干姜干熱藥性活性分子的篩選與抗小鼠低溫凍傷的甲狀腺氧化應(yīng)激保護(hù)作用機(jī)制

苗艷豐，衛(wèi) 賀，李 誠，張 靜，李照雪，王曉琴，張 波, *

? 藥理與臨床 ?

干姜干熱藥性活性分子的篩選與抗小鼠低溫凍傷的甲狀腺氧化應(yīng)激保護(hù)作用機(jī)制

苗艷豐1，衛(wèi) 賀1，李 誠2，張 靜1，李照雪3，王曉琴2，張 波1, 2*

1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002 2. 成都大學(xué)藥學(xué)院 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610106 3. 石河子大學(xué)附屬第一醫(yī)院，新疆 石河子 832002

探討干姜干熱藥性的藥理特點及對低溫凍傷的保護(hù)作用。以甲狀腺功能評價為研究內(nèi)容，建立低溫凍傷小鼠模型（?20±1）℃，通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)等手段評價干姜醇提物對小鼠低溫凍傷的保護(hù)作用，通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法篩選出活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)。建立體外人甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細(xì)胞氧化損傷模型并評價相關(guān)活性分子的保護(hù)作用。系統(tǒng)藥理方法篩選出姜黃素等代表性成藥分子，預(yù)測靶標(biāo)富集在甲狀腺激素信號通路、FoxO通路等5條信號通路。干姜醇提物顯著延長低溫凍傷小鼠的生存時間，升高血清中游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）和游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）水平（＜0.05、0.01），上調(diào)小鼠甲狀腺功能相關(guān)基因鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（sodium/iodide cotransporter，）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，）、甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，）mRNA表達(dá)水平（＜0.01），下調(diào)促甲狀腺素受體（thyroid stimulating hormone receptor，）mRNA表達(dá)水平（＜0.01），改善低溫導(dǎo)致的甲狀腺濾泡破損。體外實驗發(fā)現(xiàn)干姜代表成分姜黃素、6-姜酚對H2O2誘導(dǎo)的BCPAP細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用（＜0.05、0.01）。干姜及其活性成分姜黃素、6-姜酚能夠通過抗甲狀腺氧化應(yīng)激、促甲狀腺功能從而保護(hù)小鼠低溫凍傷。

干姜；抗凍；干熱；溫里；甲狀腺；系統(tǒng)藥理學(xué)；姜黃素；6-姜酚

低溫是一種新疆冬季常見的環(huán)境因素，長期低溫暴露會對戶外作業(yè)者的身體造成嚴(yán)重?fù)p害。通過藥物提高機(jī)體的抗寒冷應(yīng)激能力是目前抗寒冷應(yīng)激研究的熱點。干姜味辛，性熱，在民族醫(yī)藥與飲食文化中有悠久的歷史。維吾爾醫(yī)學(xué)著作《注醫(yī)典》《白色宮殿》記錄干姜藥性三級末熱、二級干，溫胃，溫肝，燥胃中余濕；《拜地依藥書》記載干姜具有開通濕寒性肝臟阻塞作用。提示干姜具有活血化瘀、溫中散寒、回陽通脈等功效。甲狀腺是機(jī)體維持體溫和產(chǎn)熱的重要臟器，機(jī)體對低溫代償會產(chǎn)生甲狀腺激素及誘導(dǎo)甲狀腺氧化應(yīng)激[1]。干姜作為常見的藥食同源中藥，因其成分復(fù)雜、用途廣泛，尚不明確其干熱藥性對應(yīng)何種機(jī)制[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過保護(hù)甲狀腺來延長小鼠低溫生存時間[3]，但仍無法確認(rèn)干姜干熱藥性關(guān)鍵成分與機(jī)制，而6-姜酚作為干姜的質(zhì)量標(biāo)志物是干姜中含量最高的姜辣素成分[4]，需進(jìn)一步明確多組分藥理作用。本研究通過干姜的系統(tǒng)藥理學(xué)機(jī)制研究與溫中散寒的藥效學(xué)研究，揭示干姜“溫里”功效的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子機(jī)制，篩選出干姜干熱藥性代表成分，預(yù)測靶標(biāo)，并驗證其低溫保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

清潔級昆明雄性小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)動物研究中心，動物許可證號SCXK（新）2016-0003。動物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、濕度40%～60%的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號A2022-085-01）。

1.2 細(xì)胞

人甲狀腺癌乳頭狀BCPAP細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。

1.3 藥品與試劑

干姜（批號190801-X）購自新疆石河子附屬醫(yī)院，經(jīng)石河子附屬醫(yī)院李照雪主管藥師鑒定為姜科植物姜Rosc.的干燥根莖；對照品姜黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號R08S8S43416）、6-姜酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號P15J11F118583）購自上海源葉生物科技有限公司；丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU，批號2010N07）購自上海朝暉藥業(yè)有限公司；左旋甲狀腺素鈉（LT4，批號G00RHH）購自默克雪蘭諾有限公司；血清游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）ELISA試劑盒（批號Aug2021）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）ELISA試劑盒（批號Aug2021）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）測試盒（批號20201022）、DCFH-DA探針（批號20210915）購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒（批號H409KA9619）購自上海生工生物工程公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號01118944）、CMFDA探針（批號2263495）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；實時熒光定量擴(kuò)增試劑盒（批號169025387）購自德國QIAGEN公司；Hoechst 33258探針（批號GA14FA0001）購自BBI生命科學(xué)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Biological Industries；MTT（批號1223G0525）購自索萊寶生物科技有限公司；促甲狀腺素受體（thyroid stimulating hormone receptor，）、甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，）、鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（sodium/iodide cotransporter，）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

1.4 儀器

多功能酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Rotor-Gene Q型實時熒光定量PCR儀（德國QIAGEN公司）；正置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因種屬序列 (5’-3’) Tg小鼠F: ACTCTGCCCACCCAGAATCAA R: GGGGAAAACTGCTCTGATGGC Tpo小鼠F: CACTGGTCCTCTGTTTGCATGTATC R: TAGTTCCTGCCTCTGAGCGTCTG Tshr小鼠F: TCATTGCCTCTGTAGAACTG R: TGATAACTCACTGGCGAAA Nis小鼠F: GTGGGCCAGTTGCTCAATTC R: GTGCGTAGATCACGATGCCA Gapdh小鼠F: AGGTCGGTGTGAACGGATTTG R: TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA Tg人F: CCAGTGGCTTCTCTTCCTGACTR: CCTTGGAGGAAGCGGATGGTTT Tpo人F: ACTGTGTCCAACGTGTTCTTCR: AAGTCCAGGATCTTGTCGGC Tshr人F: CAATGGGACAAAGCTGGATGR: TGACACTGGTTTGACACACG Nis人F: CAGCTTCTATGCCATCTCCTATCR: TCCCACCACAACAATCCC Gapdh人F: ACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATR: GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAGG

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 干姜活性成分與靶點的篩選 通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報道收集干姜活性成分，使用ADMET軟件篩選出ADMET_Risk≤7.5、Absn_Risk≤3.5、CYP_Risk≤2.5、TOX_Risk≤2.0的活性成分作為候選藥效成分[5]。通過PharmMapper服務(wù)器選擇Z-score值大的前15名的蛋白作為候選靶蛋白[6]。再使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫選擇Probability值大的前15名的蛋白作為候選靶蛋白[7]，最后結(jié)合文獻(xiàn)報道進(jìn)行靶點分析與整理。

2.1.2 活性成分靶點的基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析 通過GeneCard數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行分類，采用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。通過OMIM數(shù)據(jù)庫以“Cold tolerence”和“Cold sensitivity”為檢索詞檢索出疾病靶點，Venny 2.1網(wǎng)站得到韋恩圖，并得到49個交集靶點作為核心靶點。通過Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出來的核心靶點進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。CTD數(shù)據(jù)庫找到核心靶點所對應(yīng)的疾病，建立靶點-疾病通路圖。通過Cytoscape軟件中MCODE分析進(jìn)行核心靶點模塊分析。

2.2 體內(nèi)實驗驗證

2.2.1 干姜醇提物的制備 取干姜50 g粉碎，過篩，加入95%乙醇400 mL，避光浸泡24 h，超聲提取1 h，靜置1 h后，再超聲1 h，抽濾，加入95%乙醇400 mL超聲1 h，抽濾并合并濾液，40 ℃減壓濃縮，揮干殘留的乙醇，得到干姜醇提取物[8]。經(jīng)HPLC檢測，干姜醇提物中6-姜酚、姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.55%、0.072%[9-10]。

2.2.2 常溫下動物分組及給藥 取12只小鼠作為對照組，另設(shè)置干姜低、中、高劑量（25、50、100 mg/kg）組。各給藥組ig干姜醇提物，連續(xù)15 d[8]。

取24只小鼠ig PTU（220 mg/kg），1次/d，連續(xù)30 d，制備甲減模型[3]，隨機(jī)分為PTU組、PTU＋干姜組，每組12只，PTU組ig生理鹽水，PTU＋干姜組ig干姜醇提物（50 mg/kg），1次/d，連續(xù)15 d。

取24只小鼠sc LT4（0.35 mg/kg），1次/d，連續(xù)14 d，制備甲亢模型[3,11]，隨機(jī)分為LT4組、LT4＋干姜組，每組12只，LT4組ig生理鹽水，LT4＋干姜組ig干姜醇提物（50 mg/kg），1次/d，連續(xù)15 d。

每天給藥1 h后監(jiān)測各組小鼠的肛溫、飲水量及體質(zhì)量的變化。實驗第15天，給藥1 h后，對照組和干姜低、中、高劑量組各取6只小鼠眼球取血，分離血清，按照試劑盒說明書測定血清中FT3、FT4水平。

2.2.3 低溫凍傷下動物分組及給藥 按“2.2.2”項下進(jìn)行分組及給藥，另取12只小鼠作為模型組。模型組ig生理鹽水，1次/d，連續(xù)15 d。實驗第15天給藥1 h后，模型組、干姜各劑量組、PTU組、PTU＋干姜組、LT4組和LT4＋干姜組各取6只小鼠，進(jìn)行（?20±1）℃低溫凍傷2 h[3]，眼球取血，分離血清，按照試劑盒說明書測定血清中FT3、FT4水平。模型組及干姜低、中、高劑量組和PTU組、PTU＋干姜組、LT4組、LT4＋干姜組各取6只小鼠，持續(xù)（?20±1）℃低溫凍傷直至小鼠休克驚厥，記錄小鼠休克驚厥時間。

2.2.4 小鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察 “2.2.3”項下小鼠眼眶采血后，處死小鼠，取甲狀腺組織，用包埋劑包埋冰凍切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化。

2.2.5 小鼠血清及甲狀腺氧化應(yīng)激水平測定 H2O2與鉬酸所生成的絡(luò)合物在405 nm處檢測其生成量可計算出H2O2的量[12]。使用H2O2試劑盒測定“2.2.3”項下對照組及模型組小鼠血清及甲狀腺中H2O2水平。

2.2.6 qRT-PCR檢測小鼠甲狀腺組織中甲狀腺功能相關(guān)因子mRNA表達(dá) 取“2.2.3”項下各組小鼠甲狀腺組織，按照試劑盒說明書提取甲狀腺組織中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析[13]。

2.3 體外實驗驗證

2.3.1 細(xì)胞存活率檢測 將對數(shù)生長期的BCPAP細(xì)胞以8000個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞完全貼壁后，隨機(jī)分為對照組、H2O2組、姜黃素（0.5、1、2 μmol/L）組、6-姜酚（2.5、5、10 μmol/L）、姜黃素（0.5 μmol/L）＋6-姜酚（5 μmol/L）組、姜黃素（0.037 μmol/L）＋6-姜酚（10 μmol/L）組、抗氧化劑-乙酰--半胱氨酸（-acetyl--cysteine，NAC，5 μmol/L）組和LT4（0.015 μmol/L）組[14]。各給藥組加入相應(yīng)藥物處理24 h后，除對照組外，其余各組再加入50 μmol/L H2O2處理24 h；每孔加入MTT，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值。

2.3.2 細(xì)胞谷胱甘肽、活性氧含量測定和Hoechst 33258染色 采用CMFDA探針檢測細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽含量（x/m＝492 nm/517 nm）[15]，DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量（x/m＝488 nm/525 nm）[15]，Hoechst 33258探針檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡情況（x/m＝450 nm/490 nm）[16]。收集“2.3.1”項下各組細(xì)胞，加入終濃度為5 μmol/L的CMFDA探針，37 ℃孵育30 min；加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA探針，37 ℃孵育30 min；加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的Hoechst 33258探針，37 ℃孵育15 min，用PBS洗掉未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針，于熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0、GraphPadPrism 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用檢驗，多組比較采用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 干姜活性成分與相關(guān)靶點篩選

通過文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫挖掘，共收集到170個活性成分。篩選排名前10的活性成分，分別為α-松油醇、異冰片、-冰片乙酸酯、2-[(2,5)-5-ethenyl-5-methyloxolan-2-yl]propan-2-ol、冰片、4-姜酚、姜黃素、1,8-桉樹腦、()-芳樟醇和6-姜酚。經(jīng)數(shù)據(jù)庫預(yù)測、合并去掉重復(fù)后，共獲得干姜潛在作用靶點148個。

3.2 靶點分類網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析

活性成分篩選出的148個靶點分類后利用STRING和Cytoscape構(gòu)建活性成分靶點分類圖（圖1），從靶點分類來看這些靶點與神經(jīng)內(nèi)分泌、代謝、心血管系統(tǒng)等密切相關(guān)?；钚猿煞职悬c與疾病靶點取交集，得到49個核心靶點（圖2），聚類分析發(fā)現(xiàn)模塊1與模塊2主要與激素生成、細(xì)胞對含氧化合物的反應(yīng)、糖類脂質(zhì)代謝相關(guān)，模塊3主要與甲狀腺激素生成密切相關(guān)，模塊4與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)（圖3）。

圖1 化合物靶點分類網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 藥物靶點與疾病靶點韋恩圖

圖3 核心靶點結(jié)構(gòu)聚類分析

3.3 核心靶點GO功能、KEGG通路富集分析及活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)分析

如圖4所示，GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點與激素代謝過程、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、甲狀腺激素代謝過程等相關(guān)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點與甲狀腺激素信號通路、FoxO信號通路等相關(guān)。活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖5，核心靶點與神經(jīng)內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。

3.4 干姜對常溫下小鼠甲狀腺的保護(hù)作用

如表2所示，常溫下，干姜給藥15 d后各劑量組小鼠飲水量和肛溫均較給藥前明顯升高（＜0.05、0.01）。如圖6所示，與對照組比較，干姜各劑量組血清中FT3水平顯著升高（＜0.05、0.01），干姜中劑量組血清中FT4水平顯著升高（＜0.01）。

圖4 核心靶點的GO功能與KEGG通路富集分析

圖5 化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)模式圖

表2 常溫下小鼠基本指標(biāo)(, n = 12)

Table 2 Basic indicators of mice at room temperature (, n = 12)

組別劑量/(mg·kg?1)體質(zhì)量/g肛溫/℃飲水量/mL 給藥前給藥后給藥前給藥后給藥前給藥后 對照—22.27±2.8023.00±2.2137.23±0.9537.25±0.976.38±0.175.98±0.12 干姜2520.46±1.1021.11±2.8537.24±0.8537.77±0.73**5.30±0.105.97±0.15* 5020.34±1.5320.12±1.8237.14±0.7237.81±0.46**5.13±0.236.35±0.22** 10022.37±2.0723.39±2.8837.83±0.3238.14±0.31**5.84±0.147.11±0.25** PTU＋干姜220＋5026.26±2.8225.94±3.0737.85±0.3737.85±0.474.93±0.063.48±0.07** PTU22025.06±2.4326.76±2.10*37.83±0.2137.80±0.265.01±0.183.33±0.00** LT4＋干姜0.35＋5022.93±3.3022.57±2.2037.45±0.8437.43±0.384.10±0.077.91±0.21** LT40.3523.66±2.9722.28±2.01*37.75±0.2137.80±0.144.19±0.248.00±0.33**

與同組給藥前比較：P＜0.05P＜0.01

P< 0.05P< 0.01same group before administration

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.5 干姜對低溫凍傷小鼠甲狀腺的保護(hù)作用

如圖7所示，小鼠低溫凍傷后，與模型組比較，干姜各劑量組小鼠的生存時間顯著延長，血清中FT3、FT4水平均顯著升高（＜0.05、0.01），甲狀腺組織、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），干姜中、高劑量組甲狀腺組織mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；鏡下可見甲狀腺腺泡破損減少。

3.6 PTU、LT4及與干姜聯(lián)合處理對低溫凍傷小鼠甲狀腺功能的影響

如表2所示，PTU組小鼠體質(zhì)量較給藥前顯著升高（＜0.05），飲水量顯著減少（＜0.01）；LT4組體質(zhì)量較給藥前顯著降低（＜0.05），飲水量顯著增加（＜0.01）。如圖8所示，小鼠低溫凍傷后，與模型組比較，PTU組小鼠生存時間明顯縮短，血清中FT3、FT4水平顯著降低（＜0.01），甲狀腺組織中、、、mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），甲狀腺濾泡大部分破碎，腔內(nèi)膠質(zhì)減少；經(jīng)干姜治療后情況均改善。與模型組比較，LT4組小鼠生存時間顯著延長，血清中FT3、FT4水平顯著升高（＜0.05、0.01），甲狀腺腺泡破損減少。而LT4＋干姜組小鼠生存時間明顯低于LT4組，說明干姜與LT4聯(lián)合用藥后不利于小鼠機(jī)體抗寒，干姜與LT4均可以促進(jìn)甲狀腺激素的分泌，二者聯(lián)合，可能導(dǎo)致甲狀腺激素分泌紊亂導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱失調(diào)，使小鼠死亡加快。

A-小鼠在（?20±1）℃環(huán)境中的生存時間 B-干姜對低溫凍傷小鼠血清中FT3和FT4水平的影響 (n = 6) C-干姜對低溫凍傷小鼠甲狀腺組織病理變化的影響(×200) D-干姜對低溫凍傷小鼠甲狀腺功能相關(guān)基因表達(dá)的影響 (n = 3) 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01 ##P＜0.01

A-小鼠在（?20±1）℃環(huán)境中的生存時間 B-PTU、LT4及與干姜聯(lián)合處理對低溫凍傷小鼠血清中FT3和FT4水平的影響 C-PTU、LT4及與干姜聯(lián)合處理對低溫凍傷小鼠甲狀腺組織病理變化的影響(×200) D-PTU、LT4及與干姜聯(lián)合處理對低溫凍傷小鼠甲狀腺功能相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.7 干姜活性成分對甲狀腺BCPAP細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

如圖9所示，模型組小鼠血清、甲狀腺組織中H2O2水平均明顯升高（＜0.01）。如圖10所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞變圓、脫落，各給藥組細(xì)胞形態(tài)均有所恢復(fù)。如圖11-A所示，與模型組比較，各給藥組細(xì)胞存活率均明顯升高（＜0.01）。如圖11-B所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量下降，活性氧含量上升，細(xì)胞凋亡上升；與模型組比較，各給藥組谷胱甘肽含量上升，活性氧下降，細(xì)胞凋亡下降。如圖11-C所示，與模型組比較，姜黃素組、、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01

圖10 姜黃素和6-姜酚對H2O2處理的BCPAP細(xì)胞形態(tài)的影響 (×200)

A-正常BCPAP細(xì)胞及H2O2處理的BCPAP細(xì)胞給予藥物預(yù)處理24 h后，各組細(xì)胞存活率 B-各組細(xì)胞CMFDA、DCFHDA及Hoechst 33258染色結(jié)果(×200) C-姜黃素對H2O2處理的BCPAP細(xì)胞甲狀腺功能相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

4 討論

人作為恒溫動物，機(jī)體在對外界環(huán)境感知上存在著動態(tài)調(diào)整與平衡。超過代償?shù)暮洵h(huán)境暴露會損害皮膚、心臟、甲狀腺等涉及到溫度調(diào)控的多個器官，這與中醫(yī)描述的寒邪客主、引起里寒癥候密切相關(guān)[17]。干姜作為溫里藥的代表性藥物，入《傷寒論》24方次，入《金匾要略》32方次[18]，提示其在溫中散寒方面需要明確其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法篩選得到干姜活性成分，選擇姜黃素和6-姜酚為代表的成藥性分子，姜黃素和6-姜酚均具有提高產(chǎn)熱保護(hù)低溫冷凍小鼠的作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過保護(hù)甲狀腺延長低溫冷凍小鼠生存時間[3]；6-姜酚通過激活褐色脂肪組織提高產(chǎn)熱保護(hù)低溫冷凍小鼠[19]；干姜中揮發(fā)油類化合物能夠促進(jìn)交感神經(jīng)、腎上腺系統(tǒng)機(jī)能活動增加[20]；姜辣素對心臟和血管有刺激作用，通過擴(kuò)張血管，興奮中樞神經(jīng)，增加血液循環(huán)，使全身溫?zé)?，對寒癥模型大鼠具有溫中作用[21-22]；二苯基庚烷類化合物具有細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用[23]。以上均揭示了干姜的物質(zhì)基礎(chǔ)與藥性（味）結(jié)合辛辣揮發(fā)類物質(zhì)的藥效學(xué)依據(jù)。

基于干姜物質(zhì)基礎(chǔ)對應(yīng)靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)模塊與通路分析結(jié)果，干姜活性成分靶標(biāo)多歸集于甲狀腺相關(guān)通路。甲狀腺激素在體內(nèi)具有廣泛的生理作用，主要促進(jìn)組織氧化及產(chǎn)熱，使機(jī)體能量代謝維持在一定的水平，調(diào)節(jié)機(jī)體溫度的穩(wěn)定。甲狀腺既是重要的產(chǎn)熱器官，同時還是冷凍傷害的重要靶器官[24]。因此低溫冷凍條件下對甲狀腺的保護(hù)至關(guān)重要。本課題組前期發(fā)現(xiàn)姜黃素具有促甲狀腺激素分泌的作用[3]。本研究中干姜醇提物對冷凍暴露誘導(dǎo)的甲狀腺組織的損傷有減輕作用，歸因于對甲狀腺功能基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，能夠上調(diào)mRNA表達(dá)水平，下調(diào)mRNA表達(dá)水平，使得小鼠甲狀腺激素FT3、FT4的分泌增加，從而提高甲狀腺的促甲狀腺激素功能。干姜同LT4的正協(xié)同與PTU的負(fù)協(xié)同作用，進(jìn)一步證明了干姜對低溫凍傷小鼠保護(hù)機(jī)制是基于促甲狀腺功能。

寒冷是通過皮膚冷感受器經(jīng)傳入神經(jīng)傳到中樞，促進(jìn)或抑制下丘腦分泌TRH，進(jìn)而影響甲狀腺素的分泌，促進(jìn)產(chǎn)熱代謝。但這種應(yīng)激狀態(tài)的失代償（過低溫度、冷暴露時間過長）在促進(jìn)甲狀腺激素合成的同時，也會誘發(fā)甲狀腺缺氧代謝，甲狀腺激素合成關(guān)鍵酶如過氧化物酶等代謝積累活性氧并引起氧化應(yīng)激[25]。Venditti等[25]研究發(fā)現(xiàn)寒冷引起的甲狀腺功能亢進(jìn)會在大鼠組織中產(chǎn)生氧化損傷，使甲狀腺、心臟、肝臟等發(fā)生氧化脅迫。因此調(diào)控冷應(yīng)激中甲狀腺活性氧過量積累、減少氧化應(yīng)激是抗低溫保護(hù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。H2O2作為甲狀腺激素合成的關(guān)鍵因子，當(dāng)H2O2濃度大于甲狀腺激素合成所需要時，H2O2的合成過程就會對甲狀腺細(xì)胞具有損傷作用。、被認(rèn)為是甲狀腺限制性基因，僅在甲狀腺濾泡細(xì)胞中存在，而大多人類甲狀腺癌細(xì)胞中已經(jīng)喪失了、、基因的表達(dá)，但BCPAP細(xì)胞未喪失、、、等甲狀腺功能相關(guān)基因的表達(dá)，可以分泌甲狀腺激素，具有甲狀腺功能[26-28]。本研究對姜黃素和6-姜酚保護(hù)甲狀腺BCPAP細(xì)胞免受H2O2氧化損傷的實驗進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)姜黃素（0.5～2 μmol/L）、6-姜酚（2.5～10 μmol/L）可以通過抗氧化對甲狀腺細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，這與李浩銘[14]研究一致。以上結(jié)果表明2種代表成分可能通過上調(diào)抗氧化通路，防止細(xì)胞氧化應(yīng)激死亡，進(jìn)而發(fā)揮保傷甲狀腺作用。

綜上，溫里藥干姜通過促進(jìn)甲狀腺激素釋放，延長了冷凍處理小鼠的生存時間，與其對甲狀腺在低溫氧化應(yīng)激保護(hù)密切相關(guān)。本研究以干姜為例解釋了溫里藥在低溫凍害防護(hù)上的積極意義，為環(huán)境醫(yī)學(xué)防護(hù)提供證據(jù)，為深入了解溫里藥抵抗低溫保護(hù)應(yīng)用提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Active molecules screening of dry-heat-relatedand protective mechanism against thyroid oxidative stress induced by low-temperature frostbite in mice

MIAO Yan-feng1, WEI He1, LI Cheng2, ZHANG Jing1, LI Zhao-xue3, WANG Xiao-qin2, ZHANG Bo1, 2

1. Xinjiang Key Laboratory of Plant Medicine Resource Utilization, Ministry of Education, School of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832002, China 2. Sichuan Antimicrobial Industry Research Institute, School of Pharmacy, Chengdu University, Chengdu 610106, China 3. The First Affiliated Hospital of Shihezi University, Shihezi 832002, China

To explore the pharmacological characteristics of dry heat properties of Ganjiang () and its protective effect on low temperature frostbite.Taking the evaluation of thyroid function as the research content, a low-temperature frostbite mouse model (?20 ± 1) ℃ was established, and protective effect ofalcohol extract on low-temperature frostbite in mice was evaluated by means of morphology and molecular biology. The active ingredients and key targets were screened out by chemical methods. Anhuman papillary thyroid carcinoma BCPAP cell model of oxidative damage was established to evaluate the protective effect of related active molecules.The representative drug molecules such as curcumin were screened out by systematic pharmacological method, and predicted targets were enriched in five signaling pathways including thyroid hormone signaling pathway and FoxO pathway.alcohol extract significantly prolonged the survival time of low-temperature frostbite mice, increased levels of free triiodothyronine (FT3) and free thyroxine (FT4) in serum (< 0.05, 0.01), up-regulated thyroid function-related genes sodium/iodide cotransporter (), thyroid peroxidase ()and thyroglobulin () mRNA expression levels in mice (< 0.01), down-regulated thyroid stimulating hormone receptor() mRNA expression level (< 0.01), improved the damage of thyroid follicles caused by hypothermia.experiments found that curcumin and 6-gingerol, the representative components of, had significant protective effects on H2O2-induced BCPAP cell injury (< 0.05, 0.01).and its active components, curcumin and 6-gingerol, can protect mice from low temperature frostbite by resisting thyroid oxidative stress and promoting thyroid function.

; antifreeze; dry heat; warming; thyroid; system pharmacology; curcumin; 6-gingerol

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5379 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.014

2022-03-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（U1603122）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)創(chuàng)新領(lǐng)域中青年領(lǐng)軍人才項目（2018CB019）

苗艷豐（1996—），女，碩士，研究方向為中藥藥理學(xué)。Tel: 18699597678 E-mail: 2689607902@qq.com

張 波（1978—），男，研究生導(dǎo)師，教授，從事系統(tǒng)藥理學(xué)與中藥藥理學(xué)研究。Tel: (0993) 2057670 E-mail: bozhang_lzu@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]