茶皂素穩(wěn)定的芹菜素納米乳制備及其體外釋放研究

張旭敏，謝 龍，趙雨芯，李芝蓓，李小芳

茶皂素穩(wěn)定的芹菜素納米乳制備及其體外釋放研究

張旭敏，謝 龍，趙雨芯，李芝蓓，李小芳*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

以茶皂素為天然乳化劑制備芹菜素納米乳液（AP-NE），并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性和體外釋放特性的考察，以期獲得新型綠色的納米制劑。采用高速剪切結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)制備AP-NE，以平均粒徑和多分散指數(shù)（PDI）為自變量，運(yùn)用總評(píng)歸一值（OD）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方并進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)最優(yōu)處方制備的AP-NE進(jìn)行理化性質(zhì)和體外釋放特性考察。優(yōu)化結(jié)果表明AP-NE的最優(yōu)制備處方為芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.40%、茶皂素質(zhì)量濃度2.0 mg/mL、油相用量（蓖麻油-辛癸酸甘油酯1∶3）3 mL；測(cè)得AP-NE的平均粒徑為（259.5±3.6）nm、PDI為0.103±0.005、ζ電位為（?35.81±0.42）mV、電導(dǎo)率為（88.60±1.00）μS/cm，pH為7.37±0.08，溶解度為（128.12±1.35）μg/mL，載藥量為（5.77±0.08）%，濁度為（99.45±1.69）cm?1（＝3）；經(jīng)染色法鑒別為O/W乳液，透射電子顯微鏡觀察乳滴不粘連，大小均一，呈圓球狀；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明AP-NE穩(wěn)定性良好；體外釋放研究表明AP-NE中芹菜素的釋放具有緩慢和持續(xù)的趨勢(shì)。以茶皂素作為乳化劑制備的納米乳可明顯提高芹菜素的溶解度和穩(wěn)定性，是一種潛在的可提高藥物有效性的新型納米制劑。

芹菜素；納米乳；茶皂素；高速剪切-高壓均質(zhì)技術(shù)；Box-Behnken效應(yīng)面法；理化性質(zhì)；穩(wěn)定性；體外釋放

芹菜素（apigenin），又稱芹黃素、洋芹素，是一種天然植物黃酮，大量存在于常見(jiàn)的水果和蔬菜中，例如橙子、柚子、芹菜、歐芹、洋蔥、百里香、薄荷、橄欖、甘菊和麥牙菜中，被認(rèn)為是一種具有抗炎、抗氧化和抗癌作用的生物活性類黃酮[1-4]。然而，由于芹菜素在水中溶解度低，最大溶解度為2.16 μg/mL，且腸通透性高，被歸為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（Biopharmaceutics Classification System，BCS）的II類藥物[5]，嚴(yán)重影響其口服生物利用度進(jìn)而影響其臨床療效的發(fā)揮。目前，為了改善芹菜素溶解度和生物利用度低的問(wèn)題，大量學(xué)者引入了多種新型的制劑，例如納米晶[6-7]、納米粒[8-9]、醇質(zhì)體[10]、膠束[11]、納米囊[12]、乳劑[13-14]，這些制劑存在載藥量低，加入大量合成輔料使安全性降低等問(wèn)題。

納米乳作為一種新型載體，其內(nèi)部同時(shí)存在親水和親油區(qū)域，可以形成牢固的油水界面膜，能顯著改善難溶性藥物的溶解性和生物利用度，為解決中藥難溶性有效成分和有效部位的成藥性問(wèn)題提供了新思路[15]。然而，合成類表面活性劑的加入給制劑臨床上的使用帶來(lái)了安全隱患，例如聚山梨酯-80會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)毒性、腎毒性或細(xì)胞毒性，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用[16]。

茶皂素分子是由疏水性的苷元和親水性的糖體以及有機(jī)酸3部分構(gòu)成，由于其糖體、有機(jī)酸及配基上的羥基是親水基團(tuán)，同時(shí)五元環(huán)配基主體為疏水基團(tuán)，因此，茶皂素可作為一種天然非離子型表面活性劑[17-18]，近年來(lái)已被應(yīng)用于多種研究[16,19-22]之中。本實(shí)驗(yàn)以天然表面活性劑茶皂素為乳化劑制備芹菜素納米乳（apigenin nanoemulsion，AP-NE），旨在提高芹菜素的溶解度和生物利用度，并探索茶皂素作為天然穩(wěn)定劑的可能。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；AH100D型高壓均質(zhì)機(jī)，加拿大ATS公司；NICOMP 380ZLS型激光粒度測(cè)定儀，美國(guó)PSS粒度儀公司；DDS-11C型電導(dǎo)率儀、pHs-2F pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；C25型實(shí)驗(yàn)室分散乳化均質(zhì)機(jī)，上海恒川機(jī)械設(shè)備有限公司；XMI9007-8型智能溫濕度儀，重慶英博實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；80-1型離心沉淀器，江蘇正基儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-6100型紫外分光光度儀，上海美譜達(dá)儀器有限公司；JEM 1200EX型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL公司。

1.2 材料

芹菜素對(duì)照品（批號(hào)MUST-21030615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.03%），成都曼斯特生物科技有限公司；芹菜素（批號(hào)GL20201223，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.30%）、茶皂素（批號(hào)GL20200429，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.31%），西安小草植物科技有限責(zé)任公司；辛癸酸甘油酯（CT，食品級(jí)）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM，日化級(jí)）、棕櫚酸異丙酯（PI，日化級(jí)），山東優(yōu)索化工科技有限公司；油酸、蓖麻油、甲醇，均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；油酸乙酯，批號(hào)20180926，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%～100.0%，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚山梨酯-80、磷酸（GR級(jí)），成都市科龍化工試劑廠；透析袋MD34-5m（截留相對(duì)分子質(zhì)量8000～14 000），成都諾舟生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 AP-NE的制備

采用高速剪切結(jié)合高壓均質(zhì)法制備AP-NE[23]。精密稱取處方量的芹菜素原料藥，加入油相，超聲使其充分混勻。另精密稱取處方量的茶皂素，加入去離子水，超聲使其充分溶解，作為水相。將水相轉(zhuǎn)入油相中，置于轉(zhuǎn)速為19 000 r/min的高速剪切機(jī)下進(jìn)行剪切2 min，制得粗乳液，將粗乳液在100 MPa壓力條件下進(jìn)行高壓均質(zhì)6次，即得AP-NE。

在不加原料藥的條件下，按AP-NE的制備方法制備，即得空白納米乳。

2.2 芹菜素的測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[4,8]進(jìn)行。

2.2.1 色譜條件[8]色譜柱為Comatex-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)337 nm；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（62∶38）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備[23]精密稱取芹菜素對(duì)照品5.32 mg，置于50 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解，超聲，定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為106.40 μg/mL的芹菜素對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取芹菜素納米乳液（AP-NE）1 mL，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲30 min破乳后，靜置10 min，用甲醇定容，用微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 乳液分層指數(shù)的計(jì)算

將制得的AP-NE裝于玻璃瓶中，室溫靜置，定時(shí)觀察分層、絮凝、沉淀等現(xiàn)象，記錄乳液層高度，計(jì)算乳液分層指數(shù)[23]。

分層指數(shù)＝1－H/0

H、0分別為、0時(shí)刻乳液層的高度

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化AP-NE處方

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在前期單因素試驗(yàn)[4]的基礎(chǔ)上，以芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1）、茶皂素質(zhì)量濃度（2）、油相用量（3）為影響因素，分別以AP-NE的平均粒徑（1）和PDI（2）的總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用3因素3水平的Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[24-25]。因素與水平及試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表1。由于2個(gè)指標(biāo)值均越小越好，因此選用公式OD＝(12…d)1/n以及d＝(max－Y)/(max－min)對(duì)OD值進(jìn)行計(jì)算。

2.4.2 數(shù)學(xué)模型擬合及分析 基于以上數(shù)據(jù)，使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)OD值進(jìn)行多元回歸二次多項(xiàng)式擬合，得到回歸方程OD＝0.83－0.0921＋0.0302＋0.0693＋0.19012＋0.20013＋0.01323－0.40012－0.05822－0.09432，2＝0.978 9，＜0.000 1。

方差分析結(jié)果（表2）表明該模型的值小于0.000 1，表明該模型有意義，可用于優(yōu)化AP-NE的制備工藝。回歸方程的擬合決定系數(shù)2為0.978 9＞0.95，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間存在高度的相關(guān)性，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其校正決定系數(shù)（adj2）＝0.951 8，表明模型響應(yīng)值的變化有95.18%來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)所選自變量，實(shí)驗(yàn)誤差較小，試驗(yàn)方法可靠。以上數(shù)據(jù)表明，該模型可用于預(yù)測(cè)和分析AP-NE的最佳制備工藝。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)擬合結(jié)果，繪制三維效應(yīng)曲線圖，預(yù)測(cè)AP-NE的最佳制備處方工藝，結(jié)果見(jiàn)圖1?；贐ox-Behnken響應(yīng)面，通過(guò)Design- Expert 8.0.6軟件預(yù)測(cè)優(yōu)化后的最優(yōu)處方為芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.40%，茶皂素質(zhì)量濃度2.04 mg/mL，油相用量為2.98 mL，最優(yōu)配方的OD預(yù)測(cè)值為0.842。為使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，優(yōu)化處方修改為AP質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.40%，茶皂素質(zhì)量濃度2.00 mg/mL，油相用量3.00 mL。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 1 Arrangement and results of response surface test

編號(hào)X1/%X2/(mg?mL?1)X3/mLY1/nmY2OD編號(hào)X1/%X2/(mg?mL?1)X3/mLY1/nmY2OD 10.30 (?1)1.75 (?1)2.40 (0)252.20.1980.597100.30 (?1)2.00 (0)0.60 (?1)282.70.1620.547 20.40 (0)2.25 (+1)0.60 (?1)294.80.1010.573110.50 (+1)1.75 (?1)2.40 (0)262.30.2890.000 30.40 (0)1.75 (?1)4.20 (+1)262.40.1230.750120.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)254.80.1290.778 40.30 (?1)2.00 (0)4.20 (+1)320.60.1290.263130.40 (0)1.75 (?1)0.60 (?1)272.90.1550.619 50.50 (+1)2.25 (+1)2.40 (0)302.10.0950.516140.50 (+1)2.00 (0)4.20 (+1)274.50.1910.522 60.30 (?1)2.25 (+1)2.40 (0)285.20.2300.363150.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)253.40.0930.869 70.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)251.70.1350.779160.40 (0)2.25 (+1)4.20 (+1)284.90.0350.756 80.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)260.00.0900.836170.50 (+1)2.00 (0)0.60 (?1)329.10.0880.000 90.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)252.30.0950.871

表2 OD回歸方程的方差分析

Table 2 Variance analysis of regression equation of OD

方差來(lái)源離差平方和自由度均方F值P值方差來(lái)源離差平方和自由度均方F值P值 模型1.17090.13036.08＜0.000 1X120.67010.670185.73＜0.000 1 X10.06710.06718.530.003 5X220.01410.0143.920.088 2 X27.293×10?317.293×10?32.020.198 6X320.03710.03710.270.015 0 X30.03810.03810.520.014 2殘差0.02573.617×10?3 X1X20.14010.14038.860.000 4失擬項(xiàng)0.01735.606×10?32.640.186 0 X1X30.16010.16044.920.000 3純誤差8.500×10?342.125×10?3 X2X36.611×10?416.611×10?40.180.681 8總離差1.20016

圖1 X1、X2、X3對(duì)OD值影響的效應(yīng)曲面圖

2.4.4 處方驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合既定的工藝參數(shù)，根據(jù)上述修正后的最佳處方，平行制備3批AP-NE，測(cè)得平均粒徑、PDI和OD值見(jiàn)下表3。各實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明采用總評(píng)歸一法得到的回歸方程預(yù)測(cè)性良好，處方的優(yōu)化較為理想。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)(, n = 3)

Table 3 Verification test (, n = 3)

批次粒徑/nmPDIOD值 1259.5±3.60.103±0.0050.811±0.003 2261.7±4.20.099±0.0040.807±0.007 3260.3±2.90.105±0.0030.802±0.006

2.5 理化性質(zhì)考察

2.5.1 AP-NE類型的鑒別（染色法） 利用油溶性染料蘇丹Ⅲ（紅色）和水溶性染料亞甲基藍(lán)（藍(lán)色）在納米乳中擴(kuò)散的快慢來(lái)判斷納米乳的類型[26-27]。取等量的AP-NE于2支試管中，分別加入適量且等量的亞甲基藍(lán)和蘇丹III，結(jié)果顯示，亞甲基藍(lán)在AP-NE中的擴(kuò)散速度快于蘇丹III，表明AP-NE為O/W型納米乳。

2.5.2 AP-NE的微觀形貌 取適量納米乳，用蒸餾水稀釋至適當(dāng)濃度，滴于覆有支撐膜的銅網(wǎng)上。靜置10 min后，用濾紙吸去多余的液體，然后加入3%磷鎢酸溶液（pH 7.0）負(fù)染90 s，再用濾紙吸去多余的液體。自然蒸發(fā)后，用TEM分別在100 nm和200 nm的尺寸下觀察AP-NE的微觀形貌，結(jié)果見(jiàn)圖2，AP-NE呈圓球形，大小均勻，乳滴之間無(wú)粘連，成型性好。

2.5.3 溶解度的測(cè)定 采用HPLC法測(cè)得AP-NE中芹菜素的溶解度為（128.12±1.35）μg/mL，與未加乳化劑的陰性對(duì)照納米乳的溶解度（34.81±0.25）μg/mL相比，增加了2.68倍；AP-NE平均載藥量為（5.77±0.08）%，包封率為（91.32±0.93）%（＝3）。

圖2 AP-NE的TEM圖

2.5.4 pH值的測(cè)定 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，室溫下采用pH計(jì)測(cè)定其pH值，重復(fù)3次，求平均值，結(jié)果為7.37±0.07（＝3）。

2.5.5 電導(dǎo)率的測(cè)定 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，室溫下采用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率，重復(fù)3次，求平均值，結(jié)果為（88.60±1.14）μS/cm（＝3）。

2.5.6 ζ電位的測(cè)定 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定其ζ電位，重復(fù)3次，求平均值，結(jié)果為（?35.81±0.38）mV（＝3）。

2.5.7 濁度的測(cè)定[28]按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，精密吸取適量的納米乳于50 mL量瓶中，用去離子水稀釋1000倍，采用紫外分光光度法在680 nm下測(cè)定其透光率，重復(fù)3次，求平均值，光程長(zhǎng)為1 cm，根據(jù)公式計(jì)算得其濁度為（99.45±1.69）cm?1（＝3）。

＝/ln(0/)＝/ln(1/)

為濁度，為光程長(zhǎng)，為稀釋倍數(shù)，0為光透過(guò)參比測(cè)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度，為光透過(guò)被測(cè)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度，為透光率

2.6 離心穩(wěn)定性考察

按最佳制備工藝制備2組新鮮的AP-NE，I組為加了乳化劑茶皂素的納米乳液，II組為不加乳化劑茶皂素的納米乳液。室溫下精密吸取8 mL于離心管中，在4000 r/min下離心60 min，觀察納米乳的外觀形態(tài)，以離心前、后吸光度（）值的變化表征其離心穩(wěn)定性，計(jì)算離心穩(wěn)定常數(shù)（）[29]。

2.6.1 外觀 離心結(jié)果顯示AP-NE仍為乳白色均一狀態(tài)，未發(fā)生聚集、凝結(jié)、相分離和破乳現(xiàn)象，表明AP-NE穩(wěn)定性良好。

2.6.2值的計(jì)算 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，于離心前測(cè)定乳液的值記為0，離心后測(cè)定上清液的值記為1，平行測(cè)定3次。根據(jù)公式＝1/0計(jì)算值，值越大，表明離心穩(wěn)定性越好。離心穩(wěn)定性結(jié)果如表4所示，I組離心穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于II組，表明AP-NE在上述離心條件下含量、性質(zhì)保持穩(wěn)定，離心穩(wěn)定性良好，且乳化劑茶皂素可以提高納米乳的穩(wěn)定性。

表4 離心穩(wěn)定性結(jié)果(, n = 3)

Table 4 Results of centrifugal stability (, n = 3)

組別A0A1K/% I0.479±0.0010.465±0.00197.08 II0.352±0.0010.256±0.00072.73

2.7 溫度和光照穩(wěn)定性考察

分別制備2組AP-NE，I組為以最佳工藝制備的AP-NE，II組為不加乳化劑茶皂素制備的AP-NE，分別于4、25、60 ℃，（4500±500）lx的藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中放置20 d以上，分別在第0、5、10、15、20天進(jìn)行取樣考察，分析在不同溫度和光照條件下乳劑粒徑、PDI、濁度、含量變化率、乳液分層指數(shù)等參數(shù)變化。

表5顯示了從納米乳液分層指數(shù)變化角度的穩(wěn)定性結(jié)果。可以明顯看出，I組和II組納米乳在60 ℃保存20 d后分層指數(shù)明顯增加，分別達(dá)到2.86%、14.26%，且2組納米乳在儲(chǔ)存20 d后分層指數(shù)變化趨勢(shì)均為60 ℃＞25 ℃＞強(qiáng)光＞4 ℃。另外，I組納米乳在強(qiáng)光照射條件下穩(wěn)定性較好。

表5 不同溫度和強(qiáng)光對(duì)AP-NE的分層指數(shù)的影響(, n = 3)

Table 5 Effects of different temperature and bright light on stratified index of AP-NE (, n = 3)

t/dI組分層指數(shù)/%II組分層指數(shù)/% 4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光 000000000 5000.220.160.751.472.141.91 100.811.321.710.741.181.853.973.87 150.911.762.111.304.866.8611.438.21 201.691.942.861.798.5212.0514.2610.95

表6、7分別展示了不同環(huán)境分別對(duì)2組納米乳液粒徑、濁度和含量變化率的影響。溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，在粒徑方面上，除60 ℃外，I組納米乳液在不同環(huán)境脅迫下在260 nm左右穩(wěn)定20 d。這可能與ζ電位相對(duì)較高且恒定的絕對(duì)值密切相關(guān)，從而導(dǎo)致強(qiáng)烈的靜電排斥以維持系統(tǒng)的穩(wěn)定性；而II組粒徑呈現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中60 ℃組增長(zhǎng)最為明顯，在20 d后粒徑增長(zhǎng)率達(dá)到26.67%，這是因?yàn)榧{米乳液為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速率逐漸加快，增大了粒子間相互碰撞的幾率，從而使粒徑加大，而茶皂素可以有效緩解高溫所致的聚集現(xiàn)象的發(fā)生。

表6 不同溫度和強(qiáng)光對(duì)I組(含茶皂素)AP-NE穩(wěn)定性的影響(, n = 3)

Table 6 Effects of different temperature and bright light on stability of AP-NE (I) (, n = 3)

t/d粒徑/nm濁度/cm?1含量變化率/% 4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光 0259.0259.7259.2259.499.82100.93103.2199.820000 5260.7259.8263.9263.691.02124.43118.7896.515.972.5117.552.18 10261.3261.1265.5261.788.83116.53103.14115.418.815.4523.2610.22 15261.7261.4268.8269.697.61114.29107.59125.0312.6715.5939.3312.29 20262.9264.2277.5267.493.21123.30140.41123.3017.2618.5940.8310.28

表7 不同溫度和強(qiáng)光對(duì)II組(不含茶皂素)AP-NE穩(wěn)定性的影響(, n = 3)

Table 7 Effects of different temperature and bright light on stability of AP-NE (II) (, n = 3)

t/d粒徑/nm濁度/cm?1含量變化率/% 4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光4 ℃25 ℃60 ℃強(qiáng)光 0414.7416.0422.2419.6270.50271.81271.81270.500000 5416.2418.3432.6420.7301.11310.61316.08313.346.978.2221.947.62 10420.6420.5456.7435.3343.90350.98350.98348.1434.7338.0151.2742.36 15421.2425.4480.0440.9279.71265.27251.03262.6652.4760.2869.1956.35 20456.9461.2534.8471.2218.16221.89194.80219.4067.3065.5973.0762.54

濁度方面，由表6可以看出，I組納米乳在4 ℃和25 ℃條件下，納米乳液的濁度沒(méi)有隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生顯著變化，而60 ℃組納米乳液的濁度呈逐漸增加的趨勢(shì)，特別是存放20 d后，濁度增長(zhǎng)速度達(dá)到34.55%。這可能是由于在高溫條件下較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)導(dǎo)致乳化劑親水端的脫水和較低的界面張力，導(dǎo)致顆粒聚集增加，乳液體系渾濁，最終導(dǎo)致渾濁度增加。

此外，表面活性劑脫水降低了油滴之間的空間排斥，從而使油滴更靠近并聚結(jié)[30]；而II組納米乳各條件下濁度均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榧{米乳在儲(chǔ)存初期由于不存在乳化劑，粒子間相互碰撞聚集，導(dǎo)致乳液體系變渾濁，濁度增大，繼續(xù)放置儲(chǔ)存，乳液因分層沉降從而使透明度增大，濁度降低。此外，含量變化率越低，穩(wěn)定性越好。2組納米乳在60 ℃下儲(chǔ)存20 d后芹菜素含量的變化率均遠(yuǎn)高于4 ℃和25 ℃條件下的變化率，且II組納米乳在各條件下儲(chǔ)存15 d后含量變化率均達(dá)到50%以上。綜上所述，溫度穩(wěn)定性測(cè)試表明，I組納米乳在各項(xiàng)條件下的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于II組，表明茶皂素可以在一定程度上起到穩(wěn)定納米乳液的作用，且納米乳液最好在25 ℃以下保存。另外，茶皂素乳化的納米乳液在強(qiáng)光條件下，考察期間各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化，說(shuō)明該納米乳液體系在該條件下較為穩(wěn)定。

2.8 短期儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察

按優(yōu)化后的處方平行制備3批新鮮的AP-NE，乳劑室溫保存40 d，分別在第0、5、10、15、20、25、30、35、40天進(jìn)行取樣考察，以粒徑、PDI、濁度、ζ電位和乳液分層指數(shù)等指標(biāo)評(píng)價(jià)其短期穩(wěn)定性。40 d短期穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果如表8所示。結(jié)果表明，40 d內(nèi)茶皂素乳化的AP-NE具有良好的穩(wěn)定性，在40 d的儲(chǔ)存期內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的分層、絮凝、聚集等不穩(wěn)定現(xiàn)象。粒徑和濁度分別保持在260 nm和105 cm?1左右，而PDI始終在0.09～0.15波動(dòng)。

此外，ζ電位大致表征了乳液顆粒的表面電荷。高絕對(duì)值會(huì)導(dǎo)致粒子之間的排斥力，這可能會(huì)提高多相系統(tǒng)的物理穩(wěn)定性[31]。ζ電位的絕對(duì)值較高，維持在33 mV左右，這可能是納米乳液體系穩(wěn)定的重要原因。

表8 AP-NE在40d內(nèi)的粒徑、PDI、ζ電位和濁度的變化(, n = 3)

Table 8 Changes in particle size, PDI, ζ potential and turbidity of AP-NE within 40 d (, n = 3)

t/d粒徑PDIζ電位/mV濁度/cm?1 0259.80.105?35.97106.51 5255.00.122?32.22102.05 10260.20.095?32.95108.78 15261.90.101?34.50103.53 20266.80.145?32.19108.97 25260.40.128?27.08108.97 30258.60.142?29.41105.56 35266.00.106?32.50109.91 40263.00.143?32.55109.26

2.9 體外釋放度考察

精密吸取AP-NE 5 mL，置于預(yù)先處理好的透析袋中，透析袋兩端用夾子固定，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）和1%聚山梨酯-80用作釋放介質(zhì)，然后放入裝有50 mL釋放介質(zhì)的燒杯中，透析袋完全沒(méi)入液面以下，同時(shí)以芹菜素對(duì)照品溶液作為對(duì)照。在37 ℃的環(huán)境溫度下，將其在恒溫?fù)u床中以100 r/min的恒定速度攪拌3 d。分別于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24、36、48、60、72 h末從燒杯中取出2 mL透析液，并補(bǔ)充等溫等量的新鮮透析介質(zhì)保持水槽狀態(tài)，樣品經(jīng)微孔濾膜濾過(guò)后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定芹菜素的質(zhì)量濃度，根據(jù)下式計(jì)算芹菜素的累積釋放率并繪制累積釋放曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

使用動(dòng)力學(xué)模型分析納米乳中藥物的釋放數(shù)據(jù)，動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表9。

圖3 對(duì)照品溶液和AP-NE中AP在含有1%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中的累積釋放率(, n = 3)

表9 AP-NE釋放研究中芹菜素的動(dòng)力學(xué)模型

Table 9 Kinetic model of apigenin in AP-NE release studies

擬合模型方程R2 零級(jí)動(dòng)力學(xué)Q＝0.760 t＋15.4050.807 一級(jí)動(dòng)力學(xué)lnQ＝54.616－0.093 t0.933 HiguchiQ＝7.273 t1/2＋4.0620.940 Ritger-PeppaslnQ＝0.402 lnt＋11.3500.955

Q＝(0C＋C)/

Q為藥物不同時(shí)刻的累積釋放率，為不同時(shí)刻，0為釋放介質(zhì)的總體積，C為不同時(shí)刻測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度，為每次取樣體積，為投入藥物總質(zhì)量

從圖3中可以清楚地看出，與AP-NE相比，對(duì)照品溶液中芹菜素的釋放速度要快得多。在前12 h內(nèi)，（73.94±1.58）%的芹菜素從游離溶液中釋放出來(lái)，而（41.25±0.46）%的芹菜素從AP-NE中釋放出來(lái)。該成分從納米乳中緩慢釋放可能是由于茶皂素穩(wěn)定的AP-NE的強(qiáng)包封作用，它為模擬胃腸道條件下的藥物提供了保護(hù)屏障。

從表9中可觀察到，與零級(jí)釋放模型（2＝0.807）相比，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型具有更好的擬合（2＝0.933），這表明納米乳液的藥物釋放過(guò)程取決于濃度。Higuchi和Ritger-Peppas模型很好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)在0.940～0.955，表明藥物從納米乳液中的釋放涉及多種機(jī)制，例如指數(shù)（）小于0.5的菲克釋放機(jī)制[32]。從該釋放研究中發(fā)現(xiàn)，茶皂素穩(wěn)定的AP-NE中的芹菜素遵循緩釋模式，可以在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮治療作用。

3 討論

根據(jù)能量獲得方式的不同將制備納米乳的方法分為高能乳化法和低能乳化法[33]，本實(shí)驗(yàn)著眼于采用高能乳化法，即高速剪切結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)，以天然表面活性劑茶皂素為乳化劑制備AP-NE，以期改善芹菜素的溶解度，克服其口服利用度低和給藥不穩(wěn)定的問(wèn)題，并探究茶皂素作為天然乳化劑形成和穩(wěn)定芹菜素納米乳的潛力。研究表明AP-NE中芹菜素的溶解度為（128.12±1.35）μg/mL，與芹菜素在水中的溶解度2.16 μg/mL相比，增加了58.31倍；與未加乳化劑的陰性對(duì)照納米乳的溶解度（34.81±0.25）μg/mL相比，增加了2.68倍。此外，體外釋放試驗(yàn)表明AP-NE可有助于改善芹菜素的口服生物利用度。

溫度和光照穩(wěn)定性試驗(yàn)中，在強(qiáng)光條件以及不同的溫度條件下，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，I組的各項(xiàng)指標(biāo)都在不同程度上優(yōu)于II組，表明茶皂素可以在一定程度上起到穩(wěn)定納米乳液的作用。I組中，光照穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，在強(qiáng)光照射（4500±500）lx條件下AP-NE含量和性質(zhì)保持穩(wěn)定；溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，高溫60 ℃導(dǎo)致乳液分層指數(shù)、濁度和含量變化率發(fā)生明顯的增長(zhǎng)，而溫度低于25 ℃組指標(biāo)均無(wú)明顯的變化，說(shuō)明納米乳液最好在25 ℃以下保存。另外，茶皂素穩(wěn)定的納米乳液在40 d內(nèi)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。

總體而言，本研究揭示了茶皂素作為天然乳化劑形成納米乳來(lái)包封水不溶性藥物芹菜素的可能性，但茶皂素的安全性和生物相容性，以及制劑的安全性和體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)仍需進(jìn)一步開(kāi)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andrelease of tea saponin-stabilized apigenin nanoemulsion

ZHANG Xu-min, XIE Long, ZHAO Yu-xin, LI Zhi-bei, LI Xiao-fang

Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Key Laboratory of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province, Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology, College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To prepare apigenin nanoemulsion (AP-NE) with tea saponin as natural emulsifier, and investigate its stability and release characteristics, in order to obtain a new green nano-formulation.AP-NE was prepared by high-speed shearing combined with high-pressure homogenization technology. The average particle size and polydispersity index (PDI) were used as independent variables, and the data were processed by the overall desirability value (OD) method. The formulation was optimized and verified by Box-Behnken effect surface method, and the physicochemical properties andrelease characteristics of AP-NE prepared with the optimal formulation were investigated.The optimal prescription of AP-NE was as follows: apigenin at a concentration of 0.40%, tea saponin at a concentration of 2.0 mg/mL, oil phase (castor oil: caprylic capric triglyceride＝1:3) in an amount of 3 mL; The measured average particle size of AP-NE was (259.5 ± 3.6) nm, PDI was 0.103 ± 0.005, ζ potential was (?35.81 ± 0.42) mV, conductivity was (88.60 ± 1.00) μS/cm, and pH was 7.37 ± 0.08, solubility was (128.12 ± 1.35) μg/mL, drug loading was (5.77 ± 0.08)%, turbidity was (99.45 ± 1.69) cm?1(= 3); it was identified as O/W emulsion by staining method, TEM observed that the milk droplets were non-adherent, uniform in size and spherical; stability test showed that AP-NE had good stability;release study showed that the release of apigenin from AP-NE had a slow and continuous trend.Nanoemulsion prepared with tea saponin as emulsifier can greatly improve the solubility and stability of apigenin, and it is a potential new nano-formulation that can improve drug effectiveness.

apigenin; nanoemulsion; tea saponin; high-speed shear-high pressure homogenization technology; Box-Behnken effect surface method; physicochemical properties; stability;release

R283.6

A

0253 - 2670(2022)17 - 5348 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.011

2022-03-15

四川省科技廳科研項(xiàng)目（CN）（2020095）；四川省科技廳科研項(xiàng)目（2019YFS0113）

張旭敏（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬?、新制劑、新技術(shù)。Tel: 18328757648 E-mail: zhangxumin97@stu.cdutcm.edu.cn

李小芳（1964—），女，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬?、新制劑、新技術(shù)。Tel: 13808195110 E-mail: lixiaofang@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]