基于UPLC指紋圖譜和多成分定量評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量

周湘媛，陳萬(wàn)發(fā)，丁 青，馬懿飛，曹斯瓊，霍文杰，魏 梅，秦 升，李振雨*

基于UPLC指紋圖譜和多成分定量評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量

周湘媛1, 2，陳萬(wàn)發(fā)1, 2，丁 青1, 2，馬懿飛1, 2，曹斯瓊1, 2，霍文杰1，魏 梅1, 2，秦 升3，李振雨1, 2*

1. 廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244 2. 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244 3. 中國(guó)中藥控股有限公司，廣東 佛山 528303

采用超高效液相色譜法（UPLC）建立升麻藥材指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定3種有效成分的含量，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量的差異。采用UPLC法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫，體積流量為0.3 mL/min，波長(zhǎng)為320 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為1 μL；建立15批升麻藥材指紋圖譜，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)并結(jié)合質(zhì)譜分析，對(duì)共有峰進(jìn)行鑒定，并對(duì)3種成分的含量進(jìn)行測(cè)定；對(duì)15批升麻藥材指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)及主成分分析（principal component analysis，PCA），利用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）尋找不同產(chǎn)地升麻藥材的差異性成分。升麻藥材指紋圖譜有16個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中3個(gè)峰，分別為咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸；除遼寧產(chǎn)區(qū)的3批樣品外，其余12批相似度均大于0.95；PCA將15批升麻藥材劃分為2類，OPLS-DA法確定7個(gè)差異標(biāo)志物，差異顯著性排序，分別為峰7＞峰11＞峰9＞峰8＞峰10＞咖啡酸＞峰4。遼寧產(chǎn)區(qū)咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸總含量明顯高于其它產(chǎn)地。該方法能有效地分析不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量的差異性，為不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供參考。

升麻藥材；UPLC指紋圖譜；多成分定量；差異標(biāo)志物；咖啡酸；阿魏酸；異阿魏酸

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Kom.、興安升麻(Turcz.) Maxim.或升麻L(zhǎng).的干燥根莖，具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽(yáng)氣之功效，用于治療風(fēng)熱頭痛、齒痛、口瘡、咽喉腫痛、麻疹不透、陽(yáng)毒發(fā)斑、脫肛、子宮脫垂[1]。已有研究表明，升麻具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抑制核苷運(yùn)轉(zhuǎn)等多種作[2]，黃廣欣等[3]研究預(yù)測(cè)認(rèn)為，升麻中的酚酸、三萜及其苷類等是升麻藥材中與藥效和傳統(tǒng)藥性相關(guān)的主要質(zhì)量標(biāo)志物。中藥有效成分的多樣性及復(fù)雜性，單一成分定量的化學(xué)藥品質(zhì)量控制模式既缺乏專屬性，又難以反映中藥內(nèi)在質(zhì)量屬性，因此，需要?jiǎng)?chuàng)新研究思維和基于功能主治的多元質(zhì)量控制模式[4]，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)中藥的整體質(zhì)量控制提供一種的新的思路[5-6]，在中藥材質(zhì)量控制、中藥飲片炮制、中藥復(fù)方和中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中屢見不鮮[7-10]，但對(duì)于采用UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)升麻藥材的質(zhì)量仍鮮有報(bào)道。本研究采用UPLC指紋圖譜和主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），并結(jié)合質(zhì)譜指認(rèn)和多成分定量，從多角度評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地大三葉升麻的質(zhì)量，為升麻藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；Scientific Q-Exactive Obitriap MS型四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛公司）；mzVault質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（美國(guó)賽默飛公司）Agilent SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫公司），ME204E型萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司）；XP26型百萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司）；JJ600型百分之一天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；KQ500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q級(jí)，德國(guó)默克股份有限公司）。

1.2 試劑與藥材

除液相用甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸、甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）為色譜級(jí)，其余試劑皆為分析純。對(duì)照品阿魏酸（批號(hào)110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.0%）、異阿魏酸（批號(hào)111698-201103，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.2%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-200102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以100.0%，）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；15批升麻藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為毛茛科植物大三葉升麻Kom.的干燥根莖，經(jīng)檢驗(yàn)，均符合《中國(guó)藥典》2020年版升麻藥材項(xiàng)下的規(guī)定，藥材來(lái)源信息見表1。

表1 15批升麻藥材來(lái)源信息

Table 1 Origin information form of 15 batches of Cimicifuga Rhizoma

編號(hào)藥材批號(hào)產(chǎn)地 S1G1708044河北承德 S2G1708045河北承德 S3G1708046河北承德 S4G1709004遼寧鞍山 S5G1709005遼寧鞍山 S6G1709006遼寧鞍山 S7G1709009吉林通化 S8G1709010吉林通化 S9G1709011吉林通化 S10G1709055內(nèi)蒙古呼倫貝爾鄂倫 S11G1709056內(nèi)蒙古呼倫貝爾鄂倫 S12G1709057內(nèi)蒙古呼倫貝爾鄂倫 S13G1709064黑龍江黑河 S14G1709065黑龍江黑河 S15G1709066黑龍江黑河

2 方法與結(jié)果

2.1 升麻藥材UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B，質(zhì)譜分析為0.05%甲酸溶液）；梯度洗脫：0～1 min，12% A；1～3 min，12%～18% A；3～6 min，18% A；6～13 min，18%～35% A；13～18 min，35%～90% A；18～19 min，90%～80% A；體積流量為0.30 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸、咖啡酸和異阿魏酸對(duì)照品適量，加10%乙醇制成含阿魏酸、咖啡酸0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取升麻藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（HESI），噴霧電壓為3.24 kV，掃描模式為正、負(fù)離子模式；掃描范圍為/150～2000；鞘氣體積流量為35 arb；輔助氣體積流量為10 arb；毛細(xì)管溫度為350 ℃；輔助器加熱溫度為350 ℃；一級(jí)掃描分辨率為70 000 FWHM；二級(jí)掃描分辨率為17 500 FWHM；二級(jí)碰撞能量為40 eV；S-lens電壓為50 V。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取升麻藥材（批號(hào)G1709055）供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下確定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜，以異阿魏酸色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值，均小于3.0%。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的升麻藥材粉末（批號(hào)G1709055）共計(jì)6份，按“2.1.3”項(xiàng)下確定的制備方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，檢測(cè)指紋圖譜，以異阿魏酸色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于3.0%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取升麻藥材（批號(hào)G1709055）供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，檢測(cè)指紋圖譜，以異阿魏酸色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有指紋峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于3.0%。

2.1.8 指紋圖譜的建立及共有峰標(biāo)定 取15批升麻藥材樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備15份供試品溶液，分別按“2.1.1”項(xiàng)下確定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各樣品指紋圖譜的色譜圖，并導(dǎo)出指紋圖譜的.cdf格式，將15批升麻藥材.cdf格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件中，以編號(hào)為S1樣品（批號(hào)G1708044）的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，以6號(hào)峰為Mark峰進(jìn)行保留時(shí)間校正，同時(shí)進(jìn)行全峰匹配，15批升麻藥材和升麻對(duì)照藥材指紋圖譜疊加圖見圖1，以平均數(shù)法生成升麻藥材對(duì)照指紋圖譜，見圖2。異阿魏酸為升麻的主要有效成分之一，在所有的已知色譜峰里位置最為居中，且該成分色譜峰峰面積較大，與相鄰的色譜峰分離效果好，另外，該對(duì)照品容易獲得，因此選擇異阿魏酸色譜峰為參照峰（S），標(biāo)定出16個(gè)共有指紋峰，計(jì)算各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.05%～0.33%，相對(duì)峰面積RSD值在30.85%～79.35%。

圖1 15批升麻藥材UPLC指紋圖譜

圖2 升麻藥材對(duì)照指紋圖譜

2.1.9 相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”計(jì)算15批升麻藥材指紋圖譜的相似度（表2），結(jié)果顯示，以省劃分產(chǎn)區(qū)，不同產(chǎn)區(qū)的升麻藥材除編號(hào)為S4～S6的藥材外，其余12批升麻藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.95，說(shuō)明河北、吉林、內(nèi)蒙古和黑龍江4個(gè)產(chǎn)區(qū)的升麻藥材質(zhì)量比較一致，遼寧的3批與其他產(chǎn)地相比具有一定的差異。

表2 15批升麻藥材相似度評(píng)價(jià)

Table 2 Similarity analysis forms of 15 batches of Cimicifuga Rhizoma

相似度S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15對(duì)照指紋圖譜 S11.000 1.000 0.994 0.977 0.879 0.954 0.991 0.994 0.971 0.936 0.947 0.929 0.938 0.971 0.940 0.989 S21.000 1.000 0.994 0.978 0.879 0.955 0.990 0.994 0.970 0.935 0.946 0.928 0.938 0.970 0.939 0.989 S30.994 0.994 1.000 0.966 0.861 0.936 0.993 0.998 0.971 0.947 0.956 0.934 0.941 0.983 0.939 0.986 S40.977 0.978 0.966 1.000 0.926 0.981 0.968 0.969 0.969 0.905 0.923 0.913 0.923 0.948 0.927 0.935 S50.879 0.879 0.861 0.926 1.000 0.971 0.840 0.854 0.855 0.738 0.753 0.740 0.732 0.819 0.764 0.875 S60.954 0.955 0.936 0.981 0.971 1.000 0.923 0.938 0.916 0.827 0.847 0.829 0.842 0.892 0.848 0.944 S70.991 0.990 0.993 0.968 0.840 0.923 1.000 0.993 0.986 0.969 0.977 0.964 0.968 0.990 0.971 0.995 S80.994 0.994 0.998 0.969 0.854 0.938 0.993 1.000 0.968 0.944 0.955 0.933 0.947 0.978 0.939 0.986 S90.971 0.970 0.971 0.969 0.855 0.916 0.986 0.968 1.000 0.971 0.978 0.976 0.964 0.989 0.984 0.993 S100.936 0.935 0.947 0.905 0.738 0.827 0.969 0.944 0.971 1.000 0.998 0.994 0.986 0.986 0.982 0.963 S110.947 0.946 0.956 0.923 0.753 0.847 0.977 0.955 0.978 0.998 1.000 0.995 0.992 0.989 0.985 0.973 S120.929 0.928 0.934 0.913 0.740 0.829 0.964 0.933 0.976 0.994 0.995 1.000 0.990 0.977 0.992 0.964 S130.938 0.938 0.941 0.923 0.732 0.842 0.968 0.947 0.964 0.986 0.992 0.990 1.000 0.971 0.979 0.966 S140.971 0.970 0.983 0.948 0.819 0.892 0.990 0.978 0.989 0.986 0.989 0.977 0.971 1.000 0.975 0.987 S150.940 0.939 0.939 0.927 0.764 0.848 0.971 0.939 0.984 0.982 0.985 0.992 0.979 0.975 1.000 0.971 對(duì)照指紋圖譜0.989 0.989 0.986 0.9350.875 0.944 0.995 0.986 0.993 0.963 0.973 0.964 0.966 0.987 0.971 1.000

2.1.10 共有峰的指認(rèn) 采用與對(duì)照品的保留時(shí)間并結(jié)合紫外吸收光譜圖，初步確定峰2為咖啡酸，峰5為阿魏酸，峰6為異阿魏酸，結(jié)果見圖3。取升麻藥材（批號(hào)G1709055）供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件和“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)確分子量與升麻已知組分的分子量進(jìn)行對(duì)比，對(duì)于質(zhì)量偏差小于2×10?9的組份予以確認(rèn)，且根據(jù)目標(biāo)色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜信息，并與mzVault標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果見表3。

2.2 化學(xué)模式識(shí)別

化學(xué)計(jì)量學(xué)中的模式識(shí)別技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地、基原、炮制、真?zhèn)舞b別等方面[11]，分為有、無(wú)監(jiān)督2種統(tǒng)計(jì)方法，一般先進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的HCA、PCA，觀察樣本之間是否有分類趨勢(shì)，再采用PLS-DA或者OPLS-DA進(jìn)行有監(jiān)督的模式識(shí)別，顯示樣本間差異主要由哪些變量引起，尋找差異性標(biāo)志物[12]，

圖3 對(duì)照品咖啡酸(a)、阿魏酸(b)、異阿魏酸(c) 及升麻藥材樣品色譜圖(d)

表3 升麻藥材共有峰的質(zhì)譜信息

Table 3 Mass spectrum information of common peak of Cimicifuga Rhizoma

峰號(hào)tR/min分子式分子離子峰實(shí)驗(yàn)值（m/z）理論值（m/z）誤差(×10?6)化合物 23.39C9H8O4[M?H]?179.034180.1570.641咖啡酸 56.01C10H10O4 [M＋H]+195.066194.0581.203阿魏酸 66.52C10H10O4 [M＋H]+195.065194.0580.947 異阿魏酸

2.2.1 PCA 采用SIMCA14.1軟件，以15批升麻藥材的16個(gè)共有指紋峰的峰面積為變量進(jìn)行PCA分析，共生成9個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.2%，2為0.56，證明模型有效。以前2個(gè)主成分的得分值和16個(gè)共有指紋峰的峰面積為變量得到主成分得分圖（Scores圖，圖4）和變量載荷圖（Loading圖，圖5），結(jié)果顯示，15批升麻藥材可分為2類，河北、吉林、內(nèi)蒙古和黑龍江4個(gè)產(chǎn)區(qū)的升麻藥材聚為一類，遼寧產(chǎn)區(qū)升麻聚為第2類，分類結(jié)果與藥材產(chǎn)地相關(guān)性較大。根據(jù)變量離原點(diǎn)的距離判斷變量對(duì)主成分的影響權(quán)重，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，變量對(duì)主成分的影響權(quán)重越大，分析變量對(duì)主成分1的影響權(quán)重，大小依次為峰9、峰7、咖啡酸，變量對(duì)主成分2的影響權(quán)重，大小依次為峰8、阿魏酸、峰11。

圖4 15批升麻藥材Scores圖

圖5 升麻藥材色譜峰變量Loading圖

2.2.2 OPLS-DA 根據(jù)PCA分析結(jié)果，以16個(gè)共有指紋峰峰面積為變量進(jìn)行OPLS-DA，所建立的模型2＝0.916，2＝0.967，2＝0.776，表明該模型可以用于不同產(chǎn)地升麻的模式識(shí)別。通過(guò)OPLS-DA的Scores圖（圖6）可知，不同產(chǎn)地升麻藥材也明顯分為3類，且通過(guò)16個(gè)變量的VIP值圖（圖7）可知，以VIP＞1.0為顯著影響，共找到7個(gè)差異標(biāo)志物，對(duì)其影響顯著性排序，分別為峰7＞峰11＞峰9＞峰8＞峰10＞咖啡酸＞峰4，提示這幾個(gè)化學(xué)成分對(duì)于區(qū)分不同產(chǎn)地升麻的貢獻(xiàn)較大，且不同產(chǎn)地的咖啡酸含量具有明顯區(qū)別。

圖6 升麻藥材的OPLS-DA分析Scores圖

圖7 升麻藥材VIP圖

2.3 3種指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液制備 取升麻藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用10%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取咖啡酸、阿魏酸及異阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加10%乙醇制成含咖啡酸30.08 μg/mL，阿魏酸59.76 μg/mL，異阿魏酸566.43 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加10%乙醇至刻度，搖勻，得到分別含咖啡酸0.30、0.60、1.50、3.01、6.02、15.04 μg/mL，阿魏酸0.60、1.20、2.99、5.98、11.95、29.88 μg/mL，異阿魏酸5.66、11.33、28.32、56.64、113.29、283.22 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各1 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種成分的線性回歸方程和線性范圍見表4。

表4 3種成分的線性回歸方程及線性范圍

Table 4 Regression equations coefficient correlation of references and linear ranges

對(duì)照品線性范圍/(μg·mL?1)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2 咖啡酸0.30～30.08Y＝16.40 X＋0.640.999 9 阿魏酸0.60～59.76Y＝16.41 X＋4.150.999 5 異阿魏酸 5.66～566.43Y＝16.13 X＋6.940.999 9

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的峰面積，并計(jì)算咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸峰面積RSD值分別為0.68%、1.05%、0.89%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取升麻藥材粉末（批號(hào)G1709055），按“2.3.1”項(xiàng)下確定的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的峰面積，并計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸峰面積RSD值，分別為0.64%、1.15%、1.10%。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取升麻藥材粉末（批號(hào)G1709055），按“2.3.1”項(xiàng)下確定的供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.14、0.29、2.83 mg/g，RSD值分別為1.71%、1.27%、0.37%。

2.3.6 加樣回收率測(cè)定 取升麻藥材粉末（批號(hào)G1709055）約0.25 g，精密稱定，平行3組，每組3份，按1∶0.5，1∶1及1∶1.5的比例加入對(duì)照品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算3種成分的回收率范圍及RSD值，計(jì)算咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的加樣回收率范圍分別為92.21%～100.37%、96.82%～101.06%、96.76%～101.63%，平均加樣回收率分別為96.89%、99.14%、99.40%，RSD值分別為2.51%、1.65%、1.70%，均小于3.0%。

2.3.7 中間精密度試驗(yàn) 由其他分析人員在不同日期和不同色譜儀下操作，取同一批升麻藥材粉末（批號(hào)G1709055）約0.5 g，精密稱定，平行6份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.14、0.30、2.87 mg/g，與6份重復(fù)性試驗(yàn)樣品的RSD值分別為1.77%、2.20%和0.65%。

2.3.8 樣品測(cè)定 取15批升麻藥材粉末，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各批次樣品咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的含量，結(jié)果見表5，15批升麻藥材咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.14～0.92 mg/g，阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.29～0.67 mg/g，異阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.36～4.03 mg/g，《中國(guó)藥典》2020年版升麻藥材項(xiàng)下規(guī)定異阿魏酸含量不得少于0.1%，15批樣品均藥典符合規(guī)定。遼寧產(chǎn)區(qū)的3種成分的整體含量高于其他產(chǎn)地，其余產(chǎn)地3種有效成分的含量無(wú)明顯差異，見圖8。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果（n＝15）

Table 5 Determination results of samples (n＝15)

批號(hào)咖啡酸/(mg·g?1)阿魏酸/(mg·g?1)異阿魏酸/(mg·g?1)總量/(mg·g?1) S10.250.442.513.20 S20.210.332.362.90 S30.160.402.923.48 S40.920.564.035.51 S50.870.523.935.32 S60.350.673.714.73 S70.160.472.923.55 S80.170.373.524.06 S90.170.363.453.98 S100.140.292.833.26 S110.150.302.993.44 S120.150.302.943.39 S130.210.432.873.51 S140.210.432.873.51 S150.330.422.563.31

圖8 不同產(chǎn)地間升麻藥材各指標(biāo)含量均值圖

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC法建立升麻藥材指紋圖譜與有效成分含量同時(shí)測(cè)定方法，在20 min內(nèi)即完成主要色譜峰的良好分離，指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，320 nm處色譜峰數(shù)目較多，響應(yīng)值較大，基線平穩(wěn)，其中咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸3種有效成分的分離度和峰純度符合定量要求，因此選擇320 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相的篩選考察了甲醇-0.1%磷酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-水3種溶劑系統(tǒng)的洗脫和分離效果，結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，各色譜峰出峰時(shí)間短，分離度較好。色譜柱篩選考察了Agilent SBC18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱、Waters HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱、Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱這3種不同品牌和柱填料的色譜柱對(duì)各色譜峰的分離效果，結(jié)果采用Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，各色譜峰分離效果最佳。

3.2 指紋圖譜的構(gòu)建及分析評(píng)價(jià)

本研究15批升麻藥材指紋圖譜共標(biāo)識(shí)出16個(gè)共有指紋峰，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出3個(gè)有效成分，分別為咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，除3批吉林產(chǎn)區(qū)的樣品外，其余產(chǎn)地升麻指紋圖譜相似度較高。通過(guò)PCA將15批升麻藥材分為2類，其中遼寧產(chǎn)區(qū)分為一類，其余產(chǎn)區(qū)為一類。通過(guò)OPLS-DA分析找到7個(gè)差異標(biāo)志物，說(shuō)明不同產(chǎn)區(qū)升麻藥材的化學(xué)成分含量存在一定差異，這種差異可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年限、采收加工方式等因素密切相關(guān)。

3.3 有效成分的測(cè)定與分析

《中國(guó)藥典》2020年版升麻藥材項(xiàng)下以異阿魏酸為含測(cè)指標(biāo)，但僅用單一成分測(cè)定尚不足以全面評(píng)價(jià)升麻藥材的質(zhì)量，故建立多成分同時(shí)測(cè)定是實(shí)現(xiàn)中藥材有效質(zhì)控的重要方法。本研究在指紋圖譜的基礎(chǔ)上，增加對(duì)有效成分咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的同時(shí)測(cè)定，從多角度研究不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量的差異性，結(jié)果表明，除遼寧產(chǎn)區(qū)外，其余4個(gè)產(chǎn)地的咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸含量差異不大，最小值和最大值不超過(guò)3倍，其中以遼寧的升麻整體質(zhì)量較優(yōu)。

本研究建立升麻指紋圖譜方法及多成分定量，該方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性良好，分析時(shí)間短，提高了分析效率，能有效地分析不同產(chǎn)地升麻藥材質(zhì)量的差異性，為不同產(chǎn)地升麻藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 75.

[2] 孫啟泉, 左愛俠, 張婷婷. 升麻屬植物化學(xué)成分、生物活性及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2017, 48(14): 3005-3016.

[3] 黃廣欣, 龔蘇曉, 許浚, 等. 升麻研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2651-2660.

[4] 鄢海燕, 鄒純才. 基于功能主治及其物質(zhì)基礎(chǔ)的中藥多元化質(zhì)量控制模式探討 [J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2019, 46(4): 266-269.

[5] 劉東方, 趙麗娜, 李銀峰, 等. 中藥指紋圖譜技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2016, 47(22): 4085-4094.

[6] 于洋, 李軍, 李寶國(guó). 化學(xué)計(jì)量學(xué)在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用 [J]. 中成藥, 2018, 40(5): 1139-1142.

[7] 陶曉賽, 龔海燕, 謝彩俠, 等. 基于UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2021, 52(1): 227-233.

[8] 張曉男, 魏惠珍, 張丹, 等. 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)分析的桃仁炮制前后指紋圖譜研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2020, 37(8): 971-976.

[9] 周麗, 時(shí)海燕, 時(shí)銀萍, 等. 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)優(yōu)選經(jīng)典名方溫膽湯的提取工藝 [J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2020, 40(21): 2214-2219.

[10] 高森, 王蘋, 唐鋮, 等. 基于HPLC指紋圖譜、多指標(biāo)成分含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)的濕熱痹片質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5454-5461.

[11] 孫立麗, 王萌, 任曉亮. 化學(xué)模式識(shí)別方法在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2017, 48(20): 4339-4345.

[12] 于洋, 李軍, 李寶國(guó). 化學(xué)計(jì)量學(xué)在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用 [J]. 中成藥, 2018, 40(5): 1139-1142.

Quality evaluation offrom different producing areas based on fingerprint and multi-components determination

ZHOU Xiang-yuan1, 2, CHEN Wan-fa1, 2, DING Qing1, 2, MA Yi-fei1, 2, CAO Si-qiong1, 2, HUO Wen-jie1, WEI Mei1, 2, QIN Sheng3, LI Zhen-yu1, 2

1. Guangdong E-fong Pharmaceutical Co. Ltd, Foshan 528244, China 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula, Foshan 528244, China 3. China Traditional Chinese Medicine Holdings Co. Ltd., Foshan 528303, China

To evaluate the difference offrom different producing areas by establishing UPLC fingerprint and determining contents of three effective components ofUPLC Method was adopted. The determination was performed on a column of Agilent SB C18(100 mm × 2.1 mm，1.9 μm) with acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution as the mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min. The detective wavelength was 320 nm, the column temperature was 35 ℃, the injection volume was 1 μL. The UPLC fingerprints of 15 batches ofwere established and the common peaks were identificated by reference substances and mass spectrometry. The contents of three components were determined. Similarity evaluation and principal component analysis (PCA) were carried out on the fingerprints and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) was used to find the different components offrom different producing areas.There were 16 common peaks in the fingerprints ofby comparing with the reference substances, three common peaks were identified, namely, caffeic acid, ferulic acid and isoferulic acid. Except for three batches of samples from Liaoning Province, the similarity of the other 12 batch was greater than 0.95. According to the analysis of PCA, 15 batches ofwere divided into two categories; Seven kinds of biomarkers were determined by OPLS-DA method. The order of significance was peak 7 > peak 11 > peak 9 > peak 8 > peak 10 > caffeic acid > peak 4, respectively. The total contents of caffeic acid, ferulic acid and isoferulic acid.in Liaoning were obviously higher than those in other areas.This method can effectively analyze the quality differences offrom different producing areas and provide reference for the quality evaluation.

; UPLC fingerprints; multi-component determination; difference markers; caffeic acid; ferulic acid; isoferulic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2022)17 - 5497 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.027

2022-01-20

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2018B030323004）；廣東特支計(jì)劃科技創(chuàng)業(yè)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（2017TY04R197）

周湘媛（1996—），女，助理研究員，從事中藥飲片及中藥配方顆粒研究。

李振雨（1989—），男，碩士，主管中藥師，研究員，從事中藥飲片及中藥配方顆粒研究。Tel: (0757)85128602 E-mail: 1083656123@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]