 μL SG工作液，最后加入Tris-HNO3緩沖溶液至終體積為500 μL，混合均勻，用水浴鍋加熱至35 ℃，反應(yīng)9 min。停止反應(yīng)，冷卻至常溫后測定體系的熒光強(qiáng)度。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體濃度均為5×10-8mol/L，Ag+的濃度均為2.4×10-7mol/L。

1.3 水樣的采集與消解

自來水樣取自湖北民族大學(xué)生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天然礦泉水樣取自湖北省恩施市龍洞河源頭，取樣時(shí)間均為2019 年10 月8 日中午。自來水取樣時(shí)，先放水5 min 后再采集，天然礦泉水在水深20 cm 處采集水樣，所取水樣清澈透明、無色、無懸浮雜質(zhì)和沉淀，水樣帶回實(shí)驗(yàn)室后冷藏保存。水樣的消化步驟為：準(zhǔn)確量取10 mL 水樣于消解罐中，加入6 mL 濃HNO3和4 mL H2O2，置于微波消解系統(tǒng)中進(jìn)行消解。消化的升溫程序?yàn)椋合燃訜岬?20 ℃保持30 min，再升溫到140 ℃保持20 min，最后升溫至180 ℃保持20 min，消解完成后自然冷至室溫。將消解液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用1% 稀HNO3洗滌消解罐2～3 次，將洗滌液也倒入容量瓶中，然后定容至100 mL，搖勻，待測。

1.4 Ag+的檢測

Ag+的檢測通過測定SG 與TAMRA 熒光強(qiáng)度比值（ISG/ITAMRA）的變化來實(shí)現(xiàn)。SG 與TAMRA 的熒光信號采用同步熒光分析法測定。TAMRA 的最大發(fā)射波長（584 nm）與最大激發(fā)波長（560 nm）之差（Stokes 位移）為24 nm［20］，SG 最大發(fā)射波長（525 nm）與最大激發(fā)波長（499 nm）之差為26 nm［21］，它們的Stokes 位移很接近，可通過同步熒光分析法同時(shí)獲得它們的熒光信號。為了使兩種熒光染料同時(shí)獲得較好的熒光信號，本實(shí)驗(yàn)將同步掃描的波長間隔（Δλ）設(shè)置為25 nm，激發(fā)及發(fā)射狹縫的寬度均設(shè)置為10 nm。利用火焰原子吸收分光光度法測定Ag+時(shí)，先對樣品濃縮50 倍后再檢測。

1.5 方法的選擇性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)主要考察水樣中常見的金屬離子和水樣消解后有可能與Ag+發(fā)生反應(yīng)的陰離子對測定結(jié)果的影響。具體步驟為，在一系列Ag+濃度為2.0×10-7mol/L 的溶液中分別加入濃度為2.0×10-5mol/L 的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Hg2+、Mn2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cr3+、Al3+、SO42-及PO43-溶液，然后在相同的條件下與濃度為2.0×10-7mol/L的Ag+溶液（CK）進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測方法的原理

利用熒光染料標(biāo)記的核酸適配體及核酸染料SG 檢測Ag+的基本原理如圖1 所示。該方法中，在Ag+核酸適配體的3′端標(biāo)記了熒光染料TAMRA，在沒有目標(biāo)物Ag+存在時(shí)，TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體呈單鏈狀態(tài)，與SG 幾乎不發(fā)生作用，因此體系中SG 的熒光信號很弱。在有Ag+存在時(shí)，TAMRA標(biāo)記的核酸適配體中的C 堿基（胞嘧啶）通過“CAg+-C”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA），SG 可進(jìn)入雙鏈DNA 的雙螺旋小溝區(qū)域并與之結(jié)合，導(dǎo)致體系中SG 的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。溶液中Ag+越多，與TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體反應(yīng)后得到的雙鏈DNA 就越多，與雙鏈DNA 結(jié)合的SG 也就越多，作用后SG 的熒光也就越強(qiáng)。但熒光染料TAMRA 在適配體與Ag+反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生變化，即熒光染料TAMRA 的熒光強(qiáng)度與溶液中Ag+的濃度沒有關(guān)系。因此，可通過SG與TAMRA熒光強(qiáng)度比值（ISG/ITAMRA）的變化實(shí)現(xiàn)對Ag+的定量檢測。

圖1 基于比率型熒光探針對Ag+檢測的基本原理Fig.1 The basic principle of detection for silver ion based on ratiometric fluorescent probe

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 SG 工作液用量

在反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為9 min 及緩沖溶液的pH 值為7.8 的條件下，考察了體系中Ag+濃度為2.4×10-7mol/L 時(shí)加入SG 工作液的用量對測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖2）表明，當(dāng)SG 的用量小于70 μL 時(shí)，ISG/ITAMRA隨著SG 用量的增加而增大，當(dāng)SG 工作液的體積達(dá)到70 μL 后，繼續(xù)增加SG 工作液的體積，ISG/ITAMRA幾乎不再發(fā)生變化。為保證SG 工作液相對過量，本實(shí)驗(yàn)選擇加入的SG 工作液的體積為100 μL。

圖2 SG 用量對測定結(jié)果的影響Fig.2 Effect of SG volume on measurement results

2.2.2 緩沖溶液pH 值

本實(shí)驗(yàn)中，緩沖溶液pH 值對測定結(jié)果的影響可能表現(xiàn)在3 個(gè)方面：一是影響Ag+與核酸適配體反應(yīng)后形成雙鏈DNA 的穩(wěn)定性；二是影響TAMRA及SG 的發(fā)光效果；三是影響Ag+在溶液中的存在形式，Ag+在堿性條件下能與OH-反應(yīng)生成難溶的AgOH（AgOH 的溶度積KSP=2×10-8，本實(shí)驗(yàn)中Ag+檢測最大濃度為240.0 nmol/L 時(shí)，pH＞12.92會(huì)生成沉淀）。因此，本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為9 min 的條件下對緩沖溶液的pH 值進(jìn)行了考察。結(jié)果（圖3）表明，當(dāng)緩沖溶液的pH 值在6.6～7.8 之間時(shí)，ISG/ITAMRA隨pH 值的增加而增大；當(dāng)pH 值大于7.8 時(shí)，ISG/ITAMRA隨pH 值的增大而逐漸減小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇緩沖溶液的pH 值為7.8，此時(shí)，ISG/ITAMRA值最大，且在檢測范圍內(nèi)不會(huì)生成沉淀。

圖3 pH 值對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effect of pH value on the detection results

2.2.3 反應(yīng)溫度

在反應(yīng)時(shí)間為9 min、pH 7.8 的條件下對反應(yīng)溫度的影響進(jìn)行了考察。結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)反應(yīng)溫度在20～35 ℃之間時(shí)，ISG/ITAMRA隨溫度的升高而增大；當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，ISG/ITAMRA隨溫度的升高而快速減小。這主要是因?yàn)樵跍囟容^低時(shí)，升高溫度可以加快Ag+與核酸適配體的反應(yīng)速率，但當(dāng)溫度較高，超過了Ag+與核酸適配體反應(yīng)后所形成雙鏈DNA 的解鏈溫度時(shí)，雙鏈DNA 不能穩(wěn)定存在，導(dǎo)致ISG降低，ISG/ITAMRA值減小。因此本實(shí)驗(yàn)選擇的反應(yīng)溫度為35 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對測定結(jié)果的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the detection results

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間

在反應(yīng)溫度為35 ℃、pH 7.8 的條件下，對Ag+、TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體及SG 的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果（圖5）表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于9 min時(shí)，ISG/ITAMRA隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增大；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于9 min 后，ISG/ITAMRA隨反應(yīng)時(shí)間的增加變化較小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的反應(yīng)時(shí)間為9 min。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對測定結(jié)果的影響Fig.5 Effect of reaction time on the detection results

2.3 工作曲線、檢出限及精密度

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了ISG/ITAMRA與Ag+濃度之間的關(guān)系，圖6（a）為不同濃度Ag+體系所對應(yīng)的同步掃描熒光光譜，圖6（b）為ISG/ITAMRA與Ag+濃度（c）的線性關(guān)系圖。圖6（b）結(jié)果表明，在4.0～240.0 nmol/L 范圍內(nèi)，ISG/ITAMRA與Ag+濃度具有良好的線性關(guān)系，擬合的回歸方程為ISG/ITAMRA=0.006 0c+0.050 4（R2=0.998 1），方法的檢出限為2.0 nmol/L（3σ，n=9）。為了考察方法的精密度，對9 個(gè)相同濃度的Ag+（20 nmol/L）樣品分別用本文的比率法（以ISG/ITAMRA作熒光信號）和單色熒光法（以ISG作熒光信號）進(jìn)行測定，計(jì)算了兩種方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），比率法的RSD 為1.7%，單色熒光法的RSD 為3.5%，比率法具有更好的精密度。

圖6 不同濃度Ag+所對應(yīng)體系的同步掃描熒光光譜(a)以及ISG/ITAMRA與Ag+濃度的線性關(guān)系(b)Fig.6 Synchronous scanning fluorescence spectra of different concentrations of Ag+ for the detection system (a)and the linear relationship between ISG/ITAMRA and the concentration of Ag+ (b)a-j: 0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0, 30.0, 60.0, 120.0, 180.0, 240.0 nmol/L

2.4 方法的選擇性

在240.0 nmol/L 的Ag+溶液中分別加入100 倍濃度的其他金屬離子及陰離子SO42-、PO43-等干擾離子溶液，檢測體系ISG/ITAMRA的變化，考察方法的選擇性。結(jié)果（圖7）顯示，雖然上述干擾離子的濃度遠(yuǎn)大于Ag+濃度，但各樣品所對應(yīng)的體系ISG/ITAMRA均無明顯變化，表明該方法對Ag+具有很高的選擇性。

圖7 其他離子對Ag+檢測的影響Fig.7 Effect of other ions on Ag+ detection

2.5 實(shí)際樣品分析

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，用本方法及火焰原子吸收分光光度法（AAS 法，國標(biāo)法）分別對實(shí)際水樣（自來水和天然礦泉水）中的Ag+進(jìn)行了檢測，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。 分別取4 份自來水（編號T1～T4）和天然礦泉水（編號S1～S4）樣品，加入不同濃度的AgNO3溶液，消解后分別采用本方法和AAS 法（檢測前對樣品濃縮50 倍）［22］對各樣品中Ag+的濃度進(jìn)行檢測。結(jié)果（表1）表明，利用本方法測定的自來水和天然礦泉水中Ag+的含量分別為12.3 nmol/L 和21.2nmol/L，利用AAS 法測定的自來水和天然礦泉水中Ag+的含量分別為12.6 nmol/L和21.4 nmol/L，結(jié)果接近，且均低于飲用水中Ag+的國家限量標(biāo)準(zhǔn)（463.5 nmol/L）［23］；本方法的回收率在98.5%～101.8% 之間，AAS 法的回收率在98.0%～102.3% 之間，結(jié)果相差不大；本方法的RSD 均較小，說明本方法具有更好的重復(fù)性。

表1 本方法與AAS 法測定結(jié)果的比較(n=3)Table 1 Comparison of detection results between this method and AAS (n=3)

2.6 與已有檢測方法的比較

如表2 所示，與已報(bào)道的Ag+檢測方法［9～11，17，24］相比，本方法靈敏度更高，檢出限更低，適于Ag+的痕量檢測。

表2 本方法與已有的Ag+檢測方法的比較Table 2 Comparison of this method and other reported detection methods for Ag+nmol/L

3 結(jié) 語

本文利用熒光染料TAMRA 標(biāo)記的核酸適配體及核酸染料SG 建立了一種高選擇性定量檢測水體中Ag+的方法。與已有的基于比率型熒光探針檢測Ag+的方法相比，該方法具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：一是熒光探針合成較容易，檢測過程相對簡單；二是利用高靈敏的核酸染料SG 產(chǎn)生熒光信號，檢出限更低，靈敏度更高。該方法檢出限遠(yuǎn)低于飲用水中Ag+的國家限量標(biāo)準(zhǔn)，且受環(huán)境因素干擾較小，對自來水和天然礦泉水測定結(jié)果的RSD 均在2%以下，加標(biāo)回收率在98.5%～101.8%之間，可望用于實(shí)際飲用水的檢測。