基于化學計量學研究莪術(shù)-三棱藥對水煎液物理參數(shù)與化學成分的相關(guān)性

單東杰，羅秀明，常艷麗，呂 芳，姚鑒玲，魏 靜，于啊香，董 英，張 燕，折改梅*

基于化學計量學研究莪術(shù)-三棱藥對水煎液物理參數(shù)與化學成分的相關(guān)性

單東杰1，羅秀明2，常艷麗1，呂 芳1，姚鑒玲1，魏 靜1，于啊香1，董 英1，張 燕3，折改梅1*

1. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029 2. 東阿阿膠股份有限公司 國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城 252200 3. 北京四環(huán)制藥有限公司，北京 101113

基于化學計量學對莪術(shù)-三棱藥對水煎液物理參數(shù)與化學成分的相關(guān)性進行分析，探索利用直觀物理參數(shù)表征化學成分含量的可行性。測定莪術(shù)-三棱藥對水煎液的物理參數(shù)（電導率、黏度、pH值和色度）；采用苯酚-硫酸法測定水煎液的多糖含量、考馬斯亮藍法測定水煎液的總蛋白含量，建立水煎液HPLC指紋圖譜，并采用HPLC-MS/MS技術(shù)表征水煎液中化學成分組成；利用Pearson相關(guān)系數(shù)、灰色關(guān)聯(lián)度、前向逐步回歸法等化學計量學方法，探索物理參數(shù)與化學成分的相關(guān)性，并嘗試建立以物理參數(shù)預測化學成分含量的數(shù)學模型。pH值與莪術(shù)-三棱藥對水煎液總蛋白、二芳基庚烷類化合物含量相關(guān)性較強，均為正相關(guān)；電導率與總蛋白、多糖含量相關(guān)性較強，均為正相關(guān)；溶液亮度與總蛋白、二芳基庚烷類化合物含量關(guān)系密切，與前者呈負相關(guān)、與后者呈正相關(guān)；總蛋白、倍半萜類和二芳基庚烷類化合物含量對溶液的紅綠、黃藍色影響較大；溶液黏度與總蛋白含量呈正相關(guān)。有機酸類成分、多糖和總蛋白的含量與物理參數(shù)的數(shù)學方程擬合度較高，可以作為快速分析莪術(shù)-三棱藥對水煎液化學成分含量的依據(jù)。通過化學計量學分析，莪術(shù)-三棱藥對水煎液的物理參數(shù)與其化學成分呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，建立的數(shù)學模型初步表明可以通過簡單的物理參數(shù)表征水煎液的化學成分含量。

莪術(shù)-三棱藥對；物理參數(shù)；總蛋白；多糖；化學計量學；相關(guān)性

湯劑作為中醫(yī)傳統(tǒng)用藥的主要形式和藥物劑型之一，其外在質(zhì)量往往體現(xiàn)在其物理參數(shù)，如黏度、濁度、pH值、電導率、表面張力、折光率等；內(nèi)在質(zhì)量往往體現(xiàn)在其化學成分，如在水煎煮過程中溶入水中的各藥味所含的小分子成分（黃酮、蒽醌、生物堿、皂苷、萜類等）和生物大分子成分（蛋白質(zhì)、多糖等），以及部分無機元素等。作為共同表征湯劑質(zhì)量的物理和化學屬性具有相關(guān)性，即化學成分組成、含量、存在形式等均會影響和改變其物理參數(shù)。例如，單萜、倍半萜等揮發(fā)性成分在水煎過程中形成飽和芳香水可使中藥中的其他親脂性成分溶解度顯著增大；具有表面活性的皂苷類物質(zhì)在湯劑中形成膠體溶液，可有效起到助溶和增溶的作用；生物堿類、有機酸等成分會改變湯劑pH值并影響體系內(nèi)的酸堿平衡；黃酮類、兒茶素等成分與水煎液色度有關(guān)聯(lián)性[1]；多糖、蛋白質(zhì)等大分子成分會影響水煎液的密度、亮度以及黏度等[2-3]。在中藥領(lǐng)域已有將物理和化學屬性進行相關(guān)性分析的研究報道[4-7]。陳婷等[4]采用UPLC-MS/MS技術(shù)分析乳香-沒藥藥對水煎液中的化學成分，并將其與水煎液的物理參數(shù)（電導率、鹽度、濁度、黏度、pH值）進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明化學成分的組成和含量都會影響水煎液的物理性質(zhì)。其中，五環(huán)三萜酸酯與濁度呈顯著正相關(guān)，倍半萜與黏度呈顯著負相關(guān)。

化學計量學在中藥研究中的應用已經(jīng)成為國內(nèi)外專家共同關(guān)注的研究熱點，課題組圍繞該熱點開展了系列研究，尤其是在建模、預測和驗證方面做了大量工作[8-10]。目前中藥領(lǐng)域常用的化學計量學分析方法主要有相關(guān)性分析、回歸分析、主成分分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析等[11-12]。在中藥物理和化學屬性相關(guān)性分析方面，大部分只采用回歸模型。本研究擬采用Pearson相關(guān)系數(shù)、灰色關(guān)聯(lián)度以及前向逐步回歸法等多種化學計量學方法分析中藥物理和化學屬性的相關(guān)性，并嘗試利用前向逐步回歸法建立以物理參數(shù)預測化學成分含量的數(shù)學模型。前向逐步回歸算法過程為：（1）模型中只有一個單獨解釋因變量變異最大的自變量；（2）嘗試將加入另一自變量；（3）根據(jù)自變量加入后模型對因變量的解釋度是否增加為標準，重復步驟（2），直到建立對因變量解釋度最高的模型。步驟（2）判斷對模型解釋程度的指標為赤池信息準則，該準則不僅能提高模型擬合度（極大似然），而且引入了懲罰項，使模型參數(shù)盡可能少，有助于降低過擬合的可能性。此外，前向逐步回歸算法在數(shù)據(jù)導入分組時自動劃分為訓練集和測試集，這樣建立的模型不僅擬合程度高，且經(jīng)歷過算法內(nèi)部驗證，更適用于建立預測模型。

莪術(shù)-三棱藥對出自于清代《經(jīng)驗良方》中的三棱丸，是臨床常用的經(jīng)典藥對，可活血化瘀，主要用于治療血滯經(jīng)閉腹痛之癥證[13]。莪術(shù)-三棱藥對臨床常以1∶1的比例與其他藥味組合給藥。莪術(shù)-三棱藥對的主要化學成分為揮發(fā)油（單萜、倍半萜和芳香族衍生物等）、二芳基庚烷類、有機酸等[13-14]。本研究以莪術(shù)-三棱藥對為研究對象，測定藥對水煎液的物理參數(shù)和化學成分，研究2類屬性的相關(guān)性，探索利用直觀物理參數(shù)表征化學成分含量的可行性。樣品的含量測定過程復雜繁瑣，建立預測模型后，則可以通過測量提取液的物理參數(shù)，快速計算各時刻的化學成分含量，降低中藥中化學成分含量測定難度，為中藥提取過程中的快速質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-100DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DDS-307A電導率儀（上海佑科儀器儀表有限公司）；品式黏度計（上海寶山啟航玻璃儀器廠）；pH計（Mettler Toledo公司）；CM-S色度計（Konica Minolta公司）；1901PC紫外分光光度計（上海棱光有限公司）；BT25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；CP224C萬分之一天平 [奧豪斯儀器（常州）有限公司]；DZKW4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；1100型高效液相色譜儀（Agilent科技有限公司）；S6000型高效液相色譜儀 [華譜科儀（北京）科技有限公司]；Agilent Q-TOF 6520質(zhì)譜儀（ESI離子源，Agilent科技有限公司）。

1.2 藥材

莪術(shù)飲片由北京中醫(yī)藥大學王晶娟教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)Val. 的干燥根莖；三棱為黑三棱科植物黑三棱Buch. -Ham. 的干燥塊莖。所有樣本均保存于北京中醫(yī)藥大學中藥學院B座417實驗室。26批莪術(shù)和三棱飲片信息見表1。

1.3 對照品與試劑

葡萄糖對照品（批號S08J6G1，上海源葉生物科技有限公司）；考馬斯亮藍（批號EZ2811F373，賽國生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（批號EZ2811E172，賽國生物科技有限公司）；氯仿、正丁醇、乙醇、苯酚、磷酸、濃硫酸（北京化工廠）均為分析純；乙腈、甲酸（美國Fisher公司）均有色譜純和質(zhì)譜純；實驗用水為去離子水（實驗室自制）和娃哈哈純凈水（中國杭州娃哈哈集團有限公司）。

表1 莪術(shù)和三棱飲片信息

Table 1 Informationof Curcumae Rhizoma and Sparganii Rhizoma decoction pieces

編號藥材名稱產(chǎn)地批號編號藥材名稱產(chǎn)地批號 1莪術(shù)廣西17100114莪術(shù)廣西20180227 三棱四川17090101三棱河南20170701 2莪術(shù)廣西160121515莪術(shù)廣西1609001 三棱廣西170201001三棱江蘇17030305 3莪術(shù)廣西2018040116莪術(shù)云南161221 三棱江西201803176三棱浙江16032101 4莪術(shù)廣西16052417莪術(shù)廣西170801 三棱河南170301三棱河南160902 5莪術(shù)廣西18030118莪術(shù)廣西G00317J01 三棱浙江180101三棱安徽G08616F01 6莪術(shù)廣西2018032719莪術(shù)廣西1611073 三棱河南20160806三棱浙江1611082 7莪術(shù)廣西16010120莪術(shù)廣東601154140 三棱河南17110101三棱河南161025004 8莪術(shù)廣西2018032721莪術(shù)廣西17042001 三棱河南20180104三棱河南161025004 9莪術(shù)廣西160110222莪術(shù)浙江180160701 三棱江蘇1605195三棱浙江160219 10莪術(shù)浙江2017050123莪術(shù)廣西18032212 三棱四川20170305三棱江西17111414 11莪術(shù)廣西17010124莪術(shù)廣西815090101 三棱江蘇161001三棱浙江816041891 12莪術(shù)廣西160600425莪術(shù)四川20180607 三棱江蘇1606216三棱四川20180617 13莪術(shù)廣西20180158326莪術(shù)浙江20120014 三棱江西171201三棱河南20160153

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析，組間差異性采用單因素方差分析，＜0.05表示有顯著性差異。Origin 2018 64 Bit用于Pearson相關(guān)系數(shù)分析，R語言3.4.1用于前向逐步回歸分析，Microsoft Excel用于灰色關(guān)聯(lián)度分析?！吨兴幧V指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》用于指紋圖譜的建立。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

稱取不同批次莪術(shù)、三棱飲片各100 g，加入2000 mL去離子水，浸泡30 min，煎煮1 h，濾過，濾渣加水1600 mL，煎煮1 h，合并濾液，減壓濃縮至1 g/mL（按生藥量計），得莪術(shù)-三棱藥對水煎液樣品，記為S1～S26。

2.2 物理參數(shù)測定

2.2.1 不同濃度稀釋液樣品制備 取“2.1”項下各批次藥對樣品，加水稀釋得1/2、1/5、1/10、1/20稀釋液。

2.2.2 電導率 取“2.2.1”項下各批次不同稀釋液樣品適量，室溫下，以電導率儀測定樣品的電導率，結(jié)果見表2。

電導率是衡量溶液體系離子濃度的指標。結(jié)果表明不同批次樣品電導率差異明顯，1/2稀釋液的電導率為3.53～10.77 S/m，1/5稀釋液的電導率為1.61～6.70 S/m，1/10稀釋液的電導率為0.85～4.22 S/m，1/20稀釋液的電導率為0.43～2.23 S/m。說明不同批次樣品中金屬離子、蛋白、有機酸類帶電膠體粒子濃度存在差異。此外，由表2直觀分析發(fā)現(xiàn)，溶液按比例稀釋，其電導率值也隨之降低，不同濃度下樣品的電導率具有顯著性差異（＜0.05）。

2.2.3 pH值 取“2.2.1”項下各批次不同稀釋液樣品適量，室溫下，以pH計測定樣品的pH值，見表2。

各稀釋液的pH值在3.49～5.81，顯弱酸性，呈現(xiàn)顯著性差異（＜0.05）。當溶液不斷被稀釋時，溶液的pH值沒有發(fā)生顯著變化。推測煎煮過程中，三棱自身所含的有機酸在溶出的過程中與其鹽形成了緩沖體系，因此溶液的酸堿度不易隨著濃度的改變而改變。研究表明，姜黃素類化合物在pH＜5時較為穩(wěn)定，三棱中的有機酸構(gòu)建了穩(wěn)定的弱酸環(huán)境使該類化合物不易被分解，可能是二者相須配伍的原因之一[15]。

2.2.4 黏度 取“2.2.1”項下各批次不同稀釋液樣品適量，室溫下，以品式黏度計測定樣品的黏度，結(jié)果見表2。

黏度是度量流體黏性程度的物理量。中藥湯液中，淀粉、黏液質(zhì)、果膠等高分子物質(zhì)的含量與藥液的黏度密切相關(guān)。結(jié)果顯示不同批次樣品的相對黏度在1.558～2.298 mm2/s，隨溶液濃度降低，黏度會隨著降低，有顯著性差異（＜0.05）。

2.2.5 色度測定 取“2.2.1”項下各批次不同稀釋液樣品適量，室溫下，以色度計測定樣品的色度值，數(shù)據(jù)用、*、*色空間法表示。其中為亮度值，值越大亮度越高；*為紅-綠色軸，*值越大越紅，*值越小則越綠；*為黃-藍色軸，*值越大越黃，*值越小則越藍，結(jié)果見表3。

由表3可知，藥對水煎液值較大，表明樣品溶液的亮度較大，且隨著溶液的濃度降低，亮度逐漸增大。與*值相比，藥對水煎液*值較大，說明樣品偏黃色，與實際相符。*值較小且有負值出現(xiàn)，表明樣品中幾乎沒有綠色。各樣品不同稀釋液之間的色度值有顯著性差異（＜0.05）。dE*是指在色空間中2個顏色點之間的距離，表示2個顏色在視覺上的顏色差異，可以分析同一濃度下樣品的色度差異。根據(jù)行業(yè)的不同，dE*的標準各不相同。但通常認為dE*小于1時，人眼將無法分辨兩種顏色的差別[16]。

dE*＝[(dL)2＋(d*)2＋(d*)2]1/2

依據(jù)上述公式對26批藥對水煎液每2組間的dE*進行比較，1/2提取液顏色較深，各樣品之間的差異明顯（dE*＞1），隨著溶液濃度不斷降低，亮度越來越大，樣品顏色越來越淺，樣品間的差異越來越小，dE*逐漸減小，1/5、1/10、1/20稀釋液分別出現(xiàn)1、5、16個dE*＜1的數(shù)值。

2.3 化學成分含量測定

2.3.1 多糖、蛋白質(zhì)含量測定

（1）供試品溶液制備：取“2.1”項下的樣品，采用Sevag法除蛋白。取氯仿-正丁醇（4∶1）適量加入樣品液中，充分振搖，靜置30 min，重復3次。采用傾析法取出上清液加入無水乙醇使醇含量達到80%，靜置1 h，離心30 min（4000 r/min）后濾過，棄濾液，干燥后得到粗多糖。精密稱取粗多糖10 mg，加水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的粗多糖母液。再取1～2 mL母液定容至10 mL量瓶，即得多糖供試品溶液。

表2 莪術(shù)-三棱藥對水煎液電導率、pH和黏度值測定結(jié)果

Table 2 Results of conductivity, pH and viscosity of Curcumae Rhizoma-Sparganii Rhizoma decoction

編號電導率/(S·m?1)pH值黏度/(mm2·s?1)1/21/51/101/201/21/51/101/201/21/51/101/20 S1 7.593.601.951.045.105.114.855.141.7101.6411.6631.601 S2 8.054.012.111.225.015.045.064.921.7551.6141.6401.586 S3 3.861.700.890.475.054.824.734.701.6241.5931.6271.579 S4 5.421.811.270.705.125.014.985.321.6571.5691.6141.569 S5 3.671.670.870.495.245.174.945.021.6331.5781.6121.580 S6 8.184.032.271.224.224.284.434.431.7421.6211.6421.600 S7 5.662.721.510.804.714.744.744.701.6901.5911.5971.587 S8 8.434.292.401.264.934.944.844.841.7801.6321.6081.601 S9 8.324.012.181.154.894.924.914.931.7101.6401.6641.746 S10 6.833.211.770.905.215.265.015.081.7151.6251.5591.591 S11 7.963.762.081.115.075.015.105.071.7501.6301.5701.561 S12 3.531.610.850.435.265.094.894.851.6311.6041.5721.708 S13?6.704.222.234.714.704.744.732.1361.8221.6571.652 S14 9.013.882.101.195.275.255.235.231.7461.6321.6271.607 S15 8.233.972.111.175.205.185.164.801.7221.6341.5851.630 S16?6.653.912.014.634.754.744.782.2981.7091.6661.607 S17 7.723.701.931.065.815.755.665.791.6761.6431.5991.619 S18 7.833.982.241.203.493.633.713.911.6431.5931.5681.600 S19 8.784.192.211.045.135.185.125.211.7421.5911.5811.635 S20 7.233.511.901.204.304.384.414.231.7061.6151.6071.622 S21 7.353.571.891.004.164.224.314.231.6401.6041.5581.592 S2210.775.473.191.705.255.385.235.202.1961.7931.6491.679 S23 7.243.291.810.955.345.435.245.041.6911.5991.5971.624 S24 4.532.011.100.585.205.135.035.221.6121.6271.5771.608 S25 7.233.261.770.805.445.155.285.061.6951.6521.5741.649 S26 7.503.461.871.004.984.985.015.011.6611.6011.5721.604

取“2.1”項下的樣品，加水稀釋5倍，即得蛋白質(zhì)供試品溶液。

（2）對照品溶液制備：精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品2 mg，加水定容于10 mL量瓶中，配制成0.2 mg/mL的母液。

精密稱取牛血清白蛋白2 mg，加水定容至2 mL，得對照品母液。用去離子水梯度稀釋母液，質(zhì)量濃度分別為20、40、80、120、160、200 μg/mL。

（3）含量測定：采用優(yōu)化后的苯酚-硫酸法測定26批莪術(shù)-三棱藥對水煎液的多糖含量，平行測定2次求平均值，結(jié)果見表4。

采用考馬斯亮藍法[17]測定26批莪術(shù)-三棱藥對水煎液的總蛋白含量，平行測定2次求平均值，結(jié)果見表4。

2.3.2 HPLC-MS/MS分析

（1）供試品溶液制備：取“2.1”項下各批次樣品，水浴蒸干，蒸干后的粉末用無水乙醇溶解，超聲處理15 min，過0.22 μm微孔濾膜即得供試品溶液。

（2）混合對照品溶液制備：為了精確鑒定三棱、莪術(shù)共煎后的化學成分，分別稱取適量各對照品（前期實驗室分離純化得到）用無水乙醇定容于5 mL量瓶中，得對照品儲備液。分別吸取各對照品儲備液適量，混勻即得混合對照品溶液。

表3 莪術(shù)-三棱藥對水煎液色度值測定結(jié)果

Table 3 Results of chromaticity value of Curcumae Rhizoma-Sparganii Rhizoma decoction

編號L*值a*值b*值1/21/51/101/201/21/51/101/201/21/51/101/20 S166.1883.1389.2494.7516.40 4.48 0.70?0.3241.1038.7628.1714.67 S262.0877.7986.8692.6420.71 9.37 2.46?0.2634.6146.4736.8924.07 S382.6593.5296.1498.22 4.34?0.11?0.56?0.4644.6816.7611.68 6.77 S481.6693.0294.4097.37 5.29?0.29?0.53?0.4737.4316.7714.25 7.75 S581.8491.5095.1297.52 4.84 0.54 0.07?0.1040.7820.3910.16 6.29 S676.5486.0192.7596.7611.10 2.40?0.58?0.9935.4241.3324.5913.15 S780.3491.5695.8398.11 6.39 0.18?0.54?0.5251.0126.5113.66 7.67 S862.0778.6987.9793.8421.07 5.46 1.12?0.2046.7149.0030.5019.51 S962.6481.3790.2495.3822.66 6.21 1.06?0.5271.7649.0427.7817.13 S1075.8587.0492.3096.0611.55 2.90 0.79 0.0443.2533.0418.76 9.76 S1162.5980.4592.4089.4321.51 7.39 0.28 2.8752.8145.6920.7337.60 S1286.0893.9696.6598.27 3.65 0.08?0.16?0.1829.1718.418.91 5.34 S1364.0964.1680.6188.4032.8717.77 6.02 0.8459.2267.5936.4230.73 S1472.6787.1291.6095.2313.78 3.18 0.56 0.0234.1726.4825.6210.78 S1577.3089.4194.2397.29 8.47 1.50?0.01?0.2849.9524.5315.58 8.39 S1648.5683.7084.0391.3731.03 6.21 3.63 0.2472.2617.2842.3322.21 S1772.1389.1993.5696.4711.53 2.13 0.17?0.1944.3421.7718.8510.28 S1881.5890.7694.8696.97 6.91?0.33?1.30?0.8951.2432.8718.67 9.92 S1958.4679.0388.7794.5720.34 5.47 0.44?0.8960.0950.6428.9217.71 S2072.4286.5192.7596.2613.52 2.40?0.04?0.4659.2837.9319.3010.74 S2149.4461.6477.4387.4723.1225.4210.27 2.1320.3078.4157.6538.87 S2249.1772.0482.9690.9526.2011.65 3.54 0.0151.2060.3241.5424.63 S2365.8382.4691.7795.9515.81 3.79?0.05?0.7939.8845.5824.3514.50 S2478.8691.3495.3397.76 4.87?0.02?0.63?0.5137.2024.2813.61 8.02 S2574.9389.4194.6597.9311.19 1.95 0.13?0.3550.6630.9216.53 8.84 S2661.1284.0388.5794.2519.82 4.89 1.73 0.1349.1424.9826.5915.10

表4 莪術(shù)-三棱藥對水煎液多糖、蛋白質(zhì)含量

Table 4 Contents of polysaccharide and protein in Curcumae Rhizoma-Sparganii Rhizoma decoction

編號多糖/(mg·g?1)總蛋白/(mg·g?1)編號多糖/(mg·g?1)總蛋白/(mg·g?1) S11.7860.420S141.8610.146 S23.1040.378S152.3590.163 S31.4680.211S161.7770.429 S40.5360.145S170.2170.572 S50.9320.151S180.4730.085 S61.4740.142S190.9160.307 S71.1700.205S202.9640.136 S83.0630.346S211.6610.274 S93.0220.226S220.4900.543 S100.9860.260S230.5320.316 S111.0570.291S240.8070.311 S120.6830.249S250.6510.563 S131.3610.553S262.8570.290

（3）液相條件：SilGreen C18HPLC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量為10 μL；流動相為乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，10%～15% A；4～10 min，15%～25% A；10～13 min，25%～35% A；13～30 min，35%～40% A；30～50 min，40%～45% A；50～65 min，45%～50% A）。

（4）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（Dual ESI），分別在正、負離子模式下檢測，一級、多級模式分別掃描，分辨率為30 000；離子源電壓為3.5 kV；毛細管加熱溫度為320 ℃，體積流量為12 L/min；霧化器壓力為207 kPa，Skimmer為65 V，碎裂電壓80 V，用質(zhì)心模式采集，速率為1 spectra/s，/50～1000，碰撞能量為25 eV。

（5）精密度試驗：取供試品溶液，按上述液相條件連續(xù)進樣6次，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD＜3%，表明儀器精密度良好。

（6）穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液，按上述液相條件分別于0、2、4、8、10、12 h進樣，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD＜2%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

（7）重復性試驗：取莪術(shù)-三棱飲片，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述液相條件進樣，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD＜2%，表明方法的重復性良好。

（8）指紋圖譜的建立：記錄26批藥對樣品色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對所得莪術(shù)-三棱的色譜圖進行分析生成對照指紋圖譜，見圖1。結(jié)果顯示26批藥對樣品色譜的共有峰的數(shù)量較少，且各樣品的相似度較低。為了盡可能全面地闡釋藥對中的化學成分，本實驗最終選擇了與對照指紋圖譜及其他批次樣品色譜圖相似度較高、色譜峰數(shù)量較多、峰面積較高的2批樣品S10和S26，全面分析其色譜峰，最終得到31個色譜峰，包含9個共有峰。

圖1 莪術(shù)-三棱藥對水煎液HPLC指紋圖譜

（9）化學成分的鑒定：在收集多種化合物對照品的基礎上，通過國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫（Scifinder、CNKI等）檢索莪術(shù)、三棱（科、屬、種）相關(guān)化學成分信息，建立莪術(shù)、三棱中各類化學成分數(shù)據(jù)庫。并計算相關(guān)化合物的[M＋H]+、[M＋Na]+、[M－H]?、[M＋HCOO]?準分子離子的精確質(zhì)荷比，為化合物分析鑒定提供參考。通過藥對的化學成分數(shù)據(jù)庫、對照品的對比以及相關(guān)文獻報道的數(shù)據(jù)[18-22]，在S10和S26樣品的水煎液中，實現(xiàn)了對31個色譜峰的定性，正、負離子模式下S10和S26樣品水煎液的總離子流圖見圖2。已鑒定出的化合物見表5和圖3，其中包括15個鏈狀二芳基庚烷類化合物，7個倍半萜類化合物，6個有機酸類化合物以及3個其他類成分（1個環(huán)二肽類、1個揮發(fā)油和1個糖苷類）。

圖2 莪術(shù)-三棱水煎液總離子流色譜圖

表5 基于HPLC-MS/MS正、負離子模式下莪術(shù)-三棱藥對水煎液中化合物信息

Table 5 Compounds information of Curcumae Rhizoma-Sparganii Rhizoma decoction based on positive and negative ion mode of HPLC-MS/MS technology

序號tR/min分子式質(zhì)量數(shù) (m/z)MS2碎片化合物名稱類型[M＋H]+[M－H]? 1 2.861C21H28O6 375.177 6339, 298, 251, 203, 179, 161, 131, 119, 893,5-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-heptane二芳基庚烷 2 4.152未知230.102 2 215, 200, 187, 162, 145, 136, 109, 98未知有機酸 3 4.662未知441.197 8 423, 405, 383, 317, 279, 256, 237, 219, 192, 178, 159, 132, 113未知二芳基庚烷 4 5.292C15H24O3253.129 5 236, 220, 204, 191, 166, 150, 122, 108, 96isozedoarondiol或其他同分異構(gòu)體倍半萜 5 6.348未知163.059 8161.045 5148, 133, 119, 109, 93, 79未知有機酸 6 6.719C15H24205.060 9 180, 166, 146, 135, 120, 108, 98, 70欖香烯倍半萜 7 8.605C10H16N2O2197.127 9 171, 141, 128, 112, 99, 84, 70, 54環(huán)-(L-脯-L-纈)二肽環(huán)二肽 8 9.274C15H20O4265.142 8 247, 229, 214, 173, 159, 143, 121, 105curcolonol倍半萜 910.553C10H20O6237.132 6 244, 227, 201, 175, 163, 147, 125, 107, 95, 57正丁基-β-D-吡喃果糖苷糖苷 1012.472C7H6O2123.043 5 109, 95, 77, 67對羥基苯甲醛有機酸 1112.860C15H14O211.142 2 194, 180, 167, 154, 138, 120, 114, 98, 86, 79linderazulene倍半萜 1213.447C9H8O3165.054 1 147, 119, 91, 77對羥基桂皮酸有機酸 1314.394C10H10O4195.108 5 181, 167, 153, 149, 135, 113, 107, 91, 69阿魏酸有機酸 1416.109C19H20O3297.147 2 266, 251, 237, 203, 187, 149, 1331,7-bis(4-hydroxyphenyl)-6-hepten-3-one二芳基庚烷 1516.537C19H24O5333.166 5 313, 295, 209, 193, 1793,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl)- 7-(4-hydroxyphenyl)-heptane二芳基庚烷 1616.728C20H23O4327.159 3 294, 277, 248, 217, 177, 163, 149, 137, 123, 1071-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-3-one二芳基庚烷 1716.889C15H20O2233.153 0 218, 209, 200, 187, 175,furanogermacrene/curcumafuranol倍半萜 1817.248C20H24O6 359.151 7315, 261, 236, 191, 165, 150, 136, 1195-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy- phenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-3-heptanone二芳基庚烷 1917.750C19H24O4 315.161 7297, 279, 209, 191, 173, 163, 149, 131, 121, 1061,7-bis-(-4-hydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-heptane二芳基庚烷 2017.927C19H20O2281.144 1 267, 220, 187, 147, 133, 121, 107, 911-bis(4-hydroxyphenyl)-7-phenyl-6-hepten-3-one二芳基庚烷 2118.476/23.393C21H25O6373.163 9 356, 339, 315, 277, 247, 203, 185, 163, 149, 123, 1033-acetoxy-5-hydroxy-1-(3,4-dihydr-oxyphenyl)-7-(4-hydroxylphenyl)-heptane二芳基庚烷 2219.489C15H20O4265.143 2 229, 201, 161, 139, 123, 107zedoalaetone H倍半萜 2321.384C21H26O6 373.167 3331, 313, 295, 207, 163, 122, 933-acetoxy-5-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy- phenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-heptane二芳基庚烷 2421.509/28.025C21H24O5357.169 0 297, 203, 187, 163, 149, 133, 123, 107, 913-acetoxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-6-heptene二芳基庚烷 2521.927C22H28O7 403.177 9361, 343, 328, 221, 192, 161, 135, 1081,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy- 5-methoxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl- 3-methoxyphenyl)-heptane二芳基庚烷 2622.238未知387.180 3 360, 327, 295, 226, 203, 177, 163, 149, 137, 123, 103未知二芳基庚烷 2722.978C16H22O4277.128 3 248, 201, 185, 167, 157, 149, 139, 115, 101鄰苯二甲酸二丁酯有機酸 2824.162C23H28O8 431.172 4389, 371, 329, 311, 293, 249, 207, 189, 163, 1223,5-diacetoxy-1,7-bis(3,4-dihydroxy-phenyl)-heptane二芳基庚烷 2926.023C21H26O5 357.171 1315, 297, 209, 191, 163, 149, 133, 1063-acetoxy-5-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy- phenyl)-7-(4-hydroxyphenyl)-heptane二芳基庚烷 3026.470C15H22O2235.168 9 217, 199, 189, 177, 169, 147, 133, 105, 93curcumenol或其同分異構(gòu)體倍半萜 3127.851C15H18O3247.132 8 229, 211, 196, 181, 159, 149, 143, 133, 123, 107zedoalactone F倍半萜

（10）各類型成分的相對含量：同一結(jié)構(gòu)類型化學成分的物理性質(zhì)以及對物理參數(shù)的影響相似，且發(fā)揮的藥效類似，可以作為整體進行分析。因此，將31個化合物按照結(jié)構(gòu)類型分為4類：二芳基庚烷類、倍半萜類、有機酸類、其他類。將“指紋圖譜的建立”項下生成的對照指紋圖譜的色譜峰面積計為1，獲得4類化合物在不同批次藥對中的相對峰面積（表6），以相對峰面積粗略地代表相對含量。

2.4 物理參數(shù)與化學成分相關(guān)性分析

2.4.1 參數(shù)編號 為了方便分析，對物理參數(shù)（1/5稀釋液）和化學成分相對含量進行編號：C1-二芳基庚烷類化合物、C2-倍半萜、C3-有機酸、C4-其他、C5-多糖、C6-總蛋白；P1-pH、P2-電導率、P3-、P4-*、P5-*、P6-黏度。

圖3 莪術(shù)-三棱藥對水煎液中已鑒定的化學成分結(jié)構(gòu)

表6 莪術(shù)-三棱藥對水煎液各類型化合物的相對峰面積

Table 6 Relative peak area of each type of compound in Curcumae Rhizoma-Sparganii Rhizoma decoction

編號相對峰面積二芳基庚烷類化合物倍半萜類化合物有機酸類化合物其他類 S1231.83 20.7624.6314.66 S2318.56 35.6115.6815.02 S3 18.83 26.7372.1228.46 S4216.40 75.6832.3014.95 S5235.67 18.6921.1213.09 S6205.29 12.2511.27 7.29 S7269.80 19.7320.1715.40 S8 33.94 32.6782.7545.44 S9 18.89 27.2012.4639.10 S10353.87 16.8227.2317.97 S11172.84 43.70 8.1110.07 S12226.31 23.8426.15 6.04 S13145.43 74.1032.3723.23 S14236.60 20.6117.5411.75 S15271.58 14.53 8.68 9.53 S16188.14 22.8222.63 7.52 S17 88.67 57.6914.32 4.11 S18174.71 37.6214.52 8.11 S19298.34 32.1724.6414.97 S20217.11 21.0912.90 7.27 S21142.00 19.7316.2110.30 S22104.87 30.7022.8711.79 S23315.97 40.3813.5811.64 S24276.92 17.8112.0911.51 S25219.13113.2229.12 9.52 S26153.37 21.8915.1612.68

2.4.2 Pearson相關(guān)系數(shù) 利用Origin 2018軟件計算物理參數(shù)和化學成分含量的Pearson相關(guān)系數(shù)，建立二者的相關(guān)性，結(jié)果見表7。

結(jié)果表明，總蛋白含量與溶液的物理參數(shù)pH值、電導率、色度和*以及黏度顯著相關(guān)，且與亮度呈負相關(guān)。但是其他數(shù)據(jù)顯示，二芳基庚烷類化合物與有機酸和其他類成分顯著相關(guān)；倍半萜類成分與總蛋白的含量顯著相關(guān)；有機酸類成分與其他類成分相關(guān)性高；電導率受溶液色度和黏度的影響；色度與黏度之間具有顯著相關(guān)性。

2.4.3 灰色關(guān)聯(lián)度 依據(jù)文獻方法[23]，分別以藥對水煎液中物理參數(shù)P1～P6為參考序列，化學成分C1～C6為比較序列，分辨系數(shù)取0.5。根據(jù)相對關(guān)聯(lián)度的大小，確定各化學成分對物理性質(zhì)貢獻的大小，結(jié)果見表8。

結(jié)果表明二芳基庚烷類化合物和總蛋白對溶液的pH值影響較大，而有機酸類成分對pH值的影響不大，推測是因為有機酸與其鹽形成了緩沖體系，導致pH值變化并不明顯。但是形成的緩沖體系的pH值影響了二芳基庚烷類成分的溶出，因此二者相關(guān)性明顯；結(jié)合Pearson相關(guān)系數(shù)可知，總蛋白、多糖和二芳基庚烷類化合物對電導率的影響較大，且二芳基庚烷類成分含量越高、電導率越低；二芳基庚烷類、有機酸類、其他類和總蛋白對亮度影響較大，結(jié)合Pearson相關(guān)系數(shù)可知，總蛋白的含量與亮度為負相關(guān)，而溶液的顏色與總蛋白含量均為正相關(guān)，此結(jié)果有待進一步分析原因；溶液中總蛋白含量越高，黏度越大，而二芳基庚烷類化合物越多，則溶液的黏度越小。

表7 物理參數(shù)和化學成分含量的Pearson相關(guān)系數(shù)

Table 7 Pearson correlation coefficient between physical parameters and chemical composition content

相關(guān)系數(shù)C1C2C3C4C5C6P1P2P3P4P5P6 C11.000 C2?0.1141.000 C3?0.464*0.1481.000 C4?0.514*?0.0060.683*1.000 C5?0.203?0.3520.1210.464*1.000 C6?0.1800.515*0.1180.005?0.1811.000 P10.1610.1550.0280.017?0.1870.457*1.000 P2?0.1820.097?0.0830.0670.2260.490*?0.1331.000 P30.209?0.0570.013?0.205?0.232?0.439*0.134?0.653*1.000 P4?0.2200.052?0.0540.1090.1940.396*?0.1760.546*?0.962*1.000 P5?0.1620.055?0.0430.2470.1700.298?0.2200.507*?0.924*0.853*1.000 P6?0.2670.2440.0300.075?0.0360.679*0.1120.776*?0.562*0.493*0.422*1.000

*在0.05水平下顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.8～1.0表示極強相關(guān)，0.6～0.8為強相關(guān)，0.4～0.6表示中等程度相關(guān)，0.2～0.4則為弱相關(guān)，0～0.2為極弱相關(guān)或無相關(guān)）

*Significant correlation at 0.05 level (correlation coefficient 0.8 to 1.0 indicates very strong correlation, 0.6 to 0.8 indicates strong correlation, 0.4 to 0.6 indicates moderate correlation, 0.2 to 0.4 indicates weak correlation, 0 to 0.2 indicates very weak correlation or no correlation)

表8 物理參數(shù)與化學成分灰色關(guān)聯(lián)度

Table 8 Grey correlation degree between physical parameters and chemical components

參考序列化學成分關(guān)聯(lián)度參考序列化學成分關(guān)聯(lián)度 P1C10.895 8P4C60.813 6 C60.864 4C50.801 1 C40.863 3C40.782 0 C30.862 4C30.770 2 C50.837 5C20.765 6 C20.809 4C10.763 5 P2C60.862 8P5C60.860 9 C50.843 1C40.850 2 C10.841 6C10.847 6 C40.834 6C50.833 9 C30.816 2C30.827 2 C20.801 5C20.796 1 P3C10.887 0P6C10.884 1 C30.849 6C60.861 6 C40.849 3C40.858 1 C60.845 7C30.855 1 C50.826 4C50.834 4 C20.805 2C20.817 5

2.4.4 前向逐步回歸法 利用R語言軟件，采用前向逐步回歸法，分別以物理參數(shù)P1～P6為因變量，化學成分C1～C6為自變量做相關(guān)性擬合，分析物理參數(shù)與化學成分的相關(guān)性。6個自變量會形成63種組合（C1、C1C2、C1C2C3等），并從中篩選與因變量相關(guān)性最高的組合進行擬合。方程中參數(shù)的斜率越大，表明相關(guān)性越強，調(diào)整決定系數(shù)（adj2）值越高說明方程的擬合效果越好，圖中顏色越深表示相關(guān)度越高。最終得到6個對P1～P6解釋度最高的方程，結(jié)果見圖4和表9。

圖4 C1～C6對P1～P6的相關(guān)性分析

表9 C1～C6對P1～P6相關(guān)性擬合方程

Table 9 Correlation fitting equation of C1—C6 to P1—P6

序號方程Radj2 1P1＝1.206＋0.012 4 C1＋5.758 C6－0.002 9 C1C5＋0.032 6 C5C3＋0.000 25 C1C5C4－0.002 C1C6C4＋0.007 16 C6C4C2－0.003 66 C6C5C2C30.754 2P2＝7.722－0.016 2 C1－0.524 C3＋0.749 C4－0.244 C2C6＋2.204 C3C6－3.560 C4C6－0.000 004 8 C1C3C2C6＋0.001 91 C1C4C2C60.807 3P3＝27.476＋0.3 C1＋0.085 1 C2C3－0.024 2 C1C5－0.000 2 C1C2C3－0.002 C2C3C4－0.003 C1C2C6－0.016 5 C1C4C6＋1.912 C4C5C60.724 4P4＝46.89－0.161 C1－0.555 C2－1.039 C4C5C6＋0.000 003 C1C2C3C4＋0.000 688 C1C2C4C6－0.004 03 C3C2C4C6＋0.001 37 C3C2C4C6C50.542 5P5＝168.833－0.578 C1－0.144 C2C3－0.058 C4C2＋0.000 374 C1C2C3＋0.003 34 C3C2C4＋0.002 56 C1C2C5－3.150 C6C2C5＋0.001 8 C1C2C4C60.732 6P6＝16.784－0.018 2 C3＋0.001 08 C2C4－0.2 C4C5＋0.002 42 C2C6－0.241 C6C4－0.000 008 C1C2C4－0.021 6 C6C4C5＋0.000 02 C1C2C4C50.662

由圖4和表9可知，總蛋白和二芳基庚烷類化合物的含量對pH值影響較大，與灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果一致。同時，多糖和有機酸類成分的組合與pH值的相關(guān)性也十分明顯，意味著多成分的共同作用展現(xiàn)出了各樣品pH值的差異；有機酸和其他類成分與電導率相關(guān)性高，意味著此類化合物的含量受溶液電導率的影響，提示在提取這些化合物時注意控制電導率；二芳基庚烷類化合物與溶液的亮度關(guān)系密切。同時，其他類成分、多糖和總蛋白組合對溶液亮度影響最大，呈正相關(guān)，即這幾類成分含量高時，溶液的亮度較大；倍半萜類化合物和二芳基庚烷類化合物對溶液的紅綠、黃藍色影響較大，可能與這2類成分自身的顏色有關(guān)；黏度受有機酸類成分的影響，推測酸性環(huán)境會改變蛋白的性質(zhì)，借此影響溶液的黏度。

綜合Pearson相關(guān)系數(shù)、灰色關(guān)聯(lián)度和前向逐步回歸法3種相關(guān)性分析結(jié)果可知，pH值與總蛋白、二芳基庚烷類化合物含量相關(guān)性較強，均為正相關(guān)；電導率與總蛋白、多糖含量的相關(guān)性較強，均為正相關(guān)；溶液亮度與總蛋白、二芳基庚烷類化合物含量關(guān)系密切，與總蛋白含量呈負相關(guān)、與二芳基庚烷類化合物含量呈正相關(guān)；總蛋白、倍半萜類和二芳基庚烷類化合物含量對溶液的紅綠、黃藍色影響較大；溶液黏度與總蛋白含量呈正相關(guān)。另外，二芳基庚烷類化合物幾乎出現(xiàn)在了前向逐步回歸擬合的每一個方程中，說明這類化合物與物理性質(zhì)的關(guān)系最為密切。

2.4.5 物理參數(shù)與化學成分含量的數(shù)學關(guān)系 “2.4.2”～“2.4.4”項的實驗結(jié)果表明，物理參數(shù)和化學成分之間具有一定的相關(guān)性，但是具體的數(shù)學關(guān)系尚不明確。采用“2.4.4”項下前向逐步回歸法，建立以物理參數(shù)為自變量、化學成分為因變量的數(shù)學模型。

數(shù)據(jù)集包含26組數(shù)據(jù)，每組包含6個自變量和1個因變量。訓練集與測試集劃分：將數(shù)據(jù)劃分為70%的訓練集和30%的測試集，分開存放。模型架構(gòu)：篩選自變量（6個自變量會形成63種組合（P1、P1P2、P1P2P3等）中與因變量（C1～C6）相關(guān)性最高的組合進行擬合，構(gòu)建物理參數(shù)預測化學成分含量的數(shù)學模型。利用訓練集建立模型，測試集驗證模型。圖中顏色越深表示相關(guān)度越高，adj2值越高說明方程的擬合效果越好。最終得到6個相關(guān)方程，結(jié)果見圖5和表10。

結(jié)果表明P1～P6對C3、C5、C6的擬合程度較好，即有機酸類、多糖和總蛋白的含量與其他6個物理參數(shù)的數(shù)學方程擬合度較高。P1～P6對C3（有機酸類）的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，溶液的電導率和溶液的黃藍色*值的乘積對有機酸類成分含量影響最大，其次是溶液的紅綠色*值。提示當溶液的電導率和黃藍色*的乘積較大時，溶液中具有較多的有機酸成分，而紅綠色*的大小正好相反；P1～P6對C5（多糖）的相關(guān)性分析可知，pH值和溶液紅綠色*的乘積對多糖含量影響較大；P1～P6對C6（總蛋白）的相關(guān)性分析表明，總蛋白含量受電導率和黏度單獨影響較大，也受pH值和溶液亮度乘積的影響，且均呈負相關(guān)。方程結(jié)果提示，通過測量上述物理參數(shù)，可以快速計算有機酸類成分、多糖、總蛋白含量，準確度較高。

圖5 P1～P6對C1～C6的相關(guān)性分析

表10 P1～P6對C1～C6相關(guān)性擬合方程

Table 10 Correlation fitting equation of P1—P6 to C1—C6

序號方程Radj2 1C1＝3 127.380－778.218 P3＋146.632 P1P3＋44.893 P3P6－8.531 P5P6－8.853 P1P6P3＋0.102 P3P5P6＋0.601 P1P2P4P5－0.002 21 P1P2P3P4P50.634 2C2＝30.374＋16 319.583 P4－190.460 P4P3－968.406 P4P6－5.086 P1P4P5＋11.296 P3P4P6＋0.063 2 P3P4P5－0.014 4 P1P2P3P4P5＋0.069 4 P1P2P6P4P50.353 3C3＝1 006.017－187.777 P4＋155.983 P5P2－0.065 3 P4P6－1.806 P2P3P5－0.032 2 P2P3P4P5－1.771 P1P2P5P6＋0.020 5 P1P6P3P2P5＋0.000 531 P1P6P3P4P5＋0.000 357 P1P2P6P4P5P30.776 4C4＝455.059－5.804 P1P5－4.807 P1P6－3.908 P4P6＋0.477 P1P5P6－0.008 18 P3P6P5＋0.005 71 P2P3P4P5＋0.007 90 P1P3P6P4－0.000 06 P1P2P6P4P5P30.638 5C5＝35.469＋6.352 P1P4－1.236 P2P5－0.411 P2P6－0.004 45 P1P3P6－0.397 P1P4P6＋0.073 8 P2P5P6＋0.000 89 P1P2P3P4＋0.000 902 P1P2P3P60.722 6C6＝76.791－0.305 P2－4.627 P6－0.178 P1P3－0.001 6 P2P3P4＋0.108 P1P3P6＋0.011 P2P4P6－0.002 73 P1P2P4P5＋0.000 079 4 P1P2P6P50.770

但是P1～P6對C1、C2、C4的擬合程度效果欠佳，即二芳基庚烷類化合物、倍半萜和其他類成分與物理參數(shù)的擬合程度低。但也可以通過物理參數(shù)的大小，對幾類化學成分的含量進行簡單的預測。P1～P6對C1（二芳基庚烷類化合物）的相關(guān)性分析表明該方程用來擬合實驗數(shù)據(jù)有一定的差距，但是從方程中可以發(fā)現(xiàn)，作為單獨因素影響C1，且斜率最大，表明其與C1的相關(guān)性強，即溶液的亮度與二芳基庚烷類呈現(xiàn)極高的負相關(guān)，提示當溶液的亮度比較高時，樣品中的二芳基庚烷類化合物含量偏低；P1～P6對C2（倍半萜）的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，P4出現(xiàn)在C2方程中的每一項中，且其斜率最大，表明溶液的紅綠色對倍半萜類成分的影響極大，二者呈正相關(guān)。提示當樣品溶液紅綠色*增大時，其倍半萜類成分偏多，且隨著成分含量的增加，溶液更靠近紅色，但是由于方程的adj2值偏小，說明該方程擬合的效果不好，因此不能作為評價標準。P1～P6對C4（其他類成分）的相關(guān)性分析可知，P1、P5和P6 3者的相互組合受其他類成分的影響，且呈負相關(guān)。即pH值、黃藍色*和黏度越小，其他類成分的含量越高。

3 討論

本研究采用的苯酚-硫酸法測定多糖含量及建立藥對水煎液HPLC指紋圖譜的色譜條件均為實驗優(yōu)化得到。苯酚-硫酸法考察了顯色溫度、時間，苯酚和濃硫酸用量等，方法學考察結(jié)果表明，該方法精密度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定可靠。HPLC指紋圖譜的色譜條件考察了流動相、流動相洗脫梯度、柱溫和體積流量等。

實驗測定了莪術(shù)-三棱藥對水煎液不同濃度稀釋液的物理參數(shù)（電導率、黏度、pH值和色度），結(jié)果發(fā)現(xiàn)電導率隨著濃度的下降而降低；三棱中的有機酸及其鹽形成緩沖體系，溶液的pH值隨溶液濃度變化較?。挥捎谒逡涸诩逯筮^程產(chǎn)生沉淀，對黏度的影響比較大，結(jié)果表現(xiàn)為黏度和溶液的濃度沒有明顯關(guān)系，提示黏度的測定需要在提取后盡快完成。由于受到藥材中二芳基庚烷類和倍半萜等成分的影響提取液呈現(xiàn)棕褐色，不同批次之間的樣品顏色差異明顯，肉眼可見。

莪術(shù)-三棱藥對水煎液多糖含量較高，質(zhì)量分數(shù)為0.217～3.104 mg/g。莪術(shù)多糖是莪術(shù)的活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等活性[24-25]，目前，雖然對三棱中的多糖成分研究較少，但是其苷類成分多具有減少血小板聚集、延緩血栓形成的作用[26]。提示今后的研究中應對該藥對的多糖予以更多的關(guān)注。實驗選擇考馬斯亮藍法作為蛋白質(zhì)含量測定方法，方法學考察結(jié)果表明該方法精密度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性強，可以作為測定莪術(shù)-三棱藥對水煎液中總蛋白含量的測定方法。實驗室前期針對莪術(shù)開展的系列研究中發(fā)現(xiàn)不同批次莪術(shù)化學成分存在差異[9,27-28]，且差異明顯，其他文獻也有相關(guān)報道。莪術(shù)與不同產(chǎn)地的三棱共煎后，增大了化學成分的多樣性和復雜性，并且加劇了成分之間的差異性，可能是各樣品相似度較低的主要原因。

本研究首次利用化學計量學方法對莪術(shù)-三棱藥對水煎液物理參數(shù)和多種化學成分含量進行相關(guān)性分析。利用R語言前向逐步回歸方法，首次建立莪術(shù)-三棱藥對水煎液的物理參數(shù)和化學成分含量的數(shù)學模型。結(jié)果表明有機酸類成分、多糖和總蛋白的含量與6個物理參數(shù)的數(shù)學方程擬合度較高（adj2＞0.72），可以作為快速分析該藥對化學成分含量的依據(jù)。樣品的含量測定過程復雜繁瑣，在對這幾類成分進行提取富集時，則可以通過測量提取液的物理參數(shù)，快速計算各時刻的化學成分含量，為中藥提取過程中的快速質(zhì)量控制提供參考。

Pearson相關(guān)系數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各因素間的相互影響較大，自變量之間的相互作用效應會影響結(jié)果。逐步回歸是在R語言的基礎上進行的，不斷剔除自變量，篩選最佳組合方式，但是部分方程的擬合度依舊不高。為了提高預測效果，后續(xù)研究會通過測定更多批次的相關(guān)數(shù)據(jù)，增大樣本量、減小誤差；測定更多的物理參數(shù)，擴大自變量范圍，包括表面張力、濁度、Zeta電位等，最終將化學成分和更多的特別是單獨變化的物理參數(shù)關(guān)聯(lián)起來；嘗試更多的化學計量學方法，探索更好、更合適的建模方法以得到更好的預測效果。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Correlation of physical parameters and chemical components of-decoction based on chemometrics

SHAN Dong-jie1, LUO Xiu-ming2, CHANG Yan-li1, LYU Fang1, YAO Jian-ling1, WEI Jing1, YU A-xiang1, DONG Ying1, ZHANG Yan3, SHE Gai-mei1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. National Engineering Technology Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine, Dong’e Ejiao Co., Ltd., Liaocheng 252200, China 3. Beijing Sihuan Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing 101113, China

Based on chemometrics, the correlation analysis between physical parameters and chemical components of Ezhu ()-Sanleng () decoction was conducted to explore the feasibility of using visual physical parameters to characterize chemical composition content.The physical parameters (conductivity, viscosity, pH value and chromaticity) of the-decoction were determined. The phenol-sulfuric acid method was used to determine the polysaccharide content of the decoction and coomassie bright blue method was used to determine the total protein content of the decoction. HPLC fingerprint was established and the chemical composition of the decoction was characterized by HPLC-MS/MS. The correlation between physical parameters and chemical composition was established by Pearson correlation coefficient, grey correlation degree and forward stepwise regression method. A mathematical model was established to predict chemical composition content by physical parameters.pH value was positively correlated with the contents of total protein and diarylheptanoids compounds of-decoction. The electrical conductivity was positively correlated with the contents of total protein and polysaccharide contents. The brightness of solution was closely related to the contents of total protein and diarylheptanoids compounds, with negative correlation with the former and positive correlation with the latter. The contents of total protein, sesquiterpenoids and diarylheptanoids compounds had great effect on the red-green and yellow-blue of the solution. Solution viscosity was positively correlated with the contents of total protein content. The content of organic acids, polysaccharides and total protein was well fitted to the mathematical equations of physical parameters, which could be used as a basis for the rapid analysis of the content of chemical components in-decoction.Through the chemometric analysis, the physical parameters of-decoction showed a good correlation with its chemical constituents, and the established mathematical model initially indicated that the chemical components content of decoction could be characterized by simple physical parameters.

medicine pair; physical parameters; total protein; polysaccharide; chemometrics; correlation

R283

A

0253 - 2670(2022)17 - 5363 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.013

2022-04-16

北京市科技計劃課題（Z201100005420005）

單東杰（1999—），女，碩士研究生，研究方向為中藥化學。E-mail: bucmshandongjie@163.com

折改梅（1976—），博士生導師，研究員，研究方向為中（民族）藥藥效成分和新藥創(chuàng)制研究。Tel: (010)53912129 E-mail: shegaimei@126.com

[責任編輯 潘明佳]