蘇州地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌病病原學(xué)流行特征分析

劉佳 肖玉梅 曾令武 張耀剛 包紫薇 吳妹英

江蘇省蘇州市第五人民醫(yī)院，蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院肺科，蘇州 210000

由于艾滋病的流行、人口老齡化、環(huán)境問(wèn)題和免疫抑制劑的使用等相關(guān)因素的影響， 近年來(lái)非結(jié)核分枝桿菌（NTM）致病率越來(lái)越高，在很多國(guó)家和地區(qū)已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-3]。NTM 病診斷困難且耐藥率高[2,4]，導(dǎo)致診療難度加大。目前常規(guī)運(yùn)用分枝桿菌培養(yǎng)法檢測(cè)NTM，雖然檢測(cè)費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，容易造成患者失訪，導(dǎo)致治療延誤。 隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，全基因測(cè)序可以快速檢測(cè)和鑒定NTM[5]，已被越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床， 成為鑒定NTM 的另一項(xiàng) “金標(biāo)準(zhǔn)”[2,6-7]。 本研究利用第二代全基因測(cè)序法來(lái)分析蘇州地區(qū)NTM 病的菌種分布及流行趨勢(shì)，并通過(guò)基因進(jìn)化樹(shù)研究NTM 病是否存在人際間傳染的可能， 為今后合理地診療NTM 病提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集 2014年 1月至 2019年 1月就診于蘇州市第五人民醫(yī)院診斷為NTM 病患者信息， 包括性別、年齡、居住地、職業(yè)等，同時(shí)收集患者痰、肺泡灌洗液、腦脊液、尿沉渣、胸腹水等樣本，所有樣本均經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)提示陽(yáng)性，同一患者相同樣本來(lái)源僅選取1 株。 另選取1例患者不同時(shí)期2 株菌株用于基因進(jìn)化樹(shù)中比對(duì)分析。 本研究通過(guò)蘇州市第五人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) [倫理審批號(hào)：(2021)院倫理審字（012）號(hào)]。

二、研究方法

1.分枝桿菌培養(yǎng)

在樣本瓶里加入等量的4%氫氧化鈉（NaOH）處理液，混勻；取5 mL 處理后樣本置入50 mL 已標(biāo)記的離心管中，放入振蕩器上強(qiáng)力渦旋振蕩30 min，混勻；在離心管中加入pH 6.8 PBS 緩沖液至40 mL后離心15 min，相對(duì)離心力2 572×g；倒去上清液，加入 1~2 mL 的 PBS 緩沖液，中和 pH 至 6.8。 樣本接種前， 在BBL MGIL 培養(yǎng)管中先加入營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)混合添加劑0.8 mL，抽取0.5 mL 已處理樣本注入MGIT 培養(yǎng)管中，將接種好的MGIT 培養(yǎng)管放入BACTEC MGIT 960 Tb 全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏儀（美國(guó)BD 公司）中培養(yǎng)。

2. DNA 提取及測(cè)序

使用核酸提取試劑盒進(jìn)行各類(lèi)樣本中DNA 的提?。绹?guó)BD 公司MGIT 960 型全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)儀），并進(jìn)行擴(kuò)增（杭州博日科技有限公司PCR 擴(kuò)增儀）。

將提取的DNA 外送行全基因測(cè)序 （杭州迪安檢測(cè)公司）， 具體方法如下：（1） 將 DNA 打斷成約400 bp 大小的片段， 在DNA 片段兩段加上一定序列的接頭，PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)的富集，Qubit 對(duì)純化后的文庫(kù)濃度進(jìn)行檢測(cè)， 用Agilent420 檢測(cè)文庫(kù)片段大小， 用 Q-PCR 檢測(cè)文庫(kù)的摩爾濃度；（2）用NaOH 進(jìn)行 DNA 文庫(kù)的變性， 產(chǎn)生 DNA 單鏈，用HT1 緩沖液將變性后的文庫(kù)進(jìn)行稀釋至上機(jī)濃度；（3）IlluminaRNextseq 測(cè)序儀 （美國(guó) Illumina 公司）進(jìn)行測(cè)序。

3. 全基因組共線性分析

對(duì)2 組同源性100%的菌株進(jìn)一步行全基因組共線分析。使用MUMmer 軟件（Version 3.23）進(jìn)行菌株比對(duì)，確定基因組間的大范圍共線性關(guān)系，共線范圍大，親緣性更近。 使用 LASTZ（Version 1.03.54）對(duì)區(qū)域間進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)局部位置排列關(guān)系，并從中查找易位、倒置、易位+倒置的區(qū)域，菌株間發(fā)生更少的易位、倒置，進(jìn)化關(guān)系尺度更小。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用描述性流行病學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用表示， 計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)、株數(shù)和率表示。

結(jié) 果

一、流行特征

共收集到NTM 病患者67例，其中2014—2018年64例。2014—2018年不同年份NTM 病的分布情況詳見(jiàn)表1，表中可見(jiàn)檢出數(shù)逐年增多，總體上女性多于男性，農(nóng)村多于城市，職員發(fā)病率較少，基礎(chǔ)疾病以合并糖尿病較常見(jiàn)。

表1 蘇州地區(qū)2014—2018年非結(jié)核分枝桿菌病患者分布情況（n=64）

二、不同檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比

67 株NTM 菌株均采用全基因測(cè)序法檢測(cè)、傳統(tǒng)分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)合PCR 芯片技術(shù)檢測(cè)。全基因測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果有胞內(nèi)分枝桿菌38 株（56.7%），堪薩斯分枝桿菌 13 株 （19.4%）， 膿腫分枝桿菌 10 株（14.9%），鳥(niǎo)分枝桿菌 5 株（7.5%），草分枝桿菌 1 株（1.5%）。 傳統(tǒng)檢測(cè)法顯示有59 株菌種與全基因測(cè)序法一致，另有8 株結(jié)果不同，全基因測(cè)序法與傳統(tǒng)檢驗(yàn)法的診斷一致率達(dá)88.06%（59/67）。

三、基因進(jìn)化樹(shù)分析

68 株（含 1例患者不同時(shí)期 2 株菌株）NTM 菌株基因進(jìn)化樹(shù)分析見(jiàn)圖1。 圖1 顯示有2 組菌株同源性均為100%，分別是SZWY1 和SZWY2（同一患者不同時(shí)期菌株）、SZWY5 和SZWY65（不同患者菌株）； 堪薩斯分枝桿菌菌株間的同源性高于胞內(nèi)分枝桿菌菌株間、鳥(niǎo)分枝桿菌菌株間、膿腫分枝桿菌菌株間的同源性。

圖1 68 株非結(jié)核分枝桿菌菌株基因進(jìn)化樹(shù)

對(duì)2 組同源性100%的菌株進(jìn)行全基因組共線分析發(fā)現(xiàn)：SZWY1 和SZWY2 的共線性范圍明顯大于SZWY5 和SZWY65，且兩組的變異均以易位基因?yàn)橹鳌?同一患者的共線范圍大于不同患者，親緣性更近，菌株間發(fā)生更少的易位、倒置，進(jìn)化關(guān)系尺度更小，保留更多的保守區(qū)域，同一患者體內(nèi)不同時(shí)期的菌株，更支持內(nèi)源性復(fù)燃。

討 論

NTM 具有地域性分布特征，好發(fā)于我國(guó)南方沿海地區(qū)[8-9]，據(jù)報(bào)道我國(guó)華北、東北地區(qū)NTM 菌株以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌為主[8]。 本研究統(tǒng)計(jì)共發(fā)現(xiàn)蘇州地區(qū)有5 種NTM 菌種： 分別為胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、草分枝桿菌，以胞內(nèi)分枝桿菌為主，與既往本地區(qū)研究結(jié)果一致[8]。

目前尚無(wú)研究支持NTM 人與人之間具有傳染性。 本研究利用全基因測(cè)序結(jié)果，構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)分枝桿菌菌株間、鳥(niǎo)分枝桿菌菌株間、膿腫分枝桿菌菌株間同源性總體偏低，暫不支持人際傳播，但本文發(fā)現(xiàn)堪薩斯分枝桿菌菌株之間同源性總體偏高， 不排除有傳染性可能。 同一患者相隔2年提供的菌株分析顯示，NTM 在人體內(nèi)的變異較慢，考慮內(nèi)源性復(fù)燃。 另外發(fā)現(xiàn)2 株菌株同源性為100%， 查閱2 株菌株來(lái)源患者的臨床資料， 顯示SZWY5 株來(lái)源患者為男性，60歲， 蘇州園區(qū)人，無(wú)業(yè)，SZWY65 株來(lái)源患者為女性，74歲，蘇州相城區(qū)人，農(nóng)民，患者間無(wú)親屬關(guān)系，無(wú)明確接觸史，有待搜集更多的臨床資料做進(jìn)一步驗(yàn)證。 本文共線性分析說(shuō)明同一患者不同菌株和不同患者不同菌株同源性雖為100%，但共線性范圍不同，同一患者比不同患者的親緣性更近。

綜上，隨著近來(lái)對(duì)NTM 的重視，全基因測(cè)序法將會(huì)越來(lái)越多地用于NTM 的診療，NTM 患者的遺傳學(xué)信息和基因變異信息也將趨于明朗[9]，以期為今后的臨床診療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉佳、吳妹英：直接參與、文章撰寫(xiě)、工作支持；肖玉梅、曾令武：文章撰寫(xiě)、工作支持；張耀剛：直接參與；包紫薇：直接參與、工作支持