高靈敏過氧亞硝酸根雙光子熒光探針的構(gòu)建與應(yīng)用

王旭梅，高明昱，孫 琦，宋新建，?

1. 湖北民族大學(xué)生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北恩施445000

0 引 言

過氧亞硝酸根（peroxynitrite，ONOO-）是一種細(xì)胞內(nèi)源性活性氧物種（reactive oxygen species，ROS），由生物系統(tǒng)中超氧陰離子自由基（O2?-）和一氧化氮（NO）快速反應(yīng)形成，具有抗菌活性和信號傳導(dǎo)作用[1]。體內(nèi)ONOO-濃度過高時，會氧化破壞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ONOO-還可以硝化酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸，從而影響細(xì)胞的正常生長[2～4]。因此，揭示細(xì)胞內(nèi)ONOO-的分布與濃度波動對于了解ONOO-在不同生理或病理過程中的作用至關(guān)重要。

雙光子激光共聚焦成像是一種重要的熒光成像工具[5～7]，其較長的激發(fā)波長可以減少生物背景熒光，提高信噪比[8]；對生物樣品的損傷較小，適于生物樣品的長時間成像觀測；其焦點(diǎn)激發(fā)的方式可避免焦點(diǎn)以外的光漂白，從而提高空間分辨率[9]；其近紅外激發(fā)可實(shí)現(xiàn)深度組織成像[10～12]。這些優(yōu)勢都為實(shí)時、原位檢測生物體中ONOO-的分布與水平變化提供了支持。然而，目前用于檢測ONOO-的大多數(shù)雙光子熒光探針缺乏大的雙光子熒光活性截面（δΦ），很難利用雙光子激光共聚焦成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)ONOO-的熒光成像分析。

6-羥基-2,3,4,4a-四氫-1H-氧雜蒽-1-酮（GCTPOC）是Yuan 課題組[13]2013 年合成的一種雙光子熒光團(tuán)。與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）及其剛性類似物相比，GCTPOC 表現(xiàn)出如下優(yōu)勢：1) 從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，GCTPOC 使用氧橋?qū)晒鈭F(tuán)單元鎖定成剛性平面結(jié)構(gòu)，類似于GFP發(fā)色團(tuán)的Z-異構(gòu)體，以防止芳基-烯烴的自由旋轉(zhuǎn)和雙鍵的E/Z 異構(gòu)化；2) GFP 生色團(tuán)咪唑啉酮環(huán)中的兩個氮原子被替換為碳原子，發(fā)色團(tuán)中的酰胺官能團(tuán)在GCTPOC 中轉(zhuǎn)變成羰基，具有更強(qiáng)的吸電子能力。可見，GCTPOC 具有更有效的推-拉結(jié)構(gòu)，因而具有更大的雙光子熒光活性截面。

為此，本工作以GCTPOC 為雙光子熒光團(tuán)、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮為ONOO-的識別基團(tuán)，設(shè)計并合成了一種用于檢測過氧亞硝酸根的雙光子熒光探針GCT-ONOO（圖1），可特異性識別并檢測細(xì)胞內(nèi)ONOO-。該探針對ONOO-具有較短的反應(yīng)時間（35 min），可應(yīng)用于監(jiān)測細(xì)胞外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO-含量的變化，并可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞炎癥過程中對ONOO-的高靈敏成像分析。

圖1 GCT-ONOO 探針對細(xì)胞內(nèi)ONOO-的響應(yīng)機(jī)理Fig.1 Response mechanism of GCT-ONOO probe to intracellular ONOO-

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑：SIN-1（5-氨基-3-(4-嗎啉基)-1,2,3-噁二唑鹽酸鹽）購自Cayman Chemical 公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco 公司；合成及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用藥品均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所有溶劑均購自上海國藥集團(tuán)；所有試劑均為分析純或更高純級，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化；實(shí)驗(yàn)所需溶液均使用超純水配制。

儀器：UV-2550 型紫外-可見分光光度計（UVVis，Shimadzu 公司），RF-6000 型熒光分光光度計（Shimadzu 公司），LSM780 NLO 型雙光子激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss 公司），6230 TOF 型電噴霧-高分辨時間質(zhì)譜儀（ESI-TOF，Agilent 公司），Ascend 400 型核磁共振儀（Bruker 公司），Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（ThermoFisher Scientific 公司）。

1.2 探針GCT-ONOO 的合成

GCTPOC 和化合物1 分別根據(jù)文獻(xiàn)[14]和[15]方法合成。

GCT-ONOO 的合成路線如圖2 所示。取300 mg GCTPOC（1.39 mmol）、525 mg 5-溴甲基-1-甲基吲哚啉-2,3-二酮（化合物1）（2.08 mmol）、60 mg NaOH（1.39 mmol）和20 mL 無水乙腈于50 mL圓底燒瓶中，室溫條件下攪拌反應(yīng)8 h，采用薄層色譜法（TLC）監(jiān)測反應(yīng)過程。待反應(yīng)完全后，用二氯甲烷萃取，再經(jīng)柱層析分離（石油醚/乙酸乙酯體積比1∶1）得到橙色固體，即為GCT-ONOO，產(chǎn)率33.2%。產(chǎn)物的磁共振氫譜（1H NMR，400 MHz,DMSO-d6）化學(xué)位移值δ：7.75(d,J=8.1 Hz,1H),7.61(s,1H),7.34(d,J=8.6 Hz,2H),7.16(d,J=8.1 Hz, 1H), 6.71～6.55(m, 2H), 5.11(s, 2H), 5.03～4.94(m,1H),3.14(s,3H),2.40～2.35(m,2H),1.92(t,J=13.6 Hz,2H),1.67(t,J=9.7 Hz,1H),1.23(s,1H)；磁共振碳譜（13C NMR，100 MHz,DMSO-d6）δ：196.68, 183.72, 161.83, 158.77, 157.44,151.54,138.16,132.05,131.71,130.71,128.19,125.42,117.94,115.83,111.05,109.99,102.43,75.01,69.01,38.69,29.46,26.56,17.80；高分辨質(zhì)譜（HR-MS，ESI-TOF）數(shù)據(jù)：C23H20NO5+[M+H]+理論值390.134 1；實(shí)驗(yàn)值390.135 6。

圖2 GCT-ONOO 的合成路線Fig.2 Synthetic route of probe GCT-ONOO

1.3 探針GCT-ONOO 的性能測試

1.3.1 水溶性

配制不同濃度（0.25、5、10、15、20 和25 μmol/L）的GCT-ONOO 溶液，分別與300 μmol/L ONOO-（由供體SIN-1 產(chǎn)生）在37 ℃、170 r/min 條件下反應(yīng)35 min，然后測試體系的紫外-可見（UV-Vis）吸收光譜，觀測體系在385 nm 處吸光度的變化，考察GCT-ONOO 的水溶性，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 雙光子熒光活性截面

采用雙光子誘導(dǎo)熒光法測定GCT-ONOO 于反應(yīng)前后的雙光子吸收截面[16]。

首先，以10 μmol/L 羅丹明B 乙醇溶液為參比溶液，測得探針GCT-ONOO 及GCTPOC 在甲醇溶液中的熒光量子產(chǎn)率Φs。計算公式如下

其中，A代表最大吸收波長的吸光度（A≤0.05）；Φ代表量子產(chǎn)率，n代表溶劑的折射率；F代表利用最大吸收波長激發(fā)后的熒光光譜積分面積；下標(biāo)s、r分別代表待測樣品和參比溶液。此處，Φr為羅丹明B 溶液的量子產(chǎn)率（0.71）。

以羅丹明6G 的甲醇溶液（5 μmol/L）為參比溶液，測定GCT-ONOO 在甲醇溶液中反應(yīng)前后的雙光子吸收截面δ（激發(fā)波長：760～900 nm），再通過δΦ計算雙光子熒光活性截面。雙光子吸收截面δ的計算公式如下：

其中，S為雙光子熒光光譜積分面積，c為溶液濃度；δr為羅丹明6G 溶液的雙光子吸收截面（70 GM，1 GM=1×10-50cm4·s·photons-1·molecule-1）。

1.3.3 光物理性質(zhì)

配 制 含10 μmol/L GCT-ONOO，SIN-1 分 別為0、80 μmol/L 的磷酸鹽（PBS）緩沖液（pH 7.4，含10% DMSO（二甲基亞砜）），于37 ℃、170 r/min 恒溫振蕩反應(yīng)35 min，檢測兩種反應(yīng)液的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，考察GCT-ONOO 的光物理性質(zhì)。

1.3.4 熒光發(fā)射光譜

配 制 含10 μmol/L GCT-ONOO、SIN-1 分 別為0、0.5、2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L 的 PBS 緩沖液（pH 7.4，含 10%DMSO），于37 ℃、170 r/min 恒溫振蕩反應(yīng)35 min。在激發(fā)波長為400 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm 條件下，掃描體系的熒光發(fā)射光譜。

1.3.5 時間依賴性

準(zhǔn)確配制濃度為10 μmol/L 的GCT-ONOO 檢測液（pH 7.4，含10% DMSO），測試該溶液分別與0、30、60 μmol/L SIN-1 反應(yīng)0、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min 時的熒光發(fā)射光譜，并以每個時間點(diǎn)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度對時間作圖。

1.3.6 pH 穩(wěn)定性

配制含10 μmol/L GCT-ONOO 的檢測液，在不同pH 值的PBS 緩沖液（pH 值分別為5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、8.0、8.4，含10% DMSO）中，分別與0、60 μmol/L SIN-1 溶液于37 ℃、170 r/min 恒溫振蕩反應(yīng)35 min，測試體系的熒光發(fā)射光譜，并以熒光強(qiáng)度對pH 值作圖。

1.3.7 選擇性

向10 μmol/L 的GCT-ONOO 溶 液 中，分 別 加入生物分子（1.0 mmol/L 同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys））、活性氧（100 μmol/L 過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2?-）和次氯酸（HClO））、活性氮（100 μmol/L 一氧化氮（NO）、亞硝酸根離子（NO2-））、活性硫（H2S）、金屬離子（20 μmol/L Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+）和ONOO-（60 μmol/L）的PBS 緩 沖 液（10 mmol/L, pH 7.4，含10% DMSO），于37 ℃、200 r/min 恒溫振蕩反應(yīng)35 min，測試體系的熒光發(fā)射光譜。

1.3.8 探針GCT-ONOO 的檢出限

GCT-ONOO 對ONOO-的檢出限（LOD）根據(jù)LOD=3σ/k計算。其中，σ表 示11 組GCT-ONOO(10 μmol/L)溶液在520 nm 處的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差，k表示GCT-ONOO 在線性范圍內(nèi)的斜率。

1.4 探針GCT-ONOO 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12 細(xì)胞，購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞數(shù)大于5×105cells/mL）置于含1%青霉素、1%鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，于37 °C培養(yǎng)箱（5% CO2、95%空氣）中培養(yǎng)。成像前一天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至玻底培養(yǎng)皿（直徑35 mm）中使其貼壁生長到合適密度。在與藥物或刺激物共同孵育前，先用37 °C 預(yù)熱過的PBS 緩沖溶液將細(xì)胞清洗兩次，除去液體，置于含有藥物或刺激物的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育。細(xì)胞成像前將PC12 細(xì)胞用PBS緩沖液清洗兩次，成像時雙光子激發(fā)波長為860 nm，熒光收集范圍為480～580 nm（綠色通道）。

1.4.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT（噻唑藍(lán)）法測定GCT-ONOO 的細(xì)胞毒性。將PC12 細(xì)胞接種于96 孔板中，將0、5、10、20、30 μmol/L GCT-ONOO 分 別 加 入 到 含10%DMSO 溶液的100 μL DMEM 培養(yǎng)基中（每個濃度設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)）。將上述用不同濃度GCTONOO 標(biāo)記的PC12 細(xì)胞孵育24 h 后，在每孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培育4 h，除去上清液，再加入150 μL DMSO 溶液，低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測試各體系在490 nm 處的吸光度。根據(jù)GCT-ONOO 標(biāo)記組和對照組的吸光度計算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針GCT-ONOO 的水溶性

首先考察了GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)后的水溶性。圖3 為不同濃度（0.25～25 μmol/L）GCTONOO 與300 μmol/L ONOO-反應(yīng)后的紫外-可見（UV-Vis）吸收光譜。由圖3 可知，體系最大吸收峰（385 nm）處的吸光度值與GCT-ONOO 濃度呈現(xiàn)出良好的正比例關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.996；在GCT-ONOO 濃度達(dá)到25 μmol/L 時，最大吸光度仍在上升，說明GCT-ONOO 具有良好的水溶性。這為GCT-ONOO 用于水溶液檢測和細(xì)胞成像奠定了基礎(chǔ)。

圖3 （a）不同濃度GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)后的UV-Vis 光譜；（b）體系385 nm 處吸光度與GCT-ONOO 濃度的關(guān)系曲線Fig.3 (a)UV-Vis absorption spectra of different concentrations of GCT-ONOO reacted with ONOO-;(b)the relationship between the absorbance at 385 nm of the system and the concentration of GCT-ONOO

2.2 探針GCT-ONOO 的雙光子熒光活性截面

通過雙光子誘導(dǎo)熒光法測定并計算GCTONOO（5 μmol/L）與ONOO-（80 μmol/L）反應(yīng)前后的雙光子熒光活性截面，結(jié)果如圖4 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在760～900 nm 范圍內(nèi)，GCT-ONOO與ONOO-反應(yīng)前雙光子熒光活性截面很小，而反應(yīng)后在860 nm 處出現(xiàn)最大的雙光子熒光活性截面（262 GM），表明該熒光染料具有良好的雙光子性能，可應(yīng)用于雙光子共聚焦成像。

圖4 GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)前后在不同激發(fā)波長下的雙光子熒光活性截面Fig.4 Two-photon fluorescence active cross section of GCT-ONOO probe reacting with or without ONOOat different exciting wavelengths

2.3 探針GCT-ONOO 的光物理性質(zhì)

進(jìn)一步測試了GCT-ONOO（10 μmol/L）與ONOO-（80 μmol/L）反應(yīng)前后的UV-Vis 光譜和熒光發(fā)射光譜。由圖5(a)可以看出，GCT-ONOO 反應(yīng)前的吸收峰強(qiáng)度可忽略不計，而與ONOO-反應(yīng)后在385 nm 處熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰。由圖5(b)可以看出，反應(yīng)前探針背景熒光強(qiáng)度很低，反應(yīng)后在520 nm 處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，Stokes 位移達(dá)到135 nm。

圖5 GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)前后的UV-Vis 光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Fig.5 UV-Vis spectra (a)and fluorescence emission spectra (b)of probe GCT-ONOO reacting with or without ONOO-

2.4 探針GCT-ONOO 的熒光響應(yīng)

探 究 了GCT-ONOO(10 μmol/L, pH 7.4,含10% DMSO)對不同濃度ONOO-(0～80 μmol/L)反應(yīng)35 min 后的濃度依賴關(guān)系。如圖6(a)所示，隨著ONOO-濃度的不斷增加，反應(yīng)體系在520 nm 處的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，加入ONOO-(80 μmol/L)比未加ONOO-的反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度增加了34.6 倍。圖6(b)為520 nm 處熒光強(qiáng)度與ONOO-濃度的關(guān)系曲線。圖6(c)顯示，在0.5～60 μmol/L 之間，GCTONOO 溶液的熒光強(qiáng)度與ONOO-濃度之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.996，由3σ/k（σ表示11組GCT-ONOO 溶液(10 μmol/L)在520 nm 處的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差，k表示GCT-ONOO 滴定光譜曲線在線性范圍內(nèi)的斜率）計算得到檢出限LOD 為13.5 nmol/L，說明該探針的靈敏度高。圖6(d)顯示，探 針GCT-ONOO 與ONOO-（30、60 μmol/L）可在35 min 內(nèi)反應(yīng)完全，之后隨著時間延長體系熒光強(qiáng)度基本保持不變，表明該探針對ONOO-的響應(yīng)較快。對GCT-ONOO 與ONOO-（60 μmol/L）在不同pH 值的PBS 緩沖液中的熒光響應(yīng)進(jìn)行了考察。如圖6(e)所示，pH 值對未加入ONOO-的GCT-ONOO 熒光強(qiáng)度幾乎無影響，而對加入ONOO-（60 μmol/L）后的體系熒光強(qiáng)度影響較大；pH 5.0～5.8 范圍內(nèi)，GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)后熒光強(qiáng)度基本沒有變化，而pH 5.8～8.4 范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度隨著pH 值的增加逐漸增強(qiáng)。這是因?yàn)樵趬A性條件下，GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)產(chǎn)物中的羥基變?yōu)檠踟?fù)離子，給電子能力增強(qiáng)而發(fā)出更強(qiáng)的熒光。本文還探討了GCT-ONOO(10 μmol/L)對13種不同干擾物的響應(yīng)情況(1.0 mmol/L Hcy、GSH、Cys，100 μmol/L H2O2、O2?-、HClO、NO、NO2-、H2S 和20 μmol/L Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+)。如圖6(f)所示，除ONOO-外，干擾物分子均未使探針GCT-ONOO 的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，顯示該探針對ONOO-具有高度的選擇性。

圖6 (a）GCT-ONOO 與不同濃度ONOO-反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜；（b）熒光強(qiáng)度和ONOO-濃度的關(guān)系曲線;(c)GCT-ONOO熒光強(qiáng)度與ONOO-濃度的線性擬合曲線；（d）GCT-ONOO 與ONOO-反應(yīng)不同時間的熒光強(qiáng)度；（e）pH 值對GCT-ONOO與ONOO-體系熒光強(qiáng)度的影響；（f）GCT-ONOO 對ONOO-的選擇性Fig.6 (a)Fluorescence emission spectra of the reaction between GCT-ONOO and different concentrations of ONOO-;(b)the relationship curve between fluorescence intensity and ONOO- concentration;(c)the linear fitting curve of fluorescence intensity and ONOO- concentration;(d)the fluorescence intensity of GCT-ONOO and ONOO- at different time;(e)the effect of pH value on fluorescence intensity of GCT-ONOO and ONOO- systems;(f)selectivity of GCT-ONOO to ONOO-1～16 in（a）：ONOO- 0，0.5，2，4，6，8，10，12，15，20，30，40，50，60，70，80 μmol/L

2.5 探針GCT-ONOO 的細(xì)胞毒性

為了考察GCT-ONOO 能否用于細(xì)胞內(nèi)ONOO-的檢測，采用MTT（噻唑藍(lán)）法評估GCTONOO 的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，PC12 細(xì)胞與不同濃度（0～30 μmol/L）的GCT-ONOO 共孵育24 h，細(xì)胞存活率仍達(dá)到93%以上，說明該探針細(xì)胞毒性低，可用于后續(xù)的細(xì)胞成像分析。

2.6 細(xì)胞外/內(nèi)源性O(shè)NOO-的檢測

先考察GCT-ONOO 對細(xì)胞外源性O(shè)NOO-的熒光成像。 在PC12 細(xì)胞中加入不同濃度的ONOO-釋放劑SIN-1（0、5、10、30 μmol/L）孵育30 min 后，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）繼續(xù)孵育20 min，然后進(jìn)行細(xì)胞成像。從圖7 結(jié)果可知，體系熒光強(qiáng)度隨ONOO-濃度的增加而增強(qiáng)，表明該探針可實(shí)現(xiàn)對外源性O(shè)NOO-的檢測。

圖7 （a）GCT-ONOO 與不同濃度SIN-1（0, 5, 10, 30 μmol/L）在細(xì)胞中的雙光子激光共聚焦成像；（b）（a）圖中各組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度Fig.7 (a)Two-photon laser confocal imaging of GCT-ONOO and different concentrations of SIN-1(0,5,10,30 μmol/L)in cells;(b)the relative fluorescence intensity of the corresponding cells in figure (a)λex=860 nm，λgreen=480-580 nm；the scale is 40 μm

SIN-1 之所以可釋放ONOO-是因?yàn)樗赏瑫r釋放NO 和O2?-，隨即反應(yīng)生成ONOO-[17]。因此，為了排除其他干擾物如活性氧及活性氮存在的潛在干擾，在體系中分別加入HClO 及ONOO-清除劑Minocycline（二甲胺四環(huán)素）、O2?-清除劑TEMPO（四甲基哌啶氮氧化物）和NO 合成酶抑制劑AG（氨基胍）3 種試劑，設(shè)置了6 組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：a 組將PC12細(xì)胞用GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min 建立Sham 組；b 組 中 加 入30 μmol/L HClO 孵 育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min；c 組將PC12 細(xì)胞置于30 μmol/L SIN-1 孵育30 min后，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min 建立對照組；d～f 組在加入30 μmol/L SIN-1 孵育30 min 后，再分別加入5 μg/mL Minocycline、TEMPO和AG，然后加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min。如圖8 所示，加入SIN-1 后體系熒光強(qiáng)度顯著增加，而加入3種抑制劑及HClO 后，熒光強(qiáng)度相對于對照組幾乎可忽略，進(jìn)一步表明GCT-ONOO 在細(xì)胞中可靈敏且特異性地識別ONOO-。

圖8 （a）各組細(xì)胞（a-f）的雙光子激光共聚焦成像；（b）(a)圖中各組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度Fig.8 (a)Two-photon laser confocal imaging in each group of cells (a-f);(b)the relative fluorescence intensity of each group of cells in figure (a)λex=860 nm，λgreen=480-580 nm；the scale is 40 μm

進(jìn)一步考察了GCT-ONOO 對細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO-的熒光成像。設(shè)計了5 組實(shí)驗(yàn)：a 組為Sham組；b 組加入1 μg/mL 脂多糖（LPS）、100 ng/mLγ-干擾素（IFN-γ）和10 ng/mL 佛波酯（PMA）進(jìn)行預(yù)處理以刺激細(xì)胞發(fā)生炎癥并產(chǎn)生內(nèi)源性O(shè)NOO-，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）孵育20 min 建立對照組；c～e 組在加入與b 組等量的LPS、IFN-γ和PMA 后，分別加入20 μg/mL Minocycline、TEMPO和AG 三種試劑孵育30 min，再加入GCT-ONOO（10 μmol/L）繼續(xù)孵育20 min。如圖9 所示，只加LPS、IFN-γ和PMA 三種刺激劑時，體系綠色熒光顯著增強(qiáng)（b 組），而加入Minocycline、TEMPO 和AG 后（c-e 組），卻只顯示很微弱的熒光。結(jié)果表明，GCT-ONOO 可用于檢測細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO-。

圖9 （a）GCT-ONOO 與細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO-的雙光子激光共聚焦成像；（b）（a）圖中各細(xì)胞組的相對熒光強(qiáng)度Fig.9 (a)Two-photon laser confocal imaging of GCT-ONOO and cellular endogenous ONOO-;(b)the relative fluorescence intensity of the corresponding cells in figure (a)λex=860 nm，λgreen=480-580 nm；the scale is 40 μm

3 結(jié) 語

本文采用具有優(yōu)異雙光子熒光活性截面的GCTPOC 為雙光子熒光團(tuán)、以1-甲基吲哚啉-2,3-二酮為ONOO-的識別基團(tuán)，設(shè)計并合成了一種ONOO-雙光子熒光探針GCT-ONOO。該探針?biāo)苄暂^好，熒光響應(yīng)倍數(shù)較高（熒光強(qiáng)度增加34.6倍）、響應(yīng)速度較快（35 min）、靈敏度好（檢出限低至13.5 nmol/L）、Stokes 位移大（135 nm），選擇性好，且可用于檢測細(xì)胞外源性O(shè)NOO-，并成功應(yīng)用于細(xì)胞炎癥模型中ONOO-的熒光成像分析。