表達(dá)人CD137 配體重組腺病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤免疫作用的研究

吳潔 張柯欣 安彤 李思奇 朱赟 陳剛 莊昉成 高孟

杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院，杭州 310053

CD137 配體（CD137L），又名 4-1BBL，屬于 TNF超家族成員，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，以延伸的三葉樣螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)揮其生物學(xué)功能。它作為CD137 的高親和力配體，表達(dá)于巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC 和多種腫瘤細(xì)胞等活化的APC 表面[1]。 作為一對重要的共刺激分子，CD137L 與CD137 通過在免疫細(xì)胞間傳遞活化、增殖或者凋亡信號來調(diào)節(jié)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[2]。 CD137L 與其受體結(jié)合，可啟動雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：正向信號可刺激T 細(xì)胞活化和增殖，反向信號可刺激B 細(xì)胞增殖[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，CD137L 及其受體在正常組織及炎癥中表達(dá)不顯著，而在腫瘤組織中呈現(xiàn)高水平表達(dá)， 這種表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生、惡化存在一定的相關(guān)性[6-8]。因此，以CD137L 與其受體結(jié)合作為靶點(diǎn)開展相關(guān)研究已成為當(dāng)前抗腫瘤免疫研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。 本研究擬采用重組技術(shù)用腺病毒表達(dá)人的CD137L， 并探索該重組腺病毒在小鼠模型中的抗腫瘤免疫效果，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料及儀器

HEK293 細(xì)胞和TC-1 腫瘤細(xì)胞均購自美國菌毒種庫保管中心（ATCC），由杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院（病毒病所）建庫保存；DMEM 液體培養(yǎng)基、 胰蛋白酶、 胎牛血清， 購自 GIBCO 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛公司；PCR反應(yīng)試劑套盒、 兔抗羊-HRP 酶標(biāo)抗體、 兔抗羊-FITC、ECL 顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)；CD137L特異性單抗（sc-11817）購自英國SantaCruz 公司；小鼠特異性IFN-γ ELISPOT kit 購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；CD137L 重疊多肽庫由南京金斯瑞公司合成；PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司合成；SOURCE 30Q 和 Sepharose 4FF 購自 Cytiva 公司；SPF 級C57bl/6 小鼠在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)[SYXK（浙）2018-0012]。

主要儀器包括SANYO 細(xì)胞培養(yǎng)箱、Olympus 免疫熒光顯微鏡、BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)。

二、重組腺病毒的構(gòu)建

委托北京中美泰和生物技術(shù)有限公司對CD137L 氨基酸序列 （Genebank No. NP_003802.1）進(jìn)行表達(dá)密碼子優(yōu)化，使其能在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)， 所得優(yōu)化后的核苷酸序列通過人工合成，以 Mlu Ⅰ和 Hind Ⅲ兩個限制性酶切位點(diǎn)插入pDC316 質(zhì)粒中，獲得pDC316-CD137L 重組穿梭質(zhì)粒。 用BglⅡ限制性內(nèi)切酶對pDC316-CD137L 重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行線性化， 并與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1,3Cre 一 起 ， 在 脂 質(zhì) 體 Lipofectamine 2000 作用下共同轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞單層細(xì)胞，培養(yǎng)所得病毒原液再經(jīng)過3 次挑板純化，即得所需Ad5-CD137L 重組腺病毒種子。

三、重組腺病毒樣本的制備

接種HEK293 至培養(yǎng)瓶中，用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2）， 待細(xì)胞匯合度達(dá)到 90%以上時接種Ad5-CD137L 進(jìn)行病毒擴(kuò)增， 收集細(xì)胞病變后上清， 用相對分子質(zhì)量為300 000 的膜胞進(jìn)行切向流超濾濃縮，再通過SOURCE 30Q 陰離子交換層析和Sepharose 4FF 凝膠排阻層析進(jìn)行純化，所得病毒純化液即為所需的重組病毒樣本。

四、重組腺病毒的檢測

1. 病毒滴度測定

接種HEK293 至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時， 取病毒液按10-1~10-10進(jìn)行梯度稀釋， 取10-3～10-10稀釋度的病毒液分別接種至細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)5 d 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)各稀釋度病毒液的細(xì)胞病變情況， 計算出病毒的感染性滴度（IU）[9]。

2. 插入目的基因的鑒定

取病毒樣本經(jīng)沸水浴孵育裂解10 min 后，所得裂解產(chǎn)物以CD137L-F：GCAGAGCTGGTTTAGTGAA CCGTCA 和 CD137L-R：GGACAACCACAACTAGAA TGCAG 為引物對，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性 10 s，68 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，29 個循環(huán)，72 ℃延伸 5 min。 反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，所得PCR產(chǎn)物同時送擎科生物進(jìn)行測序。

3. 目的蛋白表達(dá)的Western 印跡鑒定

取108IU 重組腺病毒Ad5-CD137L 接種至匯合度達(dá)到 90%以上 HEK293 單層細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h， 同時以空的腺病毒載體為對照。 收集感染細(xì)胞，沸水浴裂解后，行SDS-PAGE 膠電泳并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。 經(jīng)脫脂奶粉封閉后，加 CD137L(C-20)單克隆抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，洗膜 3 遍后，加兔抗羊 HRP 酶標(biāo)抗體（1∶2 000）室溫孵育30 min 后，經(jīng)ECL 增強(qiáng)后曝光顯色。

4. 目的蛋白表達(dá)的免疫熒光法鑒定

分取106和108IU 的重組腺病毒Ad5-CD137L接種至匯合度達(dá)到90%以上的HEK293 單層細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 48 h，同時以空腺病毒載體為對照；用胰酶消化細(xì)胞，1 500 轉(zhuǎn)/min(離心半徑為3 cm) 離心5 min 棄上清， 將細(xì)胞滴在載玻片上，用封閉液作用10 min 后晾干；加CD137L(C-20)單克隆抗體（1∶100）4℃孵育過夜；洗滌 3 遍后加兔抗羊-FITC （1∶200）37 ℃孵育 1 h， 洗滌 3 遍后加95%甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

五、重組腺病毒的抗腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)

1. 小鼠特異性細(xì)胞免疫檢測

將重組腺病毒 Ad5-CD137L 免疫 6 ～8 周齡C57BL/6 小鼠，同時以空腺病毒為對照，并以未接種的小鼠作為空白組，每組3 只小鼠，按108IU /只劑量接種；在初次免疫第14 天處死小鼠，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，按每孔5×105個細(xì)胞量，接種至預(yù)包被IFN-γ 抗體的酶聯(lián)細(xì)胞免疫檢測板中， 每個樣本都作復(fù)孔。用CD137L 的重疊多肽庫作為刺激物，按照Elispot 試劑盒說明書操作檢測。 結(jié)果取兩復(fù)孔的平均值作為免疫小鼠的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)。

2. 小鼠TC-1 腫瘤模型的抑制試驗(yàn)

培養(yǎng)TC-1 腫瘤細(xì)胞，按2×104個的細(xì)胞量將細(xì)胞接種于每只C57BL/6 小鼠左腿皮下， 獲得小鼠TC-1 腫瘤模型。 在腫瘤模型建立的24 h 后，重組腺病毒Ad5-CD137L 組和空腺病毒載體組按每只小鼠108IU 的劑量接種于小鼠大腿右側(cè)肌肉，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)10 只腫瘤模型小鼠，同時設(shè)立對照組。觀察對各個小鼠的腫瘤生長情況并進(jìn)行腫瘤大小檢測，根據(jù)腫瘤半徑（r）和長度（L）計算瘤塊體積

六、統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.01 進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)。 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、重組腺病毒Ad5-CD137L 的構(gòu)建

密碼子優(yōu)化后的CD137L 蛋白表達(dá)基因， 通過MluⅠ和HindⅢ兩個酶切位點(diǎn)插入pDC316 質(zhì)粒，獲得重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CD137L（圖1）。 所得重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CD137L 和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1,3Cre 用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 共同轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染后7~10 d 顯微鏡下觀察：HEK293 細(xì)胞形態(tài)由貼壁的梭形、多角形，胞漿透亮，逐漸改變?yōu)榧?xì)胞圓縮，胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)明顯的病毒噬斑，隨著時間的推移最后細(xì)胞完全脫落（圖2）。

圖1 pDC316-CD137L 重組穿梭質(zhì)粒圖

圖2 重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病變圖（×100）

二、重組腺病毒的檢測結(jié)果

1. 插入目的基因的鑒定

利用特異性引物對病毒樣本基因組進(jìn)行PCR檢測， 所得PCR 產(chǎn)物在約1 000 bp 處有一特異性條帶（見圖3），條帶大小與理論相符，且所得PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果也與理論一致。

圖3 重組腺病毒插入目的基因PCR 電泳圖

2. 目的蛋白表達(dá)的免疫印跡鑒定

圖 4 所示, 感染 Ad5-CD137L 重組腺病毒的HEK293 細(xì)胞在相對分子質(zhì)量約25 000 處有一條特異的免疫印跡條帶， 而感染空腺病毒的HEK293細(xì)胞則未見特異性條帶。

圖4 免疫印跡法鑒定重組腺病毒目的蛋白表達(dá)的結(jié)果

3. 重組腺病毒Ad5-CD137L 蛋白表達(dá)的免疫熒光鑒定

如圖5 所示，Ad5-CD137L 感染后細(xì)胞與特異性抗體結(jié)合后通過熒光標(biāo)記二抗的捕獲，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光細(xì)胞，而Ad5 空病毒未觀察到熒光細(xì)胞。

圖5 免疫熒光法鑒定重組腺病毒目的蛋白表達(dá)的結(jié)果（×100）

三、 重組腺病毒Ad5-CD137L 誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)特異性細(xì)胞免疫作用

空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)為（4±4）SFC/5×105cells；空腺病毒免疫組為（10±5）SFC/5×105cells，與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （t=1.707，P=0.163）；Ad5-CD137L 重組腺病毒組為（288±76）SFC/5×105cells，顯著高于空腺病毒組（t=6.315，P=0.003）。

四、 重組腺病毒Ad5-CD137L 在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫效果

腫瘤模型建立后小鼠TC-1 腫瘤均處于生長初期，在第 14、21、29 和 39 天觀察腫瘤生長狀況并測量大小，結(jié)果顯示在不同的觀察時間空腺病毒組與空白組間腫瘤大小的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義 (t14d=0.504, t21d=0.755, t29d=2.018, t39d=1.884，P 均>0.05）。

腫瘤模型建立第14 天時，Ad5-CD137L 重組腺病毒組的腫瘤體積小于空白組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t14d=2.908，P=0.012）; 第 21、29 和 39 天時，Ad5-CD137L 重組腺病毒組相比空腺病毒組、空白組的腫瘤體積均縮小，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t21d=8.275、7.798；t29d=4.492、7.113；t39d=5.101、10.540；P 均<0.001）。 具體結(jié)果見圖 6。

圖6 重組腺病毒Ad5-CD137L 抑制TC-1 小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的CD137L/CD137 異常表達(dá)已在很多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等惡性腫瘤[10-12]。目前，已有一些CD137 抗體藥物被批準(zhǔn)開展用于惡性腫瘤免疫治療的臨床試驗(yàn)，并且展現(xiàn)出一定的抗腫瘤治療效果[13-14]。 因此推測，基于表達(dá)CD137L 的重組腺病毒作為腫瘤免疫治療的策略具有一定的可行性。

由于在臨床應(yīng)用中已表現(xiàn)出良好的安全性[15-16]，本文選擇非復(fù)制型的5 型腺病毒作為載體。 本研究構(gòu)建的表達(dá)CD137L 的重組5 型腺病毒載體， 在免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生顯著的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時在抗腫瘤免疫效果試驗(yàn)中，Ad5-CD137L 重組腺病毒組腫瘤大小明顯縮小， 表明Ad5-CD137L 重組腺病毒能在一定程度上抑制了TC-1 腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖，展現(xiàn)了出較好抗腫瘤免疫效果。 Zhang等[17]構(gòu)建了一個共表達(dá)PD-1 和CD137L 的重組腺病毒，該重組腺病毒也能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，且具有抑制體內(nèi)肝癌細(xì)胞增殖的效果，與本研究的結(jié)果具有相似的效果。

綜上所述， 以CD137L/CD137 為靶抗原開展藥物研究，通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫治療有著一定的臨床應(yīng)用潛力。應(yīng)用生物技術(shù)，將CD137L 通過病毒載體在體內(nèi)表達(dá)或CD137L cDNA 定向轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞并高效表達(dá)，進(jìn)而與T 細(xì)胞表面CD137 結(jié)合，共刺激T細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾腫瘤細(xì)胞的策略在抗腫瘤免疫治療及疫苗制備中具有廣闊應(yīng)用前景[18-20]。后續(xù)，我們將開展進(jìn)一步的研究，包括免疫劑量效應(yīng)、免疫細(xì)胞的分化情況、不同腫瘤模型的適應(yīng)性以及高等級非人靈長類動物實(shí)驗(yàn)等，從而進(jìn)一步驗(yàn)證臨床前研究的可行性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明吳潔：整理資料、論文撰寫；張柯欣、安彤、李思奇：收集資料；朱赟、陳剛：處理數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計；莊昉成、高孟：設(shè)計、指導(dǎo)、修改稿件