基于小分子探針的硫化氫光電化學傳感器

孔 耀，葉曉雪?，劉志洪，2?

1. 湖北大學化學化工學院/有機化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心/有機功能分子合成與應用教育部重點實驗室，湖北 武漢430062；2. 武漢大學 化學與分子科學學院，湖北 武漢430072

0 引 言

硫化氫（H2S）作為與人類健康高度相關的分子，其高濃度下的生物毒性以及內源性H2S 的生理調節(jié)作用都受到廣泛關注[1]。眾所周知，H2S 是石油開采、燃料燃燒和廢物處理等各種工業(yè)活動中最常見的有毒氣體之一[2，3]。另一方面，H2S 已被證明是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三種內源性氣體信號化合物[4]，在中樞神經系統(tǒng)和其他器官中發(fā)揮著關鍵作用，參與介導多種生理過程，如細胞凋亡[5]、炎癥[6]和神經調節(jié)[7]等。到目前為止，已經開發(fā)了多種方法用于H2S 測定，如色譜法[8]、表面增強拉曼光譜法[9]、熒光光譜法[10，11]等。然而，這些方法依賴于昂貴的設備和耗時的預處理過程，不利于在環(huán)境監(jiān)測和生物分析中的快速檢測，因此，亟需開發(fā)更加便捷可靠的分析工具用于H2S 的高效檢測。

光電化學（PEC）傳感是一種新興的分析技術，近年來引起了人們的廣泛興趣[12]。在激發(fā)光的照射下，電極表面的光電活性材料吸收能量大于或等于其帶隙的光子，產生光生電子-空穴對，其價帶（VB）上的光生電子躍遷至導帶（CB），CB 中的電子轉移至電極界面（或溶液中），從而產生可檢測的陽極（或陰極）光電流信號[13]。PEC 傳感具有儀器設備簡單，易于小型化等優(yōu)點，同時，光和電兩種完全分離的能量形式分別被作為激發(fā)源（光源）和檢測信號（電信號），使得PEC 傳感具有更加優(yōu)異的信噪比和靈敏度[14]。這些獨特的性能和技術優(yōu)勢使PEC傳感在環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測和生物分析等領域展現出良好的應用前景。然而，面對復雜的樣品環(huán)境，PEC 傳感的選擇性卻面臨巨大的挑戰(zhàn)[15]。有機小分子探針通過特異性化學反應識別目標分子，因此具有很高的選擇性，在熒光分析中應用廣泛[16，17]。由于有機小分子探針結構靈活，通過與不同的識別域偶聯而用于多種目標物檢測，包括活性氧、活性硫以及其他生物活性小分子等，具有較好的普適性[18，19]。因此，將小分子探針引入PEC 傳感的識別機制，是解決現有PEC 傳感在復雜體系中選擇性不足的理想策略。如何將小分子探針與目標物的識別過程轉換為可檢測的光電流信號是構建高選擇性傳感界面的關鍵。由于光電活性材料和小分子探針都具有光吸收的特點，因此，我們提出了利用小分子探針與光電活性材料對光子的競爭吸收來構建PEC 傳感器的新思路。

基于以上研究，本文發(fā)展了一種基于小分子探針的PEC 傳感新策略用于水溶液中H2S 檢測，擬通過探針與目標物之間的特異性化學反應提高PEC傳感的選擇性。首先合成了具有香豆素骨架結構且能夠特異性識別H2S 的小分子探針（命名為pH2S），pH2S 在波長590 nm 處的吸收強度隨著H2S濃度的升高而減弱。在590 nm 激光照射下，半導體Bi2S3價帶上的電子受激躍遷至導帶，產生光生電子-空穴對，當光生電子遷移至電極表面時，即產生陽極光電流。溶液中的抗壞血酸（AA）作為電子給體可捕獲價帶上的空穴（AA 被空穴氧化為AA+），可促進光生電子和空穴的有效分離，增強光電流響應。當小分子探針pH2S 存在時，由于pH2S 和Bi2S3納米顆粒在590 nm 處存在競爭吸收，因此光電活性材料Bi2S3的激發(fā)被抑制，光電流響應信號較小。當目標物H2S 存在時，H2S 親核進攻pH2S 上吲哚鹽的不飽和雙鍵，生成產物pH2S-S2-，破壞探針的共軛體系，使小分子探針的分子內電荷轉移（ICT）效應受到限制，導致pH2S 在590 nm 處的吸收強度顯著降低，更多的Bi2S3被激發(fā)，從而使傳感器的光電流恢復（圖1）。由此，通過pH2S 與目標物之間的特異性識別反應調控光電流信號，實現對目標物H2S 的高選擇性檢測。

圖1 （a）基于小分子探針構建PEC 傳感器檢測水溶液中的H2S；（b）探針pH2S 的識別過程Fig.1 (a)The small molecule probe constructed PEC sensor for the detection of H2S in aqueous solution;(b)the recognition process of H2S by pH2S

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

試劑：Bi(NO3)2·5H2O、Na2S·9H2O、硫代乙酰胺（TAA）、4-二乙氨基水楊醛、丙二酸二乙酯、三氯氧磷（POCl3）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、2,3,3-三甲基吲哚、芐基溴購自上海阿拉丁試劑有限公司；乙二醇、無水乙醇（EtOH）、抗酸血酸（AA）、哌啶、濃鹽酸、冰醋酸、氫氧化鈉、正己烷、甲苯購自上海國藥試劑有限公司；實驗用水為超純水。

儀器：CHI 660E 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司），590 nm 激光器（廣州彤泰科技公司），UV-2650 型 紫 外-可見 分 光光 度 計（Shimadzu 公司），ZS90 型納米粒度電位儀（Malvern 公司），Sigma 500 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，Zeiss 公司），ASCEND-400 型核磁共振波譜儀（Bruker公司）。

1.2 合成方法

1.2.1 Bi2S3納米顆粒的合成

Bi2S3納米顆粒的合成方法參考文獻方法[20]并稍作修改。具體實驗步驟如下：將Bi(NO3)2·5H2O（1.94 g，4 mmol）溶于40 mL 乙二醇中，超聲使其分散均勻，然后向溶液中加入TAA（0.45 g，6 mmol），超聲使其分散均勻，將混合物在室溫下攪拌5 h。反應結束后，通過離心（8 000 r/min）分離，分別用超純水和EtOH 洗滌產物3 次，得到純化的沉淀物，冷凍干燥，于冰箱中-20 ℃儲存。

1.2.2 硫化氫小分子探針pH2S 的合成

pH2S 的合成依據參考文獻方法[21]，合成路線如圖2 所示。

圖2 有機小分子探針pH2S 的合成路線Fig.2 Synthetic route to the organic small molecule probe pH2S

化合物1的合成。將4-二乙氨基水楊醛（1.93 g，10 mmol）、丙二酸二乙酯（3.2 g，20 mmol）和哌啶（1 mL）依次溶解在EtOH（30 mL）中，將混合物在攪拌下回流6 h。反應結束后，將混合物真空蒸發(fā)，然后向殘余物中依次加入濃鹽酸（20 mL）和冰醋酸（20 mL），將所得混合物繼續(xù)在攪拌下回流6 h。反應結束后，將產物加入冰水（100 mL）中，逐滴滴加40%氫氧化鈉溶液，調節(jié)pH 值至5.0，即得到灰白色沉淀，繼續(xù)攪拌30 min 后，減壓過濾，水洗，干燥，將所得產物加入到甲苯中重結晶，得到化合物1（1.74 g），產率80%。

化合物2 的合成。將三氯氧磷（2 mL）逐滴滴加至DMF（2 mL）中，將混合物在20～50 ℃的N2氣氛下攪拌30 min，得到紅色溶液。然后將化合物1（1.5 g，6.91 mmol）溶解在DMF（10 mL）中，將該混合物與所得紅色溶液混合，于60 ℃攪拌12 h。反應結束后，將所得產物加入到冰水（100 mL）中，逐滴滴加20%氫氧化鈉溶液，調節(jié)pH 值至5.0，即得到橙紅色沉淀，減壓過濾，水洗，干燥，將所得產物加入到EtOH 中重結晶，得到化合物2（1.2 g），產率70%。

吲哚衍生物的合成。將2,3,3-三甲基吲哚（1 mL，6.2 mmol）和芐基溴（0.8 mL，6.7 mmol）依次加入到甲苯（20 mL）中，將所得混合物在攪拌下回流18 h。反應結束后，過濾并濃縮濾液，用正己烷洗滌。最后，減壓過濾除去溶劑，真空干燥后得到紅色固體吲哚衍生物（0.8 g），產率52%。

化合物pH2S 的合成：將化合物2（245 mg, 1.0 mmol）和吲哚衍生物（330 mg, 1.0 mmol）依次溶解在20 mL EtOH 中，將所得混合物在攪拌下回流12 h。反應結束后將混合物真空蒸發(fā)，殘余物通過硅膠柱層析法純化（CH2Cl2/MeOH 體積比20∶1），得到深藍色固體pH2S（190 mg），產率34%。產物的1H NMR(400 MHz,CH3OD)化學位移值δ：8.52(s,1H),8.35(d,J=15.3 Hz,1H),8.13(d,J=15.5 Hz,1H),7.75(m,J=7.2,5.7,2.8 Hz,2H),7.61～7.54(m, 3H), 7.40(m, 5H), 6.95～6.87(dd, 1H),6.63(d,J=2.4 Hz,1H),5.74(s,2H),3.61(q,J=7.1 Hz,4H),1.87(s,6H),1.27(t,J=7.0 Hz,6H)。

1.3 光電化學傳感器的制備

將氧化銦錫（ITO）電極依次用丙酮、EtOH 和超純水超聲清洗，在烘箱中于60 ℃干燥，再將打孔的3M 膠帶粘貼在電極的導電面，使ITO 電極的導電面積固定為直徑0.5 cm 的圓形，然后浸入Bi2S3分散液（1 mg/mL）中浸泡30 min，取出，于烘箱中60 ℃烘干，在其表面形成均勻穩(wěn)定的Bi2S3涂層，即得Bi2S3/ITO 電極。將Bi2S3/ITO 電極浸泡于pH2S溶液中，置于烘箱中60 ℃干燥，得到PEC 傳感器，命名為pH2S/Bi2S3/ITO。

1.4 H2S 的光電化學檢測

Na2S 溶解在水溶液中以后，主要以HS-和H2S的形式存在，在此以不同濃度的Na2S 作為H2S 供體配制檢測溶液，用于評估傳感器檢測H2S 的性能。pH2S/Bi2S3/ITO 與不同濃度的H2S（Na2S）在25 °C孵育4 min，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗去未反應的H2S。光電化學和電化學測量均在CHI 660E 電化學工作站上使用常規(guī)的三電極系統(tǒng)進行。經過修飾的ITO 電極作為工作電極，鉑絲電極和飽和甘汞電極（SCE）分別作為對電極和參比電極。測試溫度為室溫，電解液為含AA（0.1 mol/L）的PBS（0.1 mol/L，pH 7.4），激發(fā)光為波長590 nm 的激光。測試模式為：黑暗10 s-光照10 s-黑暗10 s，連續(xù)測試。

2 結果與討論

2.1 Bi2S3納米顆粒和pH2S 探針的表征和光學性質

對制備的Bi2S3納米顆粒和pH2S 探針進行表征，結果如圖3 所示。從圖3 (a)中Bi2S3的掃描電鏡（SEM）圖可以看出，Bi2S3納米材料呈顆粒狀結構，平均尺寸約為25 nm。圖3 (b)中Bi2S3的X 射線衍射（XRD）圖顯示，所制備Bi2S3納米顆粒的衍射峰位置與JCPDS# 17-0320 標準卡一致，為正交晶相Bi2S3[22]，初步證實Bi2S3納米顆粒合成成功。圖3 (c)中Bi2S3的動態(tài)光散射（DLS）結果表明，Bi2S3的水合粒徑約為91.3 nm，分散系數（PDI）為0.182，表明該納米顆粒具有良好的分散性，有利于其在電極表面的均勻修飾。圖3 (d)中Bi2S3和pH2S 的Zeta 電勢圖顯示，Bi2S3納米顆粒帶負電荷，而pH2S 帶正電荷，表明兩者可以在電極表面通過靜電作用結合。

圖3 Bi2S3的SEM 圖（a）、XRD 圖（b）、DLS 圖（c）及Bi2S3和pH2S 的Zeta 電勢圖（d）Fig.3 SEM image (a), XRD pattern (b)and DLS (c)of Bi2S3, Zeta potential of Bi2S3 and pH2S (d)

對Bi2S3和pH2S 的光學性質進行表征。如圖4(a)所示，Bi2S3納米顆粒在可見光區(qū)域顯示出較寬的吸收范圍和較強的吸收，表現出良好的光電活性；pH2S 在590 nm 處有一最大吸收峰，表明在該波長附近，pH2S 會與Bi2S3發(fā)生競爭吸收，從而減弱Bi2S3的光電流響應。進一步考察了pH2S（10 μmol/L）的光吸收以及對H2S 的響應。從圖4 (b)中可以看到，在PBS 緩沖溶液（0.1 mol/L, pH 7.4, 5%EtOH）中，隨著H2S 濃度的增加，pH2S 在590 nm 附近的光吸收強度逐漸減弱，也就是說，pH2S 與Bi2S3納米顆粒之間的競爭吸收作用可通過目標物H2S 調控。這為通過目標物H2S 調控傳感器的光電流響應信號提供了基礎。

圖4 （a）Bi2S3和pH2S 的UV-Vis 吸收光譜；（b）pH2S 與不同濃度H2S 孵育后的UV-Vis 吸收光譜Fig.4 (a)UV-Vis absorption spectra of Bi2S3 and pH2S;(b)UV-Vis absorption spectra of pH2S in the presence of the varying amount of H2S

2.2 光電化學傳感器的構建過程

為了證明PEC 傳感器構建成功，對其構建過程進行PEC 響應和EIS 測試。如圖5 (a)所示，與裸ITO 電極（曲線1）相比，修飾Bi2S3后的ITO 電極觀察到顯著增強的光電流信號（曲線2），這歸因于Bi2S3優(yōu)異的光電活性；將pH2S 修飾在Bi2S3/ITO 表面后，光電流信號明顯減弱（曲線3），這是由于在590 nm 激光照射下，pH2S 與Bi2S3競爭吸收光子能量，導致Bi2S3的激發(fā)受到抑制；當pH2S/Bi2S3/ITO與H2S 孵育后，光電流信號部分恢復（曲線4），是因為小分子探針pH2S 與H2S 發(fā)生化學反應后，pH2S在590 nm 處的吸收減弱，其與Bi2S3競爭吸收光子的能力降低，從而使Bi2S3吸收更多的光子能量增強光電流響應。上述結果證實了通過競爭吸收機制構建高選擇性PEC 傳感器的可行性，也初步證明了PEC 傳感器的成功構建。

圖5 (b)中電極的EIS 測試結果顯示：相比裸ITO 電極（曲線1），由于Bi2S3的高電導率，Bi2S3/ITO 電極具有較小的阻抗值Ret（曲線2）；進一步修飾了導電性較弱的pH2S 后，pH2S/Bi2S3/ITO 電極上得到了增大的Ret值（曲線3）。EIS 結果從電化學的角度進一步證實PEC 傳感器構建成功。

圖5 PEC 傳感器的光電流響應（a）和EIS 圖（b）1：裸ITO 電極；2：Bi2S3/ITO；3：pH2S/Bi2S3/ITO；4：pH2S/Bi2S3/ITO 與160 μmol/L H2S 孵育后Fig.5 Photocurrent responses (a)and EIS characterization (b)of PEC sensor 1:bare ITO, 2:Bi2S3/ITO, 3:pH2S/Bi2S3/ITO, and 4:pH2S/Bi2S3/ITO incubated with 160 μmol/L H2S

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為了實現最佳的傳感性能，對關鍵的實驗條件進行了優(yōu)化，包括Bi2S3濃度、pH2S 濃度以及H2S 的反應時間。如圖6 所示，光電流隨著Bi2S3濃度的增加而增大，但在1.0 mg/mL 時增大幅度趨于平緩，故選擇1.0 mg/mL 作為Bi2S3的最佳濃度（圖6(a)）；而對于作為競爭吸收劑的pH2S，綜合考量了其對光電流信號的猝滅能力和靈敏度，最終選擇100 μmol/L 作為最佳濃度（圖6(b)）；電極與目標物H2S的反應時間結果顯示，隨著反應時間的增加，光電流逐漸增大，于4 min 時趨于穩(wěn)定，因此，選擇電極與H2S 的最佳孵育時間為4 min（圖6(c)）。

圖6 Bi2S3的濃度（a）、pH2S 的濃度（b）和反應時間（c）對光電流的影響Fig.6 Effects of the concentration of Bi2S3(a), pH2S, (b)and the reaction time (c)on the photocurrents

2.4 光電化學傳感器對H2S 的分析性能

在最佳實驗條件下，研究了所構建的PEC 傳感器對不同濃度H2S（10～160 μmol/L）的分析性能。隨著目標物H2S（Na2S）濃度的增加，相應的光電流響應信號逐漸增強（圖7(a)），且光電流信號與H2S濃度c在10～160 μmol/L 范圍內呈現出良好的線性關系（圖7(b)），線性回歸方程為I=4.36+0.013c(R2=0.99)，檢出限（LOD）為4.9 μmol/L（S/N=3）。圖7(b)線性曲線中各數據點來自圖7(a)中各濃度下光電流曲線上第20 s 所對應的光電流值與第5 s 對應的暗電流值的之間的差值（平行測定3 組）。

圖7 PEC 傳感器與不同濃度H2S 反應后的光電流響應（a）及線性回歸曲線（b）Fig.7 The photocurrents response (a)and calibration curve (b)of PEC sensor for detecting different concentrations of H2S 1-10：10，15，20，40，60，80，100，120，140，160 μmol/L H2S

2.5 光電化學傳感器的選擇性、穩(wěn)定性及重現性

選擇性是本研究最關注的問題，因此我們先考察了傳感器對目標物H2S 的選擇性。在相同的實驗條件下，將PEC 傳感器對H2S 的光電流響應信號與多種陰離子（Cl-、Br-、CO32-、NO3-）、含硫物種（SO42-、SO32-、S2O32-、半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH））和氧化性干擾物質（H2O2）等進行對比研究，以評估該傳感器的選擇性。如圖8 所示，當體系中只存在干擾物質（1 mmol/L）時，傳感器的光電流響應信號無明顯變化；而體系中只有H2S（160 μmol/L）存在時，傳感器的光電流響應發(fā)生明顯變化，這歸因于探針pH2S 對H2S 的特異性識別；當干擾物與H2S 共存時，干擾物對H2S 的檢測無明顯影響。上述結果表明，該PEC 傳感器對H2S 具有很高的選擇性，常見干擾物對其光電流信號沒有影響。

圖8 PEC 傳感器對H2S 的選擇性Fig.8 Selectivity of the PEC sensor toward H2S

穩(wěn)定性和重現性是評估PEC 傳感器的關鍵參數，對傳感器的實際應用至關重要。如圖9(a)所示，將PEC 傳感器與160 μmol/L H2S 孵育 后，在連續(xù)10 個周期的off-on-off 光照射循環(huán)測試模式下，仍可以觀察到穩(wěn)定的光電流響應（相對標準偏差RSD=1.4%），表明該PEC 傳感器具有較好的穩(wěn)定性。此外，如圖9(b)所示，同一方法制備的5 個PEC傳感器在相同測試條件下獲得了較好重現性（RSD=1.7%）。

圖9 PEC 傳感器的穩(wěn)定性（a）和重現性（b）Fig.9 Stability (a)and reproducibility (b)of the PEC sensor

3 結 語

綜上所述，我們發(fā)展了一種以有機小分子探針作為特異性識別單元的PEC 傳感器，可用于水溶液中H2S 的高選擇性檢測；提出了基于競爭吸收機制的傳感策略，可將小分子與目標物的識別過程轉換為光電流信號的變化。該傳感器還表現出較高的穩(wěn)定性以及重現性，且構建步驟簡單。小分子探針與目標物之間的特異性化學識別有利于傳感器在復雜環(huán)境基質中對目標物的高選擇性檢測。該傳感器的檢測線性范圍為10～160 μmol/L，有望用于血清中H2S（生理濃度范圍為30～100 μmol/L）的高選擇性檢測。由于小分子探針結構靈活，通過合理的設計可與多種識別域偶聯，因此該傳感策略可以擴展用于其他目標物的檢測，并可根據實際應用調節(jié)傳感器的靈敏度和線性范圍，這將極大地促進PEC 傳感在不同領域的應用。