化學生物傳感器快速檢測有機磷農(nóng)藥研究進展

吳 園，劉 珂，胡玲玲，梁建功，劉玲芝

華中農(nóng)業(yè)大學理學院，湖北武漢430070

0 引 言

我國從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的人口眾多，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐過程中，為預防、控制或消除害蟲和雜草、調(diào)節(jié)植物生長、保證作物產(chǎn)量和質(zhì)量、提高生產(chǎn)效率，農(nóng)藥的使用必不可少[1]。其中，有機磷農(nóng)藥（organophosphorus pesticides，OPs）由于品種多、效率高、殺蟲廣、價廉和市場占有率高等優(yōu)點在世界范圍內(nèi)被廣泛使用[2，3]。OPs 通常是油狀的磷酸酯類或白色晶狀的硫代磷酸酯類化合物，常見的有對硫磷、氧樂果、乙酰甲胺磷、敵敵畏、毒死蜱、稻瘟凈等，大多具有高毒性或中等毒性[4]。但在實際的生產(chǎn)中，OPs的有效利用率比較低，且會隨雨水沖刷進入土壤、水體、大氣中，造成嚴重的環(huán)境污染，進而對人類健康造成損害[5]。環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中殘留的OPs 經(jīng)過皮膚、呼吸道、黏膜等多種途徑進入人體，長年累月在體內(nèi)沉積[6]。進入人體后的OPs 和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase, AChE）發(fā)生反應，致使AChE無法水解乙酰膽堿（acetylcholine, ACh）底物；而ACh 在體內(nèi)大量積聚會造成持續(xù)的神經(jīng)沖動，引起毒蕈堿樣中毒病癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥[7]，多表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等出現(xiàn)異常，甚至造成神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、生理及生殖功能病變；OPs 還可能通過作用于線粒體，改變呼吸鏈的呼吸作用，抑制免疫系統(tǒng)的功能[8]，傷害組織細胞和DNA[9]。

隨著人們環(huán)保意識和農(nóng)產(chǎn)品安全意識的不斷增強，使用OPs 造成的農(nóng)藥殘留問題受到了越來越多的關注。因此，迫切需要提高OPs 的殘留分析水平，以保護生態(tài)系統(tǒng)和人類健康[10]。傳統(tǒng)的OPs 檢測方法如色譜法，包括高效液相色譜、氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術[11]，因其穩(wěn)定性好、重復度高被廣泛使用，但由于需要昂貴的大型設備、樣品需要預處理且耗時較長等缺點并不能用于快速檢測[12]。生物傳感技術一般利用能夠敏銳感受某種化學、物理信息的元件作為識別元件，特異性地快速識別復雜環(huán)境中的目標分子并與其發(fā)生作用產(chǎn)生生化信號；生化信號被信號轉換器捕捉、轉化為不同的信號種類，再經(jīng)過信號放大而被記錄下來[13]，從而實現(xiàn)定量檢測?；瘜W生物傳感技術根據(jù)產(chǎn)生的信號種類可分為電、熒光、比色和拉曼等。近年來，基于這些信號構建的化學生物傳感器快速檢測技術發(fā)展迅速。本文對基于上述信號的化學生物傳感技術構建的OPs 檢測方法進行總結，以期為農(nóng)藥殘留檢測相關研究人員提供參考。

1 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器具有設備簡單、操作簡便、靈敏度高、特異性強、響應速度快、成本低等優(yōu)點，且易于攜帶，方便用于現(xiàn)場檢測，已被廣泛應用于食品中OPs 的實時監(jiān)測[14～16]。用于檢測OPs 的電化學傳感器包括基于膽堿酯酶抑制型、非酶抑制型、抗體型及核酸適配體型的電化學生物傳感器。

1.1 基于膽堿酯酶抑制型的電化學生物傳感器

基于膽堿酯酶抑制型的電化學生物傳感器一般以對應的ACh 或丁酰膽堿（butyrylcholine, BCh）作為底物，其檢測原理可簡要概括為：在電極上固定膽堿酯酶，常用的包含AChE 和丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase, BChE），AChE 或BChE 可以催化對應的底物生成電化學活性物質(zhì)，產(chǎn)生明顯的氧化還原電化學信號；當加入有機磷農(nóng)藥后，膽堿酯酶的活性被抑制，電化學信號減弱，且減弱的程度與有機磷農(nóng)藥的濃度呈一定的線性關系，從而實現(xiàn)對OPs 的定量檢測。然而，由于食品和環(huán)境領域對有機磷農(nóng)藥探針的性能要求嚴格，且AChE 穩(wěn)定性較差，簡單地將膽堿酯酶固定在電極上已不能滿足有機磷農(nóng)藥檢測的實際需求。

近年來，用金屬、碳基以及復合納米材料等作為電化學生物傳感器的基底材料，可以很好地解決電化學生物傳感器檢出限、靈敏度的問題，提高其選擇性和靈敏度[17]，在OPs 檢測方面有著很好的應用潛力[18～22]。在這些材料中，石墨烯具有許多獨特的物理和化學性質(zhì)，如良好的機械強度、導電性和生物相容性。此外，三維石墨烯（three dimensional graphene, 3DG）因其多孔網(wǎng)狀結構，具有高孔隙率和高比表面積，可提供多個活性位點，均有助于酶的修飾。因此，Bao 等[23]基于三維石墨烯-氧化銅納米花復合結構（3DG-CuO NFs）開發(fā)了一種用于OPs 檢測的高靈敏度電化學生物傳感器。如圖1 所示，首先在玻碳電極（glassy carbon electrode, GCE）表面修飾3DG/CuO NFs 復合納米材料，隨后將AChE 和帶正電荷的殼聚糖（chitosan, CS）預混合后進一步修飾在電極上，AChE 催化底物乙酰硫代膽堿（acetylthiocholine, ATCh）生成的產(chǎn)物硫代膽堿（thiocholine, TCh）在電極上發(fā)生氧化還原反應，從而產(chǎn)生電化學信號。當反應體系中存在OPs 時，OPs 會抑制AChE 的活性，引起電化學信號的改變，從而實現(xiàn)對OPs 的定量檢測。在該工作中，采用具有網(wǎng)狀結構的3DG/CuO NFs 對電極進行修飾，不僅增加了電極的有效比表面積，還為AChE 的負載提供了有利的微環(huán)境，從而大幅度提高電化學生物傳感器的性能。在最佳檢測條件下，該電化學生物傳感器與馬拉硫磷的濃度在0.003～46.665 nmol/L之間呈現(xiàn)較好的線性關系，檢出限低至0.92 pmol/L，且具有良好的選擇性和穩(wěn)定性，在實際水樣品加標回收分析中回收率令人滿意，表現(xiàn)出現(xiàn)場檢測實際樣品中OPs 的潛力。

圖1 3DG-CuO NFs 修飾電極用于有機磷農(nóng)藥檢測[23]Fig.1 OPs detection based on 3DG-CuO NFs modified electrode[23]

基于膽堿酯酶的OPs 電化學生物傳感器發(fā)展較成熟，但AChE 與底物的孵育時間較長，且其活性易受外部環(huán)境的影響，導致方法的特異性不高。而且，AChE 穩(wěn)定性較差，BChE 對有機磷農(nóng)藥的靈敏度較差，這些缺點使得基于膽堿酯酶的電化學生物傳感器的實際應用受到一定程度的限制。

1.2 基于非酶抑制型的電化學生物傳感器

基于以上酶的缺陷，研究者開發(fā)出一種基于解磷定（pralidoxime, PAM）的非酶抑制方法用于各種OPs 的定量檢測。解磷定是OPs 中毒的常用解毒劑，可緩解OPs 毒性從而抑制乙酰膽堿酯酶活性，常用作電活性探針[24]。如Tunesi 等[25]首先采用庚二酸（pimelic acid）作為模板、CuCl2作為成核原料在氧化銦錫（indium tin oxide, ITO）電極表面原位生長有序排列的CuO 納米花材料，再將CuO 納米花修飾的ITO 電極置于含PAM 的均相溶液中，在其表面固定PAM（圖2（a））。其中，庚二酸作為生長模板，不僅對CuO 納米花的有序形成具有有效的生長調(diào)節(jié)作用，而且其分子中帶負電荷的羧基還有助于PAM 在ITO 電極表面的固定。另外，CuO 納米花修飾可有效增大ITO 電極的比表面積，提供足夠大的電極表面以固定PAM 進行電活性測定（圖2（b））。該電化學傳感器成功完成了對毒死蜱、倍硫磷和甲基對硫磷三種OPs 的定量檢測，在0.01～0.16 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，檢出限分別達到1.6×10-9、2.5×10-9、6.7×10-9mol/L。此外，該傳感器適用于蔬菜中毒死蜱殘留的檢測，具有出色的靈敏度、重現(xiàn)性和抗干擾能力。

圖2 ITO 電極表面原位生長CuO 納米花材料(a)用于電化學檢測OPs(b)[25]Fig.2 In-situ growth of CuO nanoflowers on the surface of ITO substrate (a)for electrochemical detection of OPs (b)[25]

1.3 基于抗體的電化學生物傳感器

基于抗體的電化學生物傳感器又稱為電化學免疫傳感器，是基于抗原-抗體特異性識別的分析檢測方法，其檢測OPs 的原理可概括為：首先將待測OPs 的抗體修飾在電極上，通過特異性識別捕獲OPs，當有OPs 存在時，電極表面的阻抗會發(fā)生變化或標記的電化學活性物質(zhì)的氧化還原信號會發(fā)生改變，且信號改變的程度與OPs 的濃度有一定的線性關系，以此實現(xiàn)對OPs 的定量檢測。

Kaur 等[26]通過對新西蘭雄性白兔皮下免疫方法制備有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷的抗體，并將該抗體修飾在聚-乙烯二氧噻吩和羧化多壁碳納米管制備的電極上，用于制備電化學免疫傳感器。當溶液中存在目標物馬拉硫磷時，固定在電極上的抗體可以特異性識別并捕獲馬拉硫磷，從而改變了該電極的電阻，使溶液中的電化學活性物質(zhì)鐵離子的電化學信號發(fā)生改變，且改變的強度與馬拉硫磷的濃度呈現(xiàn)一定的線性關系。在優(yōu)化的實驗條件下，該電化學免疫傳感器的檢出限低至1.1 fmol/L，且可用于實際樣品的加標回收檢測，回收率優(yōu)于液相色譜法檢測馬拉硫磷的回收率。

電化學免疫傳感器是基于抗體-抗原之間的免疫反應，具有優(yōu)異的特異性和靈敏度。但是，抗體制備需要活體，且由于有機磷農(nóng)藥分子量小、免疫原性低，導致其抗體制備過程異常繁瑣，成本昂貴。此外，抗體存在批次差異性，其活性也容易受到外界條件的影響，不易保存和運輸。這些缺點均限制了電化學免疫傳感器用于實際樣品中有機磷農(nóng)藥的檢測。

1.4 基于核酸適配體的電化學生物傳感器

核酸適配體是一小段通過體外篩選技術得到的DNA 或RNA 單鏈序列，可通過化學方法體外合成，能夠高特異性識別靶標分子，也被稱為“化學抗體”[27]。目前研究者已經(jīng)開發(fā)出一系列的基于核酸適配體的電化學生物傳感器用于檢測OPs，其主要檢測原理可概括為：首先將標記有電化學活性物質(zhì)的核酸適配體序列固定在電極上，當有目標OPs 存在時，目標OPs 與核酸適配體結合后，核酸適配體發(fā)生構象變化，導致電化學活性物質(zhì)與電極之間的距離發(fā)生改變，從而引起電化學信號發(fā)生變化，且信號變化的程度與OPs 的濃度存在一定的相關性，實現(xiàn)對目標OPs 的定量檢測。

Qi 等[28]利用啶蟲脒（acetamiprid, Ace）和丙溴磷（profenofos, Pro）兩種農(nóng)藥分子分別與其核酸適配體之間的高度親和性制備了這兩種農(nóng)藥的電化學生物傳感器。如圖3 所示，首先，作者將Ace 和Pro 的核酸適配體序列經(jīng)過巧妙設計分別形成發(fā)夾型結構HP1 和HP2。在沒有Ace 或Pro 存在時，HP1 和HP2 的發(fā)夾型結構保持不變。當有Ace 和Pro 存在時，HP1 和HP2 的發(fā)夾型結構被打開，可分別與修飾有電化學活性物質(zhì)的亞甲基藍修飾的DNA 序列（MB-DNA）和二茂鐵修飾的DNA 序列（Fc-DNA）形成部分互補序列Ace@HP1@MB 和Pro@HP2@Fc。在核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ,ExoⅢ）的輔助作用下，溶液中生成大量電活性染料標記的單鏈核苷酸序列。因此，兩種電化學信號明顯增加，可同時實現(xiàn)對兩種農(nóng)藥的高靈敏檢測，Ace和Pro 的檢出限分別為0.004 8、0.008 9 nmol/L。與單一農(nóng)藥分析的電化學生物傳感器相比，該方法具有相當或更低的檢出限，而且實現(xiàn)了多種農(nóng)藥分子的同時檢測。

圖3 基于核酸適配體電化學生物傳感器檢測OPs[28]Fig.3 Electrochemical biosenor for OPs detection based on aptamers[28]

相對基于酶和抗體的電化學生物傳感器，基于核酸適配體的電化學生物傳感器更穩(wěn)定，而且利用核酸適配體序列的易設計性、易修飾性和DNA 組裝技術引起的構象變化可以有效實現(xiàn)信號放大，提高傳感器的靈敏度。但目前已篩選得到的OPs 的核酸適配體種類有限，且核酸適配體易被核酸酶降解，限制了基于核酸適配體的電化學生物傳感器的發(fā)展。

2 熒光化學生物傳感器

熒光檢測法是根據(jù)不同待測物質(zhì)激發(fā)和發(fā)射光波長的差異[29]，且體系的熒光強度與待測物濃度之間具有一定的線性關系，從而實現(xiàn)待測物的定量分析。相比于其他分析方法，基于熒光信號的化學生物傳感器檢測方法具有靈敏度高、選擇性好、背景信號低、響應速度快和操作簡單等優(yōu)點，廣泛用于OPs 的定量檢測[30，31]。某些OPs 分子中的官能團或其水解產(chǎn)物、還原產(chǎn)物能夠與某些試劑發(fā)生化學反應，體系在特定波長的激發(fā)光照射下產(chǎn)生特定波長的發(fā)射光，從而能夠直接進行定量檢測。當檢測靈敏度低下、OPs 本身無熒光時，可以引入熒光探針進行間接檢測OPs[32]。熒光納米材料具有熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、比表面積大、尺寸可精準調(diào)控、抗光漂白能力強等優(yōu)點，且易于功能化修飾，被廣泛用于OPs 的檢測[33～35]。

基于熒光納米材料檢測OPs 的熒光化學生物傳感器檢測原理主要分為3 類：1）熒光納米材料表面的活性基團與OPs 直接作用，從而改變其熒光信號；2）熒光納米材料與其他發(fā)光團或猝滅劑結合后，熒光發(fā)生猝滅或者其他變化，再加入OPs 后，熒光信號恢復或者發(fā)生其他變化；3）OPs 結合某些特異性識別元件(如抗體、核酸適配體、酶、多肽等)引起熒光納米材料的熒光信號發(fā)生變化。熒光信號的變化與OPs 的濃度存在一定的線性關系，從而可以構建高度靈敏的熒光化學生物傳感器用于檢測OPs。根據(jù)待測OPs 引起的熒光納米探針熒光強度的不同變化，可以將這些熒光探針分為猝滅型（On-Off 型）、增敏型（Off-On 型）和比率型。

2.1 On-Off 型熒光化學生物傳感器

On-Off 型熒光化學生物傳感器一般是指本身具有熒光，而與待測物共孵育后，在特定的激發(fā)光照射下發(fā)射出的單波長熒光被猝滅的一類化學物質(zhì)，其熒光的猝滅程度與待測物的濃度成一定的線性 關 系[36，37]。Yan 等[38]基 于碳點（carbon dots，CDs）和二氧化錳（MnO2）納米片之間的熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）效應開發(fā)了一種OPs 熒光化學生物傳感器（圖4）。其中，CDs 的熒光可以被吸附在其表面的MnO2納米片猝滅；BChE 可催化ATCh 底物生成TCh 產(chǎn)物，隨后TCh 可以使吸附在CDs 表面的MnO2納米片降解成Mn2+，從而使CDs 熒光恢復。然而，當有OPs 存在時，OPs 可以抑制BChE 的酶活性，從而抑制TCh的生成和MnO2的降解，同時系統(tǒng)的熒光強度發(fā)生變化。因此，該熒光化學生物傳感器可用于OPs 的定量檢測。最優(yōu)條件下，該傳感器對對氧磷的濃度檢測范圍為0.05～5 ng/mL，檢出限為0.015 ng/mL。采用這種方法還可以觀察到樣品顏色隨濃度的變化，且方法操作簡便、環(huán)境友好。

圖4 基于CDs-MnO2納米片檢測OPs[38]Fig.4 OPs detection based on CDs-MnO2 nanosheets[38]

2.2 Off-On 型熒光化學生物傳感器

Off-On 型熒光化學生物傳感器一般是指本身沒有熒光或熒光很弱，在加入待測物后熒光增強或恢復的一類化學物質(zhì)[39]。

Wang 等[40]構建了一種四苯基乙烯（tetraphenylethylene, TPE）修飾的多肽化學生物傳感器，其中TPE 分子具有聚集誘導發(fā)光（aggregation induced emission, AIE）特性，在分散狀態(tài)下無熒光，聚集后發(fā)射熒光（圖5）。OPs 可以特異性地與TPE-多肽傳感器結合，使修飾有TPE 分子的多肽傳感器發(fā)生自組裝聚集而發(fā)射熒光。根據(jù)TPE 的聚集程度與OPs 濃度的相關性可實現(xiàn)對OPs 的檢測，檢出限為0.6 μmol/L，可用于實際樣品的檢測。用于OPs 檢測的Off-On 型探針不如On-Off 型探針常見，但由于其熒光信號是從無到有，故其靈敏度明顯較后者高[41～43]。

圖5 TPE 修飾的多肽傳感器檢測OPs[40]Fig.5 TPE-modified peptide sensor for OPs detection[40]

2.3 比率型熒光化學生物傳感器

比率型熒光化學生物傳感器一般是指在同一激發(fā)光照射下會發(fā)射出兩個不同波長的光，而在加入待測物后，利用這兩個發(fā)射波長下的熒光強度變化的比值實現(xiàn)對待測物的定量檢測的一類化學物質(zhì)，可以降低光漂白和儀器光源帶來的檢測誤差[44]。Zhang 等[45]開發(fā)了一種多巴胺二硫代氨基甲酸酯（dopamine dithiocarbamate, DDTC）修飾的錳摻雜ZnS 半導體雙熒光發(fā)射納米傳感器用于OPs 的檢測。在單波長激發(fā)下，該探針在600 nm 和435 nm波長處表現(xiàn)出分辨率良好的紅色和藍色雙熒光發(fā)射譜帶，探針與表面修飾的DDTC 可發(fā)生光致電子轉移（photoinduced electron transfer, PET）效應，使探針600 nm 處的紅色熒光被猝滅；當加入硫代磷酸二乙酯（diethylphosphorothioate, DEP）類OPs 后，由于DEP 與DDTC 之間的強配位作用，DEP 取代DDTC 與傳感器發(fā)生反應，導致PET 效應消失，使探針600 nm 處的紅色熒光恢復。整個過程中，探針在435 nm 處的藍色熒光強度幾乎沒有發(fā)生變化，可作為內(nèi)參實現(xiàn)DEP 類OPs 的比率型熒光檢測，在0～100 μmol/L 范圍內(nèi)檢出限為1.8 μmol/L。

基于熒光納米材料的化學生物傳感器的熒光信號直接來源于發(fā)光納米材料，所以制備發(fā)射近紅外光且熒光量子產(chǎn)率高的熒光納米材料對于開發(fā)面向OPs 的高靈敏檢測平臺至關重要。雖然在過去幾十年里已經(jīng)開發(fā)出許多不同的熒光納米材料，如各種半導體發(fā)光量子點、碳點、上轉換納米材料、硫點、石墨烯量子點、二氧化硅量子點等，但基于熒光納米材料構建OPs 化學生物傳感器仍有許多發(fā)展空間，如高發(fā)光性能的熒光納米材料的開發(fā)及其發(fā)光機制的研究仍然較為缺乏；其次，熒光傳感器依賴昂貴的大型熒光檢測設備，限制了其在OPs 實時、原位檢測方面的應用。

3 比色化學生物傳感器

比色法是通過待測物引起的肉眼可見的顏色變化實現(xiàn)對待測物檢測的方法。比色法可通過測定樣品的紫外-可見吸收光譜對待測物進行定量分析，具有設備簡單、成本低、響應速度快，可視化、可實時監(jiān)測等優(yōu)點，是目前比較普遍的檢測OPs 的方法[46，47]。比色化學生物傳感器主要基于具有表面等離子體共振（surface plasmon resonance, SPR）性質(zhì)的貴金屬納米材料和納米酶構建。

3.1 基于貴金屬納米材料的比色化學生物傳感器

貴金屬納米顆粒具有SPR 性質(zhì)，其SPR 吸收峰容易受到待測物直接或間接觸發(fā)而變化，從而導致明顯的顏色變化[48]。Zhang 等[49]開發(fā)了一種超靈敏檢測氧樂果的多色比色傳感器（圖6）。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）可催化抗壞血酸2-磷酸（ascorbic acid 2-phosphate, AAP）生成抗壞血酸（ascorbic acid, AA）；溶液中的銀離子被AA 還原生成金屬銀（Ag），沉積在金納米棒（gold nanorods,Au NRs）表面形成Ag/Au 核殼納米棒（Ag@Au NRs），導致Au NRs 縱向的SPR 吸收峰發(fā)生一系列藍移和高分辨率多色變化；氧樂果可抑制ALP 的活性，進而阻礙ALP 誘導的銀金屬化，且氧樂果的濃度直接影響產(chǎn)生的AA 的濃度，最終決定了Au NRs上Ag 殼沉積的程度。因此，可通過Au NR 縱向SPR 吸收峰強度與氧樂果濃度之間的線性關系定量檢測氧樂果的濃度。同時，對應的多色變化可實現(xiàn)肉眼半定量檢測氧樂果。該方法檢出限為83.2 ng/L，用于檢測實際樣品，回收率（95.67%～108.92%）好，有望用于食品中氧樂果的快速視覺檢測。

圖6 ALP 誘導的銀金屬化的Au NRs 用于氧樂果的多色比色檢測[49]Fig.6 Multicolor colorimetric determination of omethoate based on ALP-induced silver metallization of Au NRs[49]

盡管上述基于金納米材料的比色方法具有很高的靈敏度，但實驗中許多參數(shù)條件，如離子濃度、pH 值和溫度等可能會導致金納米材料的非特異性聚集，使SPR 吸收峰發(fā)生變化，引起假陽性信號[50]。因此，有必要開發(fā)更高穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性的OPs 比色分析法。

本課題組[51]基于金納米顆粒（gold nanoparticles, Au NPs）的抗聚集機制開發(fā)了一種簡單快速的福美雙比色傳感器，其原理如圖7 所示。一定濃度的Ag+可誘導4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol，4-ABT）修飾的Au NPs（Au NPs@4-ABT）聚集，導致分散的Au NPs@4-ABT 由酒紅色變?yōu)樗{紫色。然而，這種聚集效應可以被福美雙和Ag+之間的強螯合作用力所抑制，即將Ag+和福美雙預孵育后添加到Au NPs@4-ABT 傳感器中之后，福美雙和Ag+形成穩(wěn)定的福美雙-Ag+復合物，Au NPs@4-ABT 能夠被很好地再分散。這種抗聚集效應導致Au NPs@4-ABT 傳感器的紫外-可見吸收光譜發(fā)生明顯變化，體系顏色由藍紫色變?yōu)榫萍t色。肉眼可見的顏色變化和產(chǎn)生的線性紫外-可見吸收信號可準確地檢測福美雙殘留，檢出限低至0.04 μmol/L。該方法操作簡單，不需要昂貴的儀器和復雜的設計、合成或修飾。此外，該傳感器靈敏度高、選擇性好、響應速度快，可在加入全部樣品后15 min 內(nèi)完成對福美雙的檢測，可實現(xiàn)實際樣品如土壤和蘋果中福美雙殘留的檢測，有望用于福美雙殘留的現(xiàn)場快速可視化檢測。

圖7 Au NPs@4-ABT 傳感器比色法檢測福美雙[51]Fig.7 Colorimetric detection of thiram via Au NPs@4-ABT sensor[51]

3.2 基于納米酶的比色化學生物傳感器

隨著天然酶在OPs 檢測中的應用越來越多，其缺陷也越發(fā)明顯。首先，天然酶的催化條件苛刻，其活性容易在強酸、強堿或高溫條件下減弱甚至失活；其次，天然酶的制備耗時長且成本高，儲存條件苛刻；另外，天然酶在使用中難以回收，多為一次性使用。因此，近年來研究者開發(fā)出許多基于納米材料的酶的模擬物，稱為納米酶[52,53]。基于納米酶構建的顯色體系用于OPs 檢測的文獻[54～56]很多，也有相關的綜述[57]，感興趣的研究者可以追溯進行詳細了解。Zhang 等[58]采用聚丙烯酸（polyacrylic acid,PAA）包覆的氧化鈰納米粒子（PAA-CeO2）作為氧化酶模擬物和OPs 作為抑制乙酰膽堿酯酶活性的抑制劑，制備了一種可供現(xiàn)場快速檢測OPs 的比色化學生物傳感器。其中，PAA-CeO2納米酶可以催化四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）的氧化，產(chǎn)生從無色到藍色的顯色反應；AChE 可催化其ATCh 底物生成一種具有還原性的含硫醇化合物TCh，TCh 可 以 減 少PAA-CeO2納 米 酶 對TMB 的催化氧化。當反應體系中存在OPs 時，AChE 的酶活性會受到OPs 的抑制，產(chǎn)生較少的TCh，導致更多的TMB 被PAA-CeO2納米酶催化氧化，溶液顯示出的藍色深淺與OPs 的濃度存在一定的線性關系。作者將該策略應用于敵敵畏和甲基對氧磷的檢測，檢出限分別為8.62 μg/L 和26.73 μg/L。利用納米酶開發(fā)的OPs 比色傳感器不但成本低廉、容易操作，而且穩(wěn)定性強、靈敏度高、變色明顯、檢測快速，有望用于有機磷等農(nóng)藥現(xiàn)場快速檢測。

基于貴金屬SPR 效應構建的比色化學生物傳感器在檢測過程中易受到外界干擾因素的影響，如溫度、pH 值、緩沖溶液種類、離子強度、金屬離子等都可能干擾傳感器的性能。基于納米酶構建OPs比色化學生物傳感器仍處于起步階段，面臨許多挑戰(zhàn)，如許多納米酶的催化機理還不明確，難以實現(xiàn)對天然酶更加完美的模擬和對納米酶的催化活性進行高度精準調(diào)控等。因此，需要研究者繼續(xù)深耕納米酶領域，明確納米酶催化機理，同時通過調(diào)控納米顆粒的形貌、尺寸、化學摻雜、表面修飾等方面來提高納米酶的催化活性，進一步實現(xiàn)精準調(diào)控納米酶活性，以開發(fā)出更多更高效的納米酶平臺用于OPs 低成本快速現(xiàn)場可視化檢測。

4 拉曼化學生物傳感器

單色光照射樣品時會發(fā)生光散射，一部分散射光與入射光的波長不同，這種偏移的散射光的光譜就是拉曼光譜[59]。一般樣品中的分子拉曼散射信號不強，不足以用于構建高靈敏拉曼化學生物傳感器。因此，研究者基于表面增強拉曼光譜（surfaceenhanced Raman spectroscopy, SERS）技術，通過貴金屬材料（如金、銀等）的表面吸附，增強樣品的拉曼散射信號，實現(xiàn)了OPs 殘留的高靈敏度、快速檢測[60～63]。 Yaseen 等[64]基 于 銀 包 金 納 米 粒 子（Au@Ag NPs）的SERS 方法用于標準溶液和桃子提取物中同時檢測多類農(nóng)藥殘留，探針中的Au 核和Ag 殼表現(xiàn)出顯著的拉曼增強效果，可以識別不同農(nóng)藥（噻蟲啉、丙溴磷和惡唑啉）的特征波數(shù)，桃提取物中噻蟲啉的檢出限為0.1 mg/kg，丙溴磷和惡唑啉的檢出限均為0.01 mg/kg，且具有一定的回收率（78.6%～162.0%）和較高的準確度。

隨著便攜式拉曼光譜儀的問世，SERS 技術得以推廣和普及，在檢測OPs 領域發(fā)展快速，且發(fā)展前景良好。但是基于SERS 技術開發(fā)的便攜式拉曼光譜儀仍存在一些問題，如激光的光源不夠穩(wěn)定，在使用過程中由于溫度的細微變化，造成發(fā)射出的激光波長漂移；另外，SERS 檢測中的基底需要繼續(xù)優(yōu)化，比如構建穩(wěn)定性高、重復性好的高效柔性基底，進一步提高SERS 探針的靈敏度、長期穩(wěn)定性和降低成本。

5 總結與展望

化學生物傳感器的開發(fā)研究為檢測OPs 殘留的研究提供了很多可靠的檢測方法，已成為科技發(fā)展的熱點。本文總結了近年來基于電、熒光、比色和拉曼信號構建的化學生物傳感器用于快速檢測OPs 的研究進展（表1）。隨著納米技術的發(fā)展，基于納米材料的化學生物傳感器克服了傳統(tǒng)大型昂貴儀器用于定量分析的局限性，具有較高的靈敏度和特異性，在OPs 殘留檢測領域應用廣泛。但是，這些化學生物傳感器在以下方面仍存在亟待解決的問題：1）尚未實現(xiàn)多種農(nóng)藥的同步鑒定和監(jiān)測；2）基于電、熒光、比色和拉曼信號的化學生物傳感器便攜式設備的檢測準確性有待進一步提高；3）用于構建化學生物傳感器的納米材料的可重復性、穩(wěn)定性與表面改性研究方面尚需進一步探索；4）用于構建化學生物傳感器的天然酶的穩(wěn)定性和使用壽命有待提高，能特異性地與OPs 結合的識別分子需要進一步研究；5）生物識別分子在實際樣品檢測過程中不可控因素太多，需深入研究和優(yōu)化其使用條件和適用范圍；6）農(nóng)產(chǎn)品或者土壤等生態(tài)樣品復雜，樣品預處理過程需要進一步簡化，且需要進一步降低背景干擾。

表1 檢測OPs 的化學生物傳感器性能Table 1 Performance of chemical biosensors for the detection of OPs

目前，化學生物傳感器的主要發(fā)展趨勢如下：1）構建便攜和低成本的高通量化學生物傳感器；2）不斷簡化樣品的前處理過程，降低背景干擾，不斷提高檢測方法的準確性；3）高通量、高效率地篩選特異性識別農(nóng)藥的核酸適配體，降低生物識別分子的成本，同時提高其穩(wěn)定性；4）通過將各種檢測技術相互結合、優(yōu)勢互補，不斷提高檢測的靈敏度、準確度，同時發(fā)展多種OPs 的現(xiàn)場快速檢測技術。因此，隨著新技術的不斷成熟和基于電、熒光、比色和拉曼信號等的化學生物傳感器的發(fā)展，未來很有希望開發(fā)出一系列新型多元化學生物傳感器，實現(xiàn)現(xiàn)場實時、同步監(jiān)測復雜樣品中多種農(nóng)藥殘留。